大鼠野生型TRAF6基因和TRAF6 shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)基因及其特异性短发卡状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察其在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达和沉默TRAF6基因的情况?方法:用DNA重组技术将针对大鼠TRAF6基因的CDS区序列(加HA标签)和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGenesil-1/GFP真核表达质粒中?在酶切鉴定及序列测定正确后,用NeonTM电转仪,将上述质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查HA-TRAF6融合蛋白的表达情况,同时筛选最有效的TRAF6 shRNA?结果:限制性酶切及核酸序列分析确证,上述TRAF6基因过表达和shRNA表达质粒均构建成功?Western blot显示,构建的pcDNA3.1-HA-TRAF6质粒能在大鼠GMC中表达,且TRAF6 shRNA-1具有最佳的沉默效率?结论:本实验成功构建了大鼠野生型TRAF6真核表达质粒及其特异性的shRNA表达载体,这为今后进一步研究TRAF6基因的生物学功能提供了实验基础?     

NF⁃κB p65调控IRF⁃8基因启动子活性及其启动子结合元件的初步鉴定

目的：探讨大鼠核因子?κB（nuclear factor?κB,NF?κB）p65亚基在细胞内过表达和其活性变化对干扰素调节因子?8（interferon regulatory factor?8,IRF?8）基因启动的影响,并初步筛查IRF?8启动子上可能的p65结合元件。方法：采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术扩增大鼠p65基因蛋白编码区（complete sequence coding,CDS）序列,将其插入到空载pIRES2?EGFP质粒中,构建大鼠野生型（wild type,WT）p65过表达质粒（pIRES2?p65 WT）。在此基础上,将p65第535位丝氨酸（serine,S）突变为天冬氨酸（aspartic,D）或丙氨酸（alanine,A）,分别构建p65持续活化突变型质粒（pIRES2?p65 S535D）和p65显性负性突变型质粒（pIRES2?p65 S535A）。之后应用生物信息学软件预测IRF?8基因启动子区p65的结合元件,并据此构建IRF?8启动子全长（full?length,FL）和3个截短的荧光素酶报告质粒,即pGL3?IRF?8?FL（-1 892 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?1（-1 360 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?2（-752 ~ +174 nt）和pGL3?IRF?8?3（-68 ~ +174 nt）。将上述质粒行不同组合共转染人胚肾293T（human embryonic kidney 293T,HEK?293T）细胞,Western blot和荧光素酶实验分别检查p65的表达和IRF?8的启动子活性,并分析IRF?8启动子区可能的p65结合元件。结果：菌液PCR及测序证实上述质粒构建成功。分别将pIRES2?p65 WT、pIRES2?p65 S535D、pIRES2?p65 S535A和pGL3?IRF?8?FL共转染HEK?293T,发现过表达pIRES2?p65 WT或pIRES2?p65 S535D均可明显增加IRF?8启动子活性,且以pIRES2?p65 S535D更为显著;而过表达pIRES2?p65 S535A后,IRF?8启动子活性无明显变化。将pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1~3和pIRES2?p65 S535D共转染HEK?293T后发现,pGL3?IRF?8?3的启动子活性显著低于pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1和pGL3?IRF?8?2,提示大鼠IRF?8启动子-752~68 nt区域可能存在p65结合元件。结论：在HEK?293T细胞内过表达野生型或持续活化突变型p65可显著促进IRF?8基因的启动,且p65与IRF?8启动子的结合元件可能位于-752~-68 nt部位。     

凝血检测中护理人员操作的重要性分析

[目的]探讨凝血分析时护理操作的重要性。[方法]2013年3月—2015年8月采集病人血液检测凝血项目,检验科反馈发现活化部分凝血活酶时间(APTT)结果异常(60s)的不合格血样38例,对其进行原因分析,并按样本采集手册重新采血后送检,分析两次结果的差异。[结果]13例为从其他采血管倒入枸橼酸钠抗凝管,15例为穿刺不顺利,3例的原因为从三通管取血,未充分混匀血样及采血后送检时间过长各占1例,另外,有5例经重采血后结果未发生改变。[结论]凝血检测中护理人员的操作非常重要,一定要严格按照样本采集手册的要求进行采样,降低不合格样品的发生率。     

使用EDTA抗凝血检测凝血酶原时间

目的 比较病人用EDTA抗凝血和枸橼酸钠抗凝血检测PT、INR结果的差异。方法120位受试对象用枸橼酸钠和EDTA抗凝各采两管血,分离血浆后在STAGO仪器上检测胛,对两种抗凝方式所得PT、INR结果进行线性回归分析,分析其相关性及其结果间有无显著性差异。结果以枸橼酸钠法测得PT为Y,EDTA法测得PT为x,两者间PT线性方程为Y=0．86x-2．8,R^2=0．97,PT结果相关性好,但差异有显著性。INR线性方程为Y=0．95x＋0．03,R^2=0．98,相关性好且差异无显著性。讨论EDTA抗凝血浆检测胛在临床上是可接受的,但前提条件是应建立自己的参考区间,报告INR结果时还应统计EDTA抗凝血的MNPT（正常人平均Pr）,根据公式INR=（PT／MNPT）^ISI计算INR值。     

POCT法和常规检测法在BNP检测中的对比分析

目的：比较即时检验（POCT ）法和常规检测法在B型钠脲肽（BNP）检测中的相关性。方法运用 Alere Triage？MeterPro（美国）荧光免疫分析仪或Beckman Coulter Access？2化学发光仪分别检测40份住院患者全血或血浆样本中BNP含量,按照CLCS EP9-A2文件要求进行对比分析。结果 POCT法和常规检测法检测住院患者血样BNP含量的线性回归良好,相关系数（r）＝0．9997。结论 POCT法和常规检测法在BNP检测中的相关性良好,POCT 法具有较高的可靠性,可以用于临床检测。     

血小板活化的研究进展

血小板活化发生在各种缺血性心脑血管疾病如脑梗死、高血压、急性冠脉综合征等,有血栓形成倾向的疾病如弥散性血管内凝血(DIC),急性早幼粒细胞白血病,阵发性睡眠性血红蛋白尿症,急性肺栓塞,膜性增生性肾小球肾炎,房室瓣或主动     

不同血细胞分析仪结果比较

当前，国内大中型医院和教学医院检验科普遍存在同一实验室同时拥有两台以上相同或不同生产厂商的血细胞分析仪。由此带来的问题是同一患者在诊治过程中的血标本可能在不同的分析仪上检测相同的全血细胞计数（CBC），这将导致结果间的差异，有时差异会远远大于可接受的误差范围。为避免这一问题和根据医学实验室认可的要求，现对我科现有的主要两台血细胞分析仪（COULTER GEN．S和SYSMEX 2000i血细胞分析仪）进行了测定结果的比对，以明确两台血细胞分析仪测定结果是否一致。     

阴道分泌物对女性尿液干化学白细胞酯酶测定的影响

目的 探讨阴道分泌物对女性尿液干化学白细胞酯酶测定的影响。方法 收集正常阴道分泌物Ⅰ,Ⅱ度标本21份和30份,并测定其中的白细胞酯酶和鳞状上皮细胞; 再收集正常阴道分泌物标本,从中分离出鳞状上皮细胞,并配制成20个/μl和60个/μl两个浓度的鳞状上皮细胞混悬液。将其加入正常女性尿液后进行干化学白细胞酯酶测定; 对于干化学白细胞酯酶测定强阳性而尿沉渣白细胞计数正常的患者做外阴清洗后再取中段尿做尿常规检验。结果 正常阴道分泌物中有66.7%的白细胞酯酶结果呈阳性,且均有～的鳞状上皮细胞(镜检); 正常尿液组和加入低浓度(20个/μl)及高浓度(60个/μl)鳞状上皮细胞尿液组的尿液干化学白细胞酯酶测定差异无统计学意义(P>0.05); 再次中段尿的鳞状上皮细胞和白细胞干化学阳性率及强度较第一次尿明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),而白细胞计数无明显区别,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 阴道鳞状上皮细胞不会对尿液干化学白细胞酯酶的测定产生影响。但女性自身阴道分泌物中的白细胞酯酶对其尿液中的白细胞酯酶的测定有很大影响。     

人孕酮受体膜组分1表达载体的构建及其重组蛋白对体外血管形成的诱导作用

目的: 构建含人孕酮受体膜组分（progesterone receptor membrane component,PGRMC）1的重组表达质粒,转染人卵巢癌细胞,研究其调控卵巢癌细胞血管生成的作用。方法: 以卵巢癌细胞为模板,采用PCR技术扩增PGRMC1基因编码序列,插入真核载体pSecTag-2B构建重组表达载体;然后,将重组载体pST PGRMC1分别转染人胚肾上皮细胞HEK293T和卵巢癌细胞SKOV-3,采用蛋白质印迹法检测PGRMC1蛋白的表达;实时荧光定量PCR检测卵巢癌细胞中VEGF mRNA的变化,用ELISA法检测上清液中VEGF的分泌情况。体外血管生成实验进一步观察PGRMC1促进体外血管生成的情况。结果： 重组表达载体pST PGRMC1构建成功,重组蛋白PGRMC1在HEK293T和SKOV-3细胞中都能够表达;PGRMC1过表达可促使卵巢癌细胞合成VEGF,并且促进体外血管的形成。结论： 重组蛋白PGRMC1在促进卵巢癌细胞体外血管形成中起着重要作用,可能促进卵巢癌细胞的远处转移。