GCN5调控sublytic C5b⁃9诱导大鼠肾小球系膜细胞表达Cyclin D1及致SOX9的乙酰化修饰

目的：探讨GCN5调控sublytic C5b?9刺激大鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell,GMC）诱导Cyclin D1基因表达以及GCN5乙酰化修饰SOX9转录因子的作用。方法：先用Western blot检测Thy?1肾炎（Thy?1 nephritis,Thy?1N）大鼠的肾组织和sublytic C5b?9 刺激的GMC中GCN5、SOX9和Cyclin D1的表达。然后分别将pIRES2?GCN5过表达和shGCN5小干扰质粒或将这些质粒与Cyclin D1启动子质粒行不同组合转染GMC,用荧光素酶报告基因实验和real?time PCR、Western blot检测过表达或沉默GCN5后对Cyclin D1表达的影响。同时用免疫共沉淀（Co?IP）和Western blot检测sublytic C5b?9刺激或分别转染GCN5过表达和酶活性突变质粒（ΔGCN5）的GMC中SOX9的乙酰化修饰。结果：Thy?1N大鼠肾组织和sublytic C5b?9刺激的GMC中GCN5、SOX9、Cyclin D1蛋白水平均明显上调,而过表达GCN5基因能上调Cyclin D1的启动子活性、mRNA和蛋白表达;敲低GCN5表达则得到了相反的结果。此外,sublytic C5b?9刺激和过表达GCN5基因促进了SOX9的乙酰化修饰,而沉默GCN5后则降低了SOX9的乙酰化水平。结论：GCN5可上调GMC中Cyclin D1的表达,并促进SOX9的乙酰化修饰。     

NF⁃κB p65调控IRF⁃8基因启动子活性及其启动子结合元件的初步鉴定

目的：探讨大鼠核因子?κB（nuclear factor?κB,NF?κB）p65亚基在细胞内过表达和其活性变化对干扰素调节因子?8（interferon regulatory factor?8,IRF?8）基因启动的影响,并初步筛查IRF?8启动子上可能的p65结合元件。方法：采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术扩增大鼠p65基因蛋白编码区（complete sequence coding,CDS）序列,将其插入到空载pIRES2?EGFP质粒中,构建大鼠野生型（wild type,WT）p65过表达质粒（pIRES2?p65 WT）。在此基础上,将p65第535位丝氨酸（serine,S）突变为天冬氨酸（aspartic,D）或丙氨酸（alanine,A）,分别构建p65持续活化突变型质粒（pIRES2?p65 S535D）和p65显性负性突变型质粒（pIRES2?p65 S535A）。之后应用生物信息学软件预测IRF?8基因启动子区p65的结合元件,并据此构建IRF?8启动子全长（full?length,FL）和3个截短的荧光素酶报告质粒,即pGL3?IRF?8?FL（-1 892 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?1（-1 360 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?2（-752 ~ +174 nt）和pGL3?IRF?8?3（-68 ~ +174 nt）。将上述质粒行不同组合共转染人胚肾293T（human embryonic kidney 293T,HEK?293T）细胞,Western blot和荧光素酶实验分别检查p65的表达和IRF?8的启动子活性,并分析IRF?8启动子区可能的p65结合元件。结果：菌液PCR及测序证实上述质粒构建成功。分别将pIRES2?p65 WT、pIRES2?p65 S535D、pIRES2?p65 S535A和pGL3?IRF?8?FL共转染HEK?293T,发现过表达pIRES2?p65 WT或pIRES2?p65 S535D均可明显增加IRF?8启动子活性,且以pIRES2?p65 S535D更为显著;而过表达pIRES2?p65 S535A后,IRF?8启动子活性无明显变化。将pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1~3和pIRES2?p65 S535D共转染HEK?293T后发现,pGL3?IRF?8?3的启动子活性显著低于pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1和pGL3?IRF?8?2,提示大鼠IRF?8启动子-752~68 nt区域可能存在p65结合元件。结论：在HEK?293T细胞内过表达野生型或持续活化突变型p65可显著促进IRF?8基因的启动,且p65与IRF?8启动子的结合元件可能位于-752~-68 nt部位。     

青藤碱对PKC⁃α/NF⁃κB⁃p65通路的抑制作用及机制

目的：探讨过表达蛋白激酶C?α（protein kinase C?α,PKC?α）对HEK?293T细胞中核因子?κB?p65（nuclear factor?κB?p65,NF?κB?p65）磷酸化水平的影响,并检查青藤碱（sinomenine,SIN）对PKC?α/NF?κB?p65信号通路的抑制作用。方法：采用PCR技术扩增大鼠PKC?α基因蛋白质编码区（complete sequence coding,CDS）序列,将其插入到pIRES2?EGFP空载质粒中,构建野生型（wide type,WT）PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?WT,PKC?αWT）;在PKC?αWT质粒的基础上,将PKC?α第25位丙氨酸（A）与368位赖氨酸（K）分别突变为谷氨酸（E）和精氨酸（R）,即构建持续活化（constitutively active,CA）突变型PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?A25E,PKC?αCA）和显性负性（dominant negative,DN）突变型PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?K368R,PKC?αDN）。本课题组前期构建的大鼠野生型NF?κB?p65过表达质粒（pIRES2?NF?κB?p65,p65WT）分别与上述各PKC?α过表达质粒共同转染HEK?293T细胞,免疫印迹法检测PKC?α、NF?κB?p65的表达及磷酸化水平。再将上述不同质粒转染HEK?293T细胞,46 h后予50 ng/mL SIN处理细胞2 h,再行免疫印迹实验分析SIN对PKC?α、NF?κB?p65磷酸化的影响。结果：菌液PCR及测序证实,上述PKC?α过表达质粒构建成功。在HEK?293T中过表达PKC?αWT或PKC?αCA可促进NF?κB?p65的磷酸化,且过表达PKC?αCA时尤为显著,而过表达PKC?αDN后NF?κB?p65的磷酸化无明显变化。SIN处理可抑制PKC?αWT、PKC?αCA和PKC?αDN转染组HEK?293T细胞中PKC?α的磷酸化,同时也能抑制过表达PKC?αWT上调的NF?κB?p65磷酸化修饰,但不影响过表达PKC?αCA和PKC?αDN对NF?κB?p65的磷酸化作用。结论：过表达PKC?α可促进HEK?293T细胞中NF?κB?p65的磷酸化,SIN处理HEK?293T细胞后可通过抑制PKC?α的磷酸化下调NF?κB?p65的磷酸化修饰。     

大鼠S100A8基因启动子质粒的构建及其SOX7结合元件的初步鉴定

目的：构建大鼠S100钙结合蛋白A8（S100A8）基因启动子荧光素酶报告质粒,并在HEK?293T中检查过表达性别决定区Y框蛋白7（SOX7）基因对S100A8启动子活性的影响,同时筛选可能的SOX7结合元件。方法：采用PCR技术扩增大鼠S100A8启动子全长,经双酶切后连接到pGL3?basic中,命名为pGL3?S100A8?FL。将pGL3?S100A8?FL与前期构建的pIRES2?SOX7质粒共转染HEK?293T,再测定荧光素酶活性。此外,运用JASPAR预测S100A8启动子区可能包含的SOX7结合元件,并依此构建4个启动子截短质粒（即pGL3?S100A8?1~4）。将pGL3?S100A8?FL和pGL3?S100A8?1~4分别与pIRES2?SOX7共转染HEK?293T,检查荧光素酶活性。接着构建SOX7结合元件突变的S100A8启动子质粒（即pGL3?S100A8?M）,与pIRES2?SOX7转染HEK?293T,检测其荧光素酶活性。结果：将pGL3?S100A8?FL与pIRES2?SOX7共转染HEK?293T,发现过表达SOX7可显著增加pGL3?S100A8?FL启动子活性。将pGL3?S100A8?FL和pGL3?S100A8?1~4分别与pIRES2?SOX7共转染HEK?293T,发现pGL3?S100A8?4启动子活性显著低于pGL3?S100A8?FL和pGL3?S100A8?1~3,提示SOX7与S100A8启动子结合元件可能位于-200~+51 nt区域内。将-86~-57 nt元件突变质粒（pGL3?S100A8?M）或pGL3?S100A8?FL与pIRES2?SOX7共转HEK?293T,发现pGL3?S100A8?M启动子活性显著低于pGL3?S100A8?FL。提示SOX7可能与S100A8启动子-86~-57 nt元件结合。结论：成功构建大鼠S100A8基因启动子全长、截短和突变荧光素酶报告质粒,并初步确定S100A8启动子区的SOX7结合元件。