丙型肝炎病毒C区的DNA改组

目的：利用DNA改组技术进行不同基因型别丙型肝炎病毒（HCV）基因组C区的人工进化。方法：首先利用PCR扩增了三段具有较高序列同源性的460bp基因片段，然后将其等量混合，在Mg^2＋存在的条件下，用脱氧核糖核酸酶（DNase Ⅰ）切割成50bp左右的小片段。这些小片段在不外加引物的条件下，利用PCR反应进行重聚，再将重聚物经过一轮正常的PCR扩增。结果：获得了与原片段大小相当的基因片段。结论：这一技术为进一步筛选高活性的HCVC区基因打下基础，有利于从一组序列同源性程度较高的基因库构建随机嵌合基因，并为改组其他基因家族提供了借鉴。     

双位点核酶对2.2.15细胞中HBV基因表达抑制作用

目的:观察针对HBVC区双位点核酶在细胞内阻断C区基因表达的作用。方法:采用亚克隆技术,从pGEM-Rz123(含针对HBVC区双位点核酶)上切下双位点核酶的片段,定向克隆于真核表达载体pBBS212中。利用lipofectamine介导,将重组质粒pBBS212-Rz及pBBS212转染2.2.15细胞中,采用打点杂交技术观察核酶的表达,采用ELISA、免疫荧光、免疫组化、图象分析法、Westernblot分析HBe/HBcAg及HBsAg的表达。结果:转染的2.2.15细胞经潮霉素B和G418筛选2周后,打点杂交证实可表达针对HBVC区双位点核酶。ELISA方法检测发现核酶抑制HBeAg表达48.6%,用免疫荧光、免疫组化、图象分析法、Westernblot分析证实核酶可抑制HBV细胞内表达。结论:该双位点核酶通过针对HBVC区基因的剪切作用,阻断C区基因表达,抑制了HBe/HBcAg的表达。     

抗丙型肝炎病毒锤头结构核酶的计算机设计和载体的构建

目的选择针对丙型肝炎病毒（HCV）5'非编码区（NCR）和核心区（C）的核酶（ribozyme,Rz）切割位点,构建带自剪切的Rz真核表达载体。方法应用计算机辅助设计,根据能量最低化原理,以HCV－H（1a）株SNCR和C靶序列,预测其二级结构,选择理想的Rz切割位点,设计锤头结构核酶;体外合成针对HCV5'NCR的Rz213和Rz260的cDNA,通过亚克隆技术连接于真核表达载体（pcDNA3）。结果在124个自然切割位点（CUX和GUX）中选出213（CUC）、260（GUA）、407（GUC）和498（CUU）4个切点;Rz213和Rz260的DNA序列分析,结果与合成序列完全一致,酶切鉴定两Rz连接正确。结论计算机可作为抗病毒Rz设计的重要辅助工具;通过亚克隆技术可使目的Rz两端带自剪切Rz,并成功地插入真核表达载体。     

核酶对人HCC细胞内HBeAg的抑制作用

目的观察针对ＨＢＶＣ区双位点核酶对ＨＢｅＡｇ在细胞内表达的抑制作用．方法利用亚克隆技术,从质粒ｐＧＥＭＲｚ１２３切下ＥｃｏＲⅠＢａｍＨⅠ片段,双粘端克隆于真核表达质粒ｐＢＢＳ２１２中,将该质粒与ｐ１．２Ⅱ（含ＨＢＶ全序列）,共转染人ＨＣＣ细胞（人肝癌细胞株）,观察该核酶在细胞内对ＨＢｅＡｇ合成的抑制作用．结果在人ＨＣＣ细胞中ｐ１．２Ⅱ可表达出ＨＢｅＡｇ;该核酶对ＨＢｅＡｇ的合成抑制率达６５％．结论该双位点核酶可能通过针对ＨＢＶＣ区基因的剪切作用,阻断Ｃ区基因的表达,抑制了ＨＢｅＡｇ的合成     

乙型肝炎病毒DNA定量检测及意义

目的　检测血清中乙型肝炎病毒 DNA拷贝数 ,并了解 HBV感染的不同血清学指标组合相应的 HBV- DNA含量分布 ,以指导临床 .方法　采用 Ampli Sensor PCR定量方法 ,检测 2 0 8份不同临床类型血清标本的 HBV- DNA含量 ,再用EL ISA方法测定 HBV- M,统计不同免疫指标组合的 HBV-DNA平均含量 .结果　病毒量分为高、中、低三度 ,大于 10 7拷贝· m L- 1 为高滴度 ;10 7～ 10 5 拷贝· m L- 1 为中等滴度 ;10 5拷贝· m L- 1 以下为低滴度 .6 0例 HBs Ag(+) HBe Ag(+)HBc Ab(+)血清 ,HBV- DNA全部阳性 ,平均含量为 1.8× 10 8拷贝· m L- 1 ;48例 HBs Ag(+) HBe Ab(+) HBc Ab(+)血清 ,HBV- DNA平均含量为 6 .4× 10 6 拷贝· m L- 1 ;30例 HB-s Ag(+) HBc Ab(+)血清 ,HBV- DNA平均含量为 8.5× 10 5拷贝· m L- 1 ;13例 HBs Ab(+) HBe Ab (+) HBc Ab(+)血清 ,HBV- DNA平均含量为 2 .1× 10 5拷贝· m L- 1 .结论　定量 PCR可真实反应 HBV感染、复制及病程变化 ,对乙型肝炎临床诊断及治疗均有较大的指导意义     

两种HCV不同结构基因重组质粒DNA诱导免疫应答的比较研究

目的　探讨丙型肝炎病毒 (HCV)包膜基因 E1E2 ,对核心基因 C DNA疫苗诱生的免疫应答有无增强作用 .方法　构建包含HCV C或 CE1E2基因片段的真核表达载体 p HCV- C和 p HCV- CE1E2 ,分别接种于 BAL B/c小鼠股四头肌 (以空载体 pc DNA3作为对照 ) ,每间隔 2 wk加强免疫 1次 .用 EL ISA法检测免疫小鼠血清中抗 HCV C特异性抗体的产生 .以 p HCV- C转染并表达 HCc Ag的 Sp2 /0细胞为靶细胞 ,采用 5 1 Cr释放试验检测特异性 CTL的杀伤作用 .结果　两个实验组免疫的 2 0只小鼠均产生抗 HCV C特异性抗体 ,当效 /靶细胞比例为 10 0∶ 1时 ,CTL 的杀伤率均明显高于对照组 (P<0 .0 1) ;而 p HCV- CE1E2与 p HCV-C组之间 ,无论是抗 HCV C抗体的滴度还是 CTL的杀伤率均无显著性差异 (P>0 .0 5 ) .结论　 E1E2基因的加入 ,并没有增加HCV C基因 DNA疫苗诱导的抗 HCc Ag特异性抗体的滴度和 CTL 的杀伤作用 .     

HBsAgDNA疫苗诱导小鼠特异性细胞和体液免疫

目的：观察乙型肝炎病毒（HBV）S区DNA疫苗pCR3．1－S诱导BALB／C小鼠（H-2^d)的特异性免疫应答,及其对稳定表达HBsAg的小鼠肥大细胞瘤细胞P815（P815－HBV-S)成瘤性的影响。方法：肌肉注射DNA疫苗;背部皮下接种P815－HBV－S细胞,观察成瘤情况;ELISA法检测小鼠血清抗HBs;4h^41Cr释放法检测小鼠脾细胞CTL活性。结果：pCR3．1－S 外可表达HBsAg;小鼠接肿该疫苗后血清450nmA值为0．38,强化免疫后达0．87;pCR3．1－S组CTL细胞杀伤活性为51．1％,对照组为20．5％（P＜0．01）。接种P815－HBV－S细胞后对照组成瘤率100％,pCR3．1－S小鼠成瘤率为16．7％,对照组小鼠6周后全部死亡;pCR3．1－S组6周后存活率为87．5％。结论：HBVS区DNA疫苗具有良好的免疫原性,能够诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答,对体内HBV感染具有预防及治疗作用。     

双位点核酶细胞内抑制乙型肝炎病毒基因的表达

目的：构建针对乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｃ区基因（２０２９－３１及２０６３－６５位点）的双位点核酶的真核表达载体,观察其在细胞内对ＨＢＶ基因表达抑制作用。方法：利用亚克隆从质粒ｐＧＥＭＲｚ１２３切下ＥｃｏＲ－ＢａｍＨＩ片段,双粘端克隆于真核质粒ｐＢＢＳ２１２中,将该质粒与ｐ１．２Ⅱ（含ＨＢＶ全序列）共转染ＨＨＣＣ细胞（人肝癌细胞株）。观察该核酶对ＨＢＶ基因表达的抑制作用。结果：在ＨＨＣＣ细胞中Ｐ１．２     

坚持三个确保 全面服务部队谋打赢

本文结合医院为部队服务实际,总结医院充分发挥军医大学附属医院人才技术优势,坚持以市场练兵确保战场打赢,坚持以平时造血确保战时输血,坚持以国际竞争中领先确保与强敌过招中取胜,全心全意为部队服务的做法和经验。     

白细胞介素-12对DNA疫苗治疗小鼠丙型肝炎病毒的增强作用

目的