DNA改组及其在疫苗研制中的应用

DNA改组 (DNAshuffling)是上世纪 90年代中期发展起来的一种全新的分子水平上的人工定向进化技术。它模拟自然界进化的机制 ,改变了传统的进化途径 ,通过体外重组来改造靶基因 ,并定向筛选具有预期性状的突变体 ,从而大大加速了蛋白质的进化进程。该技术自建立以来 ,已在生物工程各领域得到了越来越广泛的应用。本文总结了DNA改组的基本原理、技术路线、特点、改进与发展 ,并综述了其在疫苗研制方面的研究进展。     

Her2/ECD-sf162/TM融合杆状病毒表达及鉴定

目的:获得融合表达的Her2/ECD-sf162/TM杆状病毒,为后续基于SIV Gag蛋白的Her2病毒样颗粒疫苗的制备奠定实验基础。方法:将Her2胞外段基因与猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus,SIV）包膜蛋白sf162跨膜区基因融合的Her2/ECD-sf162/TM pFastBac重组表达载体,转座大肠杆菌E.coli DH10Bac菌株,获得重组杆粒,在昆虫细胞中表达获得重组杆状病毒,Western blot方法对该病毒进行鉴定。结果:构建的Her2/ECD-sf162/TM杆状病毒表达载体经PCR鉴定正确,转染昆虫细胞后获得了重组杆状病毒,该融合杆状病毒蛋白可与抗Her2抗体发生免疫反应。结论:成功构建的Her2/ECD-sf162/TM杆状病毒可用于Her2病毒样颗粒疫苗的制备。     

两种HCV不同结构基因重组质粒DNA诱导免疫应答的比较研究

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）包膜基因E1E2,对核心基因CDNA疫苗诱生的免疫应答有无增强作用。方法：构建包含HCVC或CE1E2基因片段的真有达载体pHCV-C和pHCV-CE1E2,分别接种于Balb/c小鼠股四头肌（以空载体pcDNA3作为对照）,每间隔2wk l次,用ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HCVC特异性抗体的产生。以pHCV-C转染并表达HCcAg r S p2/0细胞为靶细胞,采用^51Cr翻译放试验检测特异性CTL的杀伤作用。结果,两个实验免疫的20只小鼠均产生抗HCV C特异性抗体,当前／靶细胞比例为100：1时,CTL的杀伤率均明显高于对照组（P＜0．01）;pHCV-CE1E2与pHCV-C组之间,无论是抗HCV C抗体的滴度还是CTL的杀伤率均无显著性差异（P＞0．05）。结论E1E2基因的加入,并没有增加HCV C基因DNA疫苗诱导的抗HCcAg特异性抗体的滴度和CTL的杀伤作用。     

抗血管内皮生长因子多位点核酶的合成及其体外切割作用

目的: 设计合成血管内皮生长因子多位点核酶,探讨其对靶RNA的切割作用.方法: 利用计算机辅助设计针对VEGF165的3个单位点核酶 (Rz1, Rz2, Rz3) 和联合型多位点核酶 (Rz123),构建其自剪切转录载体,观察多位点核酶对靶RNA的切割作用.结果: 构建的多位点核酶自剪切转录载体在体外转录中,顺式核酶发生了自身剪切,并释放出正确的目的核酶,多位点核酶可切割靶RNA,且效率高于单一核酶,其切割效率分别为 (37±10)% (Rz1), (51±8)% (Rz2 ), (68±15)% (Rz3) 和(88±11)% (Rz123).结论: 抗血管内皮生长因子多位点核酶体外可联合切割靶RNA,具有较高的生物活性.     

HIV-1辅受体配体的逆转录病毒载体的构建和表达

目的: 构建HIV-1辅受体的配体-趋化因子RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体,并观察在NIH3T3细胞的表达.方法: 从重组质粒pCMV-R-K-S-K中获取RANTES-KDEL-SDF-KDEL基因片段,构建RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体pLNCX-R-K-S-K,酶切鉴定并测序.采用标准的磷酸钙共沉淀法转染包装细胞Bing, G418筛选克隆细胞,制备重组病毒液,继之感染NIH3T3细胞,计算病毒滴度.间接免疫荧光检测NIH3T3细胞中RANTES、SDF-1的表达.结果: pLNCX-R-K-S-K逆转录病毒载体酶切和测序结果与预期一致,筛选出抗性克隆,制备了高滴度的重组病毒液,间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1可表达于转染细胞.结论: HIV-1辅受体的配体、趋化因子RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体构建成功,重组病毒可以感染NIH3T3细胞,为下一步HIV-1感染实验打下了基础.     

ICU患者MRSA定植与感染的危险因素研究

目的比较重症监护室(ICU)、呼吸内科监护室(RICU)和神经外科监护室(NSICU)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)定植与感染状况,探讨患者MRSA定植/感染的危险因素。方法采用前瞻性研究方法,连续收集2013年5月1日—7月31日入住某院3个ICU患者的临床资料,采集患者(医护人员)鼻拭子及其周围环境标本进行MRSA检测。结果 197例患者,检出MRSA22株,MRSA定植率为11.17%;ICU、RICU和NSICU定植率分别为4.00%、11.90%和15.87%,差别无统计学意义(χ2=4.04,P=0.133)。患者临床标本MRSA检出率为2.03%(4/197),医护人员MRSA鼻前庭定植率为1.72%(2/116)。MRSA定植患者周围环境中MRSA检出率为22.73%(5/22),高于非定植患者4.00%(7/175)(χ2=8.93,P=0.003)。多因素logistic回归分析结果显示,年龄≥60岁、侵入性操作、住ICU时间长和近期使用抗菌药物是MRSA定植/感染的独立危险因素。结论临床应主动对入住ICU的患者进行MRSA定植筛查,采取有效措施,防止MRSA在医院环境与患者间的双向传播;同时,尽量避免使用侵入性操作,减少患者住院日和合理使用抗菌药物,减少ICU患者MRSA定植与感染的发生。     

抗HBV核酶的研究进展

乙型肝炎病毒(HBV)是引起乙型肝炎的病原体，据统计全球HBV慢性携带者的总数超过2．8亿。我国是HBV感染的高发区。据血清流行病学调查HBsAg携带率达10％约1．5亿人。虽然传统的抗病毒药物及新一代的核苷类和干扰素有部分作用，但远期疗效均不显著。寻找新型抗乙型肝炎病毒药物成为迫切需要。     

核酶对细胞内HBeAg表达抑制作用的定量分析

目的定量观察双位点核酶对细胞内ＨＢＶ基因表达的抑制作用。方法构建针对ＨＢＶＣ区双位点核酶的真核表达载体（ｐＢＢＳ２１２－Ｒｚ）,将该质粒与ｐｌ．２Ⅱ（含ＨＢＶ全序列）,共转染人肝细胞癌（ＨＨＣＣ）细胞株,对转染细胞所表达ＨＢｅＡｇ进行间接免疫荧光染色,用共聚焦显微镜对其含量进行定量分析。结果共转染细胞可以表达ＨＢｅＡｇ,同对照组相比,核酶组荧光量明显下降。结论在核酶与ＨＢＶ共转染细胞中,核酶通过对ＨＢＶｍＲＮＡ的剪切作用,使ＨＢｅＡｇ的表达量明显受到抑制。     

小鼠HCV皮下移植瘤的建立及DNA 疫苗的治疗作用

目的　建立小鼠丙型肝炎病毒（HCV）皮下移植瘤，并以其为HCV感染动物模型，观察HCV核心(C)基因DNA疫苗（pcDNA-HCV-C）在体内对HCV感染的治疗作用。方法　将pcDNA-HCV-C用脂质体（LipofectAMINE）法转染BALB/c小鼠骨髓瘤Sp2/0（H-2