融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7的构建及其免疫学特性研究

目的 构建融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7,并评价其体外实验和动物模型上的免疫学特性,尤其是抗病毒致病基因的特异性细胞免疫反应.方法 分别构建DNA重组体pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7,pcDNA3.1-CRT180,pcDNA3.1-HPV6E7.将pcDNA3.1-HPV6E7质粒经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性细胞集落,荧光显微镜观察和RT-PCR鉴定表达HPV6E7的阳性细胞株.将质粒DNA肌注免疫C57BL/6小鼠,3次后取全血经流式细胞仪检测T细胞亚群的变化,LDH法检测小鼠的脾细胞和淋巴细胞与靶细胞B16/HPV6E7孵育后的CTL活性以及ELISA法检测共孵育上清中IL-2和IFN-γ浓度的变化.结果 各组质粒经鉴定表明构建正确.转染后细胞株稳定表达HPV6E7.DNA疫苗免疫小鼠后,pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7免疫组较pcDNA3.1-HPV6E7免疫组的外周血CD8 T细胞和TCRγδT细胞的比例显著增加,脾细胞和淋巴细胞针对靶细胞B16/HPV6E7的CTL杀伤活性更明显,分泌IL-2和IFN-γ的水平升高(P＜0.05).结论 CRT180与HPV致病基因6E7相连的重组质粒疫苗pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7能引发小鼠T细胞亚群CD8 分化并诱导出显著的特异性CTL反应.推测CRT180/HPV6E7 DNA疫苗在动物模型上可以有效激活抗HPV特异性细胞免疫,有利于病毒感染的清除.     

嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究

目的 构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1.-pilE.经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物.将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性.结果 扩增出了429 bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白.pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P＜0.01).结论 成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

人β防御素-2联合HPV16E7c免疫小鼠的免疫学效应实验研究

目的 探讨以人β防御素-2为佐剂的HPV16 E7c免疫功能及细胞免疫应答.方法 将30只小鼠按随机数字表法分为3组:PBS组、pcDNA3.1(+)/E7c组、pEGFP-C1/HBD2-E7c组,每组10只.PBS组采用PBS 100 μg·只-1 行股四头肌肌内注射,进行初次免疫;pcDNA3.1(+)/E7c组采用pcDNA3.1(+)/E7c质粒100 μg·只-1 行股四头肌肌内注射,进行初次免疫;pEGFP-C1/HBD2-E7c组采用pEGFP-C1/HBD2-E7c联合质粒100 μg·只-1行股四头肌肌内注射,进行初次免疫.3组初次免疫后,再间隔2周,以上述方法和剂量加强免疫2次.共免疫3次.3组小鼠免疫1周后,断颈处死小鼠,取小鼠脾脏称重,计算脾脏脏器指数及计数脾淋巴细胞数量,流式细胞仪检测淋巴细胞亚群CD4+、CD8+细胞数量及比值;采用摘眼球采血法收集小鼠血清,采用ELISA法检测小鼠血清E7抗体水平.结果 pcDNA3.1(+)/E7c组、pEGFP-C1/HBD2-E7c组小鼠脾脏脏器指数均明显低于PBS组(均P＜0.01).pEGFP-C1/HBD2-E7c组、pcDNA3.1(+)/E7c组小鼠CD4+、CD8+阳性细胞比例、绝对数均明显高于PBS组(均P＜0.05),pEGFP-C1/HBD2-E7c组、pcDNA3.1(+)/E7c组小鼠CD4+/CD8+比值均明显低于PBS组(均P＜0.05),pEGFP-C1/HBD2-E7c组、pcDNA3.1(+)/E7c组小鼠血清E7抗体水平均明显高于PBS组(均P＜0.01),pEGFP-C1/HBD2-E7c组小鼠血清E7抗体水平明显高于pcDNA3.1(+)/E7c组(P＜0.05).结论 人β防御素-2可明显改善HPV16 E7c基因的免疫原性,提高HPV16E7特异性抗体水平,升高免疫小鼠脾CD4+和CD8+T淋巴细胞数量.     

甲胎蛋白DNA疫苗的构建及诱导小鼠抗肿瘤免疫的实验研究

目的克隆小鼠甲胎蛋白(murineα-fetoprote in,mAFP)基因,构建mAFP DNA疫苗并检测其诱导mAFP特异性CTL反应及抗肿瘤免疫的能力。方法利用RT-PCR从Hepa 1-6细胞总RNA中克隆出mAFP基因,亚克隆于pcD-NA3.1中构建DNA疫苗pmAFP,酶切、测序和表达鉴定;pmAFP稳定转染EL-4细胞建立EL-4(mAFP)细胞系;pmAFP免疫小鼠,接种EL-4(mAFP)细胞,观察肿瘤生长情况;E lispot法检测免疫后小鼠脾脏细胞中产生IFN-γ的细胞频数;另外,对免疫的小鼠采血进行肝、肾功能检测。结果RT-PCR成功克隆出小鼠AFP基因;酶切、测序和表达鉴定证实DNA疫苗pmAFP构建成功;RT-PCR证实EL-4(mAFP)细胞中有mAFP mRNA的表达;pmAFP免疫组小鼠的肿瘤体积(1 042.42±123.71)mm3明显小于pcDNA3.1组(P<0.01)和PBS组(P<0.01);pmAFP免疫小鼠的脾脏细胞产生IFN-γ的细胞频数显著高于pcDNA3.1组(P<0.01)和PBS组(P<0.01)。各组肝、肾功能无显著差异。结论mAFP DNA疫苗构建成功,此疫苗能诱导AFP特异性的CTL增殖并诱导小鼠产生明显的抗肿瘤免疫力,对小鼠肝、肾功能不产生影响。     

人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组质粒的构建及其细胞的免疫性

目的:构建HPV16L1-E7C重组质粒并研究其细胞免疫性。方法:利用基因克隆技术将HPV16L1-E7CDNA片段定向插入pcDNA3.1载体,构建重组质粒pcDNA16L1-E7C,然后将其免疫C57BL/6小鼠,利用T淋巴细胞增殖试验检测免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖能力,同时利用ELISA试验检测免疫小鼠的脾淋巴细胞分泌γ-干扰素(IFN-γ)的水平。结果:特异性T细胞增殖试验中实验组3H-TdR掺入率为18339±1972,对照组为6737±1243,实验组小鼠T细胞增殖水平明显高于对照组(P<0.05)。DNA免疫后实验组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平为0.89±0.56,对照组为4.81±1.33,两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:重组质粒能增强小鼠的细胞免疫功能。     

遍在蛋白质-结核MPT64融合基因DNA疫苗的构建及免疫效应

目的:用遍在蛋白质调节结核杆菌单一抗原DNA疫苗,以期获得更强的免疫保护.方法:构建结核杆菌MPT64抗原DNA疫苗(pM)和遍在蛋白质基因与MPT64抗原基因融合的DNA疫苗(pUM).分别将构建的两种DNA疫苗肌内注射免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠的血清抗体(IgG、IgG1、IgG2a)、细胞因子(IFN-γ、IL-4)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,比较融合基因DNA疫苗和单基因DNA疫苗诱导的免疫应答强度.结果:pM组小鼠血清IgG水平高于pUM组(P＜0.01),但IgG2a/IgG1比值低于pUM组(P＜0.05).与pM组相比,pUM组小鼠IFN-γ分泌水平增高(P＜0.01),IL-4分泌水平下降(P＜0.01);pUM组的CTL活性高于pM组.提示融合基因DNA疫苗诱导的抗原特异性体液免疫应答不及单基因DNA疫苗,但其能诱导更强的细胞免疫应答.结论:遍在蛋白质-MPT64融合基因DNA疫苗对于防治结核病可能比单基因DNA疫苗更为有效.     

CD40L融合改造后的人乳头瘤病毒16型E7基因DNA疫苗的构建及其免疫原性测定

目的研究针对人乳头瘤病毒(HPV)16型的DNA疫苗,测定其免疫原性,用于治疗HPV16感染及感染相关恶性肿瘤。方法联合采用基因切割重排、定点突变及密码子优化等策略改造HPV16的转化基因E7,基因合成法获得改造后的E7基因(mE7);PCR法将mE7基因与CD40L胞外区编码序列融合,然后以pVR1012为载体构建pVR1012-mE7(mE7)及pVR1012-mE7/CD40L(mE7/CD40L)表达质粒;经肌肉免疫C57BL/6小鼠;ELISA法检测E7特异性血清抗体水平,ELISPOT法分析E749-57(H-2b)特异性分泌IFN-γ的CD8 T细胞活化水平,胞内染色-流式细胞检测分析E7特异性CD4 Th细胞活化水平;并在C57BL/6小鼠体内进行疫苗抗瘤活性检测。结果与野生型E7基因(wE7)相比,mE7基因诱发产生的E7特异抗体水平(P<0.01)、分泌IFN-γ的CD8 T细胞数目(P<0.01)及CD4 Th细胞活化水平(P<0.05)均显著提高;与mE7基因相比,mE7/CD40L融合基因可进一步显著提高E7特异性分泌IFN-γ的CD8 T细胞数目(P<0.01),但对E7特异性抗体产生及CD4 Th细胞活化水平没有明显影响。疫苗小鼠体内预防性免疫实验中,经wE7免疫的小鼠接种瘤细胞后2周内全部形成移植瘤,而所有经mE7及mE7/CD40L免疫的小鼠在瘤细胞攻击后第7周仍未见移植瘤形成;疫苗体内治疗性免疫实验中,小鼠在接种wE7后第8天左右全部形成移植瘤,并呈渐进性生长,而接种mE7的小鼠移植瘤清除率为30%,接种mE7/CD40L的小鼠移植瘤清除率增高至45%。对移植瘤的组织学检查结果显示,mE7/CD40L及mE7免疫组小鼠瘤细胞间及瘤组织周围可见大量淋巴细胞浸润,而wE7组小鼠的瘤细胞呈编织状紧密排列,未见有淋巴细胞浸润。结论HPV16型mE7/CD40L融合基因疫苗免疫小鼠后可诱发较强的E7特异性细胞免疫及体内抗瘤活性,具有较强的免疫原性。     

人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应

目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫。51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体。用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平。结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用。结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16DNA疫苗的协同因子具有重要价值。     

GM-CSF 增强HPV16DNA疫苗免疫效果的研究

目的：探讨GM－CSF增强HPV16E6c DNA疫苗免疫效应的作用。方法：（1）将C57BL／6小鼠18只分为1，2，33个组。DNA免疫前，每只小鼠胫骨前肌注射0．25％的布比卡因100μl，24h后，1组注射pcDNA3.1为对照组；2组注射pcDNA3.1E6c;3组注射pcDNA3.1E6c GM-CSF,2周后加强免疫1次；（2）加强免疫2周后，取小鼠脾脏及血清进行免疫功能测定。结果：（1）T细胞增殖实验结果：^3H-TdR掺入率；1组为6736，2组为15732，3组为26959，2组比1组提高了133．5％，3组比1组提高了278．7％，比2组提高了71．4％，经t检验表明，3组间的两两比较差异均有统计学意义，P＜0．01；（2）E6CTL表位合成肽特异性刺激后IFN－γ的产量：1组无IFN－γ产生，2组为624．8，3组为832．9，3组比2组提高了33．3％，经t检验表明，两组间差异有统计学意义，P＜0．01；（3）特异性抗体的产生：1组为0．04233，2组为0．4575，3组为0．8125，2组是1组的9．8倍，3组是1组的18．2倍，3组比2组提高了77．6％。经t检验表明，3组间的两两比较差异均有统计学意义，P＜0．01。结论：GM－CSF可有效的提高HPV16E6c DNA疫苗的细胞和体液免疫效应。     

HPV58 E2 DNA疫苗的构建及免疫原性研究

目的探讨人乳头瘤病毒58型（HPV58）早期基因E2作为DNA疫苗候选抗原的可行性。方法构建HPV58 E2真核重组表达载体pcDNA3/58E2,转染SiHa细胞,利用RT PCR检测HPV58E2 mRNA的转录。pcDNA3/58E2 DNA肌肉注射免疫BALB/C小鼠,ELISA检测小鼠血清中特异性anti HPV58E2 IgG水平。结果RT PCR结果表明,pcDNA3/58E2能够在真核细胞中有效转录HPV58E2mRNA。动物实验表明,质粒pcDNA3/58E2肌肉接种可诱导免疫小鼠产生抗E2特异性抗体。结论本研究成功构建了重组真核表达载体pcDNA3/58E2,并初步证明HPV58 E2 DNA 疫苗有良好的免疫原性。     

人乳头瘤病毒16型E5蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒115型（HPV16）E5蛋白真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5,分析E5在HeLa细胞及BALB／c小鼠肌肉组织中的表达。方法设计HPV16E5基因引物,PCR扩增E5基因。经Bam-HI、EcoR1酶切后将其连接入pcDNA3．1（＋）,PCR及双酶切筛选阳性克隆并测序。将构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5转染HeLa细胞,利用RT—PCR测定HPV16E5mRNA表达。将6只BALB／c小鼠分为3组,分别取100mgpcDNA3．1（＋）／HPV16E5、100mgpcDNA3．1（＋）、100mLPBS经肌肉注射小鼠,2周1次,共4次;末次接种后第14天取小鼠股四头肌制成石蜡切片,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达。结果PCR扩增得到252bpHPV16E5基因片段,DNA测序结果显示E5基因片段正确地连入pcDNA3．1（＋）。构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5在HeLa细胞表达大小为252bp的HPV16E5mRNA。小鼠股四头肌细胞膜被染成棕黄色。结论构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5能在HeLa细胞及小鼠肌肉组织中表达HPV16E5蛋白。     

人乳头状瘤病毒16E7在人喉癌细胞系中的转染及表达

目的:构建含人乳头状瘤病毒16E7(HPV16E7)基因的真核表达载体,观察HPV16E7对人喉癌HEp-2细胞系生物学特性的影响,为后续实验提供研究对象.方法:以含HPV16E7基因的中间质粒pET28a-HPV16E7为模板扩增出HPV16E7基因全长序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-) B中,并进行序列分析和酶切鉴定.电穿孔法将重组体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入喉癌HEp-2细胞中,Western 印迹法检测HPV16E7蛋白的表达,相差显微镜观察转染前后的HEp-2细胞系形态学变化,流式细胞仪检测转染前后细胞生长周期的改变.结果:成功构建并将pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入人喉癌HEp-2细胞中;转染后HEp-2细胞增生活跃,S期明显延长,并能够稳定表达HPV16E7蛋白.结论:HPV16E7有促进HEp-2细胞的致瘤活性;真核表达载体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7可为下一步建立动物模型和喉癌体外治疗实验提供研究工具.     

Ag85B-MPT64融合基因疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用

目的 研究Ag85B-MPT64(AM)融合基因疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护效果。方法C57BL／6小鼠63只,随机分为磷酸盐缓冲液(PBS)、空质粒、卡介苗(BCG)、pcDNA／Ag85B、pcDNA／MPT64、pcDNA／Ag85B pcDNA／MPT64、pcDNA／AM组,采用肌肉注射法免疫小鼠,0、3、6周各1次,BCG组只在0周予皮内注射卡介苗1次。末次免疫后第5周用H37Rv经尾静脉注射实施攻击,攻击后6周处死部分小鼠,测血清总IgG,特异性脾淋巴细胞增殖、IFN-γ及IL4分泌水平;观测脾、肺组织荷菌量和病理学检查以及剩余小鼠的存活时间。结果 AM基因疫苗组诱导的特异性的IgG、脾淋巴细胞增殖和IFN-γ的分泌以及肺、脾组织荷菌量、病理学改变和小鼠存活时间明显优于其他DNA疫苗单独免疫组。结论 AM DNA疫苗在抗结核分枝杆菌感染过程中具有明显的免疫保护作用。     

pcDNAL1 genetic immunization can induce specific cell-mediated immune respon ses in C57BL/6 mice

Objective To investigate the specific cell-mediated immune efficacy of the an HPV16 prophylactic vaccine. Methods C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups: experimental groupⅠ (treated with pcDNA L1), control group Ⅱ (treated with pcDNA3.1) and control group Ⅲ (treated with PBS buffer). The mice were immunized three times during a three-week interval. Ten to fourteen days after the third inoculation, a footpad swelling test was used to detect delayed-type hypersensitivity (DTH) responses. Antigen-specific splenocyte proliferation assay and quantitation of IFN-γ cells in splenocytes were performed by FACS assay. Results In the experimental group, splenocytes actively proliferated after stimulation with HPV16 VLP, and had developed a markedly larger amount of CD8(＋) IFN-γ(＋) cells, which is an index for special CTL. Also, the footpad was significantly thickened upon inoculation with HPV16 VLP.Conclusion Naked DNA vaccine of HPV16 L1 can induce specific cell-mediated immune responses in mice, which should be considered for evaluation of HPV16 DNA vaccine feasibility.     

重组血管活性肠肽基因质粒治疗大鼠胶原性关节炎的研究

目的：观察重组血管活性肠肽（pcDNA3．1＋／VIP）质粒治疗胶原诱导的大鼠关节炎（CIA）对血清TNF—α、IL～2、IL-4表达的影响和病理变化，探讨VIP基因治疗类风湿性关节炎的效果及可能机制。方法：以Ⅱ型胶原诱导的大鼠关节炎作为CIA模型，重组血管活性肠肽质粒关节腔内注射治疗CIA，以双抗体夹心酶联免疫吸附法（ABC—ELISA）检测血清TNF—α、IL-2和IL-4的表达，观察病理变化和整体疗效。结果：①病理切片显示CIA模型组炎性细胞浸润明显，并存在骨和软骨破坏，VIP治疗组可显著减轻关节炎性病理改变；②细胞因子测定显示：与正常组相比，各对照组血清TNF—α、IL-2水平显著升高（P〈0．05），IL-4水平减低（P〈0．05）；与各对照组相比，各重组VIP质粒治疗组血清TNF—α和IL-2表达水平均明显降低（P〈0．05），IL-4表达则升高（P〈0．05）。结论：血管活性肠肽基因质粒关节腔内注射治疗大鼠CIA具有显著的疗效，有望成为RA的有效治疗手段。     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。     

人β防御素2（HBD2）与人乳头瘤病毒HPVl6E6羧基端编码基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的构建人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端基因的真核表达质粒，并检测其在真核细胞中的表达情况，探讨其作为DNA疫苗治疗宫颈癌的可行性。方法利用分子克隆技术，将HBD2基因片段与HPV16E6羧基端基因片段连接，插入真核表达质粒pcDNA3．1，经测序鉴定后，用阳离子脂质体法转染真核细胞COS7，RT—PCR及免疫组化法检测其表达。结果重组质粒pcDNA3．1／HBD2～HPV16E6C转染COS7细胞48小时后，RT—PCR扩增出插入的HBD2--HPV16E6C片段，免疫组化染色呈棕黄色阳性反应。结论人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端融合基因能在真核细胞中有效表达，为今后进行整体动物DNA免疫试验奠定了基础。     

HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制，对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板，采用PCR方法扩增HPV16 E5基因，经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a（＋）载体，转染JMl09感受态细胞，并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达，SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32（＋），E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1（＋）空质粒，构建pcDNA3．1（＋）m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染，最后用G418进行稳定表达株的筛选，并采用RT．PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5，在1mmol／LPTG、28℃诱导条件下BL21（DE3）菌体中HPVl6E5．TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株，RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和pcDNA3．1（＋）／E5真核表达质粒，HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达．这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。