CD40L融合改造后的人乳头瘤病毒16型E7基因DNA疫苗的构建及其免疫原性测定

目的研究针对人乳头瘤病毒(HPV)16型的DNA疫苗,测定其免疫原性,用于治疗HPV16感染及感染相关恶性肿瘤。方法联合采用基因切割重排、定点突变及密码子优化等策略改造HPV16的转化基因E7,基因合成法获得改造后的E7基因(mE7);PCR法将mE7基因与CD40L胞外区编码序列融合,然后以pVR1012为载体构建pVR1012-mE7(mE7)及pVR1012-mE7/CD40L(mE7/CD40L)表达质粒;经肌肉免疫C57BL/6小鼠;ELISA法检测E7特异性血清抗体水平,ELISPOT法分析E749-57(H-2b)特异性分泌IFN-γ的CD8 T细胞活化水平,胞内染色-流式细胞检测分析E7特异性CD4 Th细胞活化水平;并在C57BL/6小鼠体内进行疫苗抗瘤活性检测。结果与野生型E7基因(wE7)相比,mE7基因诱发产生的E7特异抗体水平(P<0.01)、分泌IFN-γ的CD8 T细胞数目(P<0.01)及CD4 Th细胞活化水平(P<0.05)均显著提高;与mE7基因相比,mE7/CD40L融合基因可进一步显著提高E7特异性分泌IFN-γ的CD8 T细胞数目(P<0.01),但对E7特异性抗体产生及CD4 Th细胞活化水平没有明显影响。疫苗小鼠体内预防性免疫实验中,经wE7免疫的小鼠接种瘤细胞后2周内全部形成移植瘤,而所有经mE7及mE7/CD40L免疫的小鼠在瘤细胞攻击后第7周仍未见移植瘤形成;疫苗体内治疗性免疫实验中,小鼠在接种wE7后第8天左右全部形成移植瘤,并呈渐进性生长,而接种mE7的小鼠移植瘤清除率为30%,接种mE7/CD40L的小鼠移植瘤清除率增高至45%。对移植瘤的组织学检查结果显示,mE7/CD40L及mE7免疫组小鼠瘤细胞间及瘤组织周围可见大量淋巴细胞浸润,而wE7组小鼠的瘤细胞呈编织状紧密排列,未见有淋巴细胞浸润。结论HPV16型mE7/CD40L融合基因疫苗免疫小鼠后可诱发较强的E7特异性细胞免疫及体内抗瘤活性,具有较强的免疫原性。     

融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7的构建及其免疫学特性研究

目的 构建融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7,并评价其体外实验和动物模型上的免疫学特性,尤其是抗病毒致病基因的特异性细胞免疫反应.方法 分别构建DNA重组体pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7,pcDNA3.1-CRT180,pcDNA3.1-HPV6E7.将pcDNA3.1-HPV6E7质粒经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性细胞集落,荧光显微镜观察和RT-PCR鉴定表达HPV6E7的阳性细胞株.将质粒DNA肌注免疫C57BL/6小鼠,3次后取全血经流式细胞仪检测T细胞亚群的变化,LDH法检测小鼠的脾细胞和淋巴细胞与靶细胞B16/HPV6E7孵育后的CTL活性以及ELISA法检测共孵育上清中IL-2和IFN-γ浓度的变化.结果 各组质粒经鉴定表明构建正确.转染后细胞株稳定表达HPV6E7.DNA疫苗免疫小鼠后,pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7免疫组较pcDNA3.1-HPV6E7免疫组的外周血CD8 T细胞和TCRγδT细胞的比例显著增加,脾细胞和淋巴细胞针对靶细胞B16/HPV6E7的CTL杀伤活性更明显,分泌IL-2和IFN-γ的水平升高(P＜0.05).结论 CRT180与HPV致病基因6E7相连的重组质粒疫苗pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7能引发小鼠T细胞亚群CD8 分化并诱导出显著的特异性CTL反应.推测CRT180/HPV6E7 DNA疫苗在动物模型上可以有效激活抗HPV特异性细胞免疫,有利于病毒感染的清除.     

HPV58型E7基因重组痘苗疫苗免疫保护作用的实验研究

目的制备含人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗,并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果。方法利用PCR方法扩增HPV58E7DNA片段,在消除其转化活性的基础上,构建表达HPV58E7的重组痘苗病毒疫苗并免疫小鼠,观察该疫苗对E7阳性肿瘤细胞生长的抑制作用,体外诱导、测定细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性。结果经定点突变的HPV58E7基因转化活性显著降低,用突变的E7基因构建的重组痘苗病毒免疫小鼠后,能抑制E7阳性肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期;免疫小鼠脾淋巴细胞体外可诱导产生针对E7阳性肿瘤的CTL细胞。结论在消除转化活性的基础上,HPV58E7可用于治疗与HPV58感染有关的肿瘤。     

人乳头瘤病毒16型E7DNA疫苗的构建及其诱导特异性淋巴细胞增殖的研究

目的 :探讨人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )E7DNA疫苗诱导机体特异性细胞免疫应答的情况。方法 :采用分子克隆技术 ,构建HPV16野生型E7基因的真核表达重组体 ,将其转化大肠杆菌JM10 9进行筛选 ,通过限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析 ,证明重组质粒中目的基因插入片段及载体DNA大小、方向、插入位点均正确 ,获得HPV16E7DNA疫苗 ,将E7DNA疫苗经皮内注射免疫动物 ,MTT比色法体外检测特异性淋巴细胞增殖反应。结果 :野生型E7DNA疫苗免疫组脾淋巴细胞在体外受到E7蛋白的再次刺激后出现特异性淋巴细胞增殖反应。结论 :野生型E7DNA疫苗可诱导特异性的细胞免疫应答 ,皮内注射HPVDNA疫苗是一种简便有效的免疫接种途径     

HPV58型E7基因重组痘苗疫苗保护作用的实验研究

目的：制备含人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗，并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果。方法：利用PCR方法扩增HPV58 E7 DNA片段，在消除其转化活性的基础上，构建表达HPV58 E7的重组痘苗病毒疫苗并免疫小鼠，观察该疫苗对E7阳性肿瘤细胞生长的抑制作用，体外诱导、测定细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）活性。结果：经定点突变的HPV58 E7基因转化活性显著降低，用突变的E7基因构建的重组痘苗病毒免疫小鼠后，能抑制E7阳性肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期；免疫小鼠脾淋巴细胞体外可诱导产生针对E7阳性肿瘤的CTL细胞。结论：在消除转化活性的基础上，HPV58E7可用于治疗与HPV58感染有关的肿瘤。     

HPV16嵌合型疫苗的构建及其免疫效应初探

目的 构建以碳末端锌指结构突变的E7基因为基础，融合HSP70的嵌合型DNA疫苗，检测其诱导的特异性T淋巴细胞增殖活性，初步评价此疫苗对HPV相关肿瘤的治疗作用。方法 利用PCR法定点突变E7基因碳末端的锌指结构，以其为基础融合热休克蛋白70，克隆入pcDNA．3．1-质粒构建嵌合型DNA疫苗。DNA测序，确认E7基因突变位点及DNA疫苗阅读框架。用脂质体法将pcd—E7-HSP转染A549细胞，经G418筛选后，提取RNA，RT—PCR检测E7基因表达。DNA疫苗免疫C57BL6小鼠。取其脾细胞与E7蛋白在体外共同培育，MTT法检测T淋巴细胞增殖活性。结果 E7基因突变位点及阅读框架均正确，E7基因可检测到表达。疫苗免疫后C57BL/6小鼠脾细胞增殖活跃。结论：E7基因锌指结构的突变及融合HSP70能够诱导特异性的细胞免疫应答。     

重组全酿酒酵母HPV16-E7疫苗的构建及免疫原性初步研究

目的 构建人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E7重组全酿酒酵母疫苗.初步评价疫苗的免疫应答效应.方法 将HPV16 E7 cDNA亚克隆入酵母表达载体pYES2/NT,重组质粒转化酿酒酵母,经诱导表达、热灭活制备全酵母HPV16-E7疫苗.疫苗免疫C57BL/6小鼠,ELISA检测其诱导的抗体和细胞因子表达水平.结果 重组全酵母疫苗能够有效地表达HPV16-E7蛋白;疫苗小鼠免疫,能够诱导出特异性抗HPV16-E7抗体,并促进Th1型细胞因子的表达.结论 研究结果 为进一步进行疫苗抗肿瘤免疫研究,提供了实验基础.     

HPV58 E2 DNA疫苗的构建及免疫原性研究

目的探讨人乳头瘤病毒58型（HPV58）早期基因E2作为DNA疫苗候选抗原的可行性。方法构建HPV58 E2真核重组表达载体pcDNA3/58E2,转染SiHa细胞,利用RT PCR检测HPV58E2 mRNA的转录。pcDNA3/58E2 DNA肌肉注射免疫BALB/C小鼠,ELISA检测小鼠血清中特异性anti HPV58E2 IgG水平。结果RT PCR结果表明,pcDNA3/58E2能够在真核细胞中有效转录HPV58E2mRNA。动物实验表明,质粒pcDNA3/58E2肌肉接种可诱导免疫小鼠产生抗E2特异性抗体。结论本研究成功构建了重组真核表达载体pcDNA3/58E2,并初步证明HPV58 E2 DNA 疫苗有良好的免疫原性。     

人乳头瘤病毒16型E7蛋白单克隆抗体的研制

目的 为研究HPV16 E7蛋白在肿瘤早期预报中的作用及研制治疗性疫苗,特制备HPV16 E7的单克隆抗体.方法 将构建成的PGEX4T-1-HPV16 E7的质粒转化BL21细菌,在IPTG诱导下,稳定表达GST-HPV16E7融合蛋白,免疫Balb/c小鼠,收集免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,用ELISA双筛,直至检测所有孔均为E7阳性而GST阴性为止,扩大培养、建株、冻存并制备腹水、单克隆抗体.结果 成功制备出HPV16 E7的单克隆抗体,可在多种肿瘤组织细胞核中染色.结论 该抗体是HPV16 E7蛋白特异性的McAb.     

人乳头状瘤病毒16型E6基因转染人外周血树突状细胞的体内抗宫颈癌研究

目的：观察人乳头状瘤病毒（HPV）16型E6基因转染人外周血来源的树突状细胞（DC）制备的疫苗，在严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠体内对人宫颈癌（CaSki）细胞的免疫治疗和免疫保护作用。方法：细胞因子扩增人外周血DC，脂质体（Lipofeetamine）转染HPV16E6制备HPV16E6-DC疫苗。进行致瘤性检测，并观察在SCID小鼠体内疫苗抗人CaSki细胞的免疫保护及对荷瘤小鼠的免疫治疗作用。结果：①ttPV16E6-DC疫苗接种于小鼠体内未见肿瘤形成，脾、肺、肝和肾等器官未出现肿瘤病变。②在免疫治疗组，用HPV16E6．DC疫苗治疗的荷瘤小鼠，肿瘤生长速度较对照组慢，瘤体积小于对照组，瘤重量较对照组明显减轻（P〈0．01）。③在免疫保护组，经HPV16E6-DC疫苗免疫的小鼠，CaSki细胞攻击后，肿瘤潜伏期较对照组明显延长（P〈0．01），瘤体积明显小于对照组，瘤重量也轻于对照组（P〈0．01）。结论：人外周血来源的HPV16E6．I）12疫苗无体内致瘤性。且能在一定程度上抑制人CaSki细胞在SCID小鼠体内的生长，抵抗肿瘤细胞的攻击，对机体具有相应的抗肿瘤免疫治疗及保护作用。     

Therapeutic antitumor response to cervical cancer in mice immunized with U14 v accines transfected with costimulatory B7 gene

Objective To investigate the effect of U14 vaccine transfected with the B7 gene in inducin g antitumor immune response to murine cervical carcinoma in Chinese 615-strain mice.Methods A recombinant retroviral plasmid vector expressing mouse B7-1 gene (pLNSX-mB7) was transfected into 615-strain mouse cervical carcinoma cell line No. 14 (U1 4) by electroporation to set up a highly-expressed mB7-1 U14 cell clonal strai n (B7(+)U14). In vivo experiments: (1) B7(+)U14 vaccine was primed to protect t he 615-strain mice against U14 re-challenge. (2) B7(+)U14 vaccine was injecte d into tumor-bearing mice with different tumor sizes. Lifetimes and tumor s izes were recorded. In vitro cytotoxicity assay: Mice were immunized with B 7(+)U14 or U14 vaccine and 2 weeks later, spleen cells of those mice were cultur ed for 2 days. The cytotoxicity of these cells against U14 was detected by 5-d iphenyl tetrazolium bromide assay.Results We obtained several B7-1 high expression clonal U14 lines. In vivo experiment, we did not find tumor growing in 3 of the 6 mice primed by B7(+)U14 vaccine during their entire life after re-challenge with U14. The other 3 mice develo ped tumors and their average survival time was longer than that of the control g roup (P&lt;0.01). All 6 mice grew tumors in the control group. When the transplanted tumors became palpable, the mice were randomly divided into 3 group s to be injected with B7(+)U14 vaccine. It was effective for tumor-bearing mic e only when the tumor diameters were &lt;3 mm. When the diameters were ≥3 mm, it was not efficacious to inject B7(+)U14 vaccine (P&lt;0.05). In vitro cytotoxicity assay, cytotoxic T lymphocytes induced by B7(+)U14 vaccine h ad a high er cytotoxicity against U14 than that induced by U14 vaccine (F=310.8, P &lt;0.001).Conclusions Vaccines of cervical cancer cells transfected with the costimulatory molecule B7 gene can induce antitumor immune protection in host mice against U14 re-challe nge. This treatment may cure part of the tumor-bearing mice but be restricted by tumor size. The results suggest that transfecting the B7 gene into cervical cancer as a cell vaccine may be an efficient supplementary method to treat cervi cal cancer after operation.     

宫颈癌妇女人乳头瘤病毒16E6/E7基因变异分析

目的了解宫颈癌妇女人乳头瘤病毒(HPV)16E6/E7基因变异的情况,为HPV防治提供流行病学数据。方法从大量样本中筛选出HPV16阳性标本180例,其中宫颈癌患者100例,宫颈不典型增生患者50例,宫颈炎症患者30例,对宫颈脱落细胞样本采用PCR方法扩增HPV16 E6/E7基因,然后对反应产物采用DNA测序法获得基因序列,在GeneBank进行经BLAST分析,寻找变异位点。结果宫颈癌患者中E6核苷酸变异率为82.00%(82/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);宫颈癌HPV16E6最频繁的序列变异为T178G(60/100),其他常见变异为T350G、C335T/A442C、T178G/G39T,年轻宫颈癌组E6核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但两者T178G变异率存在明显差异(=0.000)。宫颈癌患者HPV16 E7核苷酸变异率为74.00%(74/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);E7最频繁序列变异为A647G 32.00%(32/100),其他常见的变异为A647G/C749T/T843C/T846C、A647G/C749T/T846C、C749T/C790T、A647G/C749T;年轻宫颈癌组E7核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但A647G变异率存在明显差别(=0.03)。结论宫颈癌患者明显存在HPV16E6E7核苷酸变异,HPVE6 T178G、E7 A647G可能与宫颈癌年轻化密切相关,故对该人群的检测并及时尽早采取干预措施。     

人乳头瘤病毒16型湖北株E7基因的克隆、表达及其抗原性研究

目的 :克隆、表达HPV16湖北株E7基因并探讨E7蛋白的免疫学性质。方法 :应用基因克隆技术克隆、表达HPV16E7基因 ,纯化E7蛋白并免疫动物 ,用ELISA检测动物血清中的特异性E7抗体 ,进而评估E7蛋白的抗原性。结果 :融合型的E7蛋白产量可达细胞总蛋白量的 30 % ;ELISA检测表明动物体内产生了特异性E7抗体。结论 :HPV16湖北株E7蛋白可通过基因克隆方法制备 ,并保留了标准E7蛋白的抗原性     

外源性tRNAser对人乳头瘤病毒E7基因表达的影响

目的:探讨哺乳动物细胞中特定外源性tRNAser(CGA)的表达对HPV6bE7蛋白转译的影响,为研究HPV抗原表达的机制提供实验依据。方法:提取重组真核表达质粒pSVtRNAser(含人tR-NAsercDNA的全部序列)、pcDNA3-WtE7(含野生型HPV6bE7ORF)、pcDNA3-HuE7(含优化密码人源化HPV6bE7ORF),EcoRI酶切鉴定pSVtRNAserKpnI和EcoRI双酶切鉴定pcDNA3-HuE7和pcDNA3-WtE7。将质粒DNApSVtRNAser分别与pcDNA3-WtE7或pcDNA3-HuE7混合,脂质体介导共转染COS-1细胞。转染后48h,做免疫荧光染色。结果:重组质粒酶切鉴定结果正确。免疫荧光检测显示:与野生型E7基因单独转染组相比,pSVtRNAser与pcDNA3-WtE7共转染的COS-1细胞中,E7蛋白的表达增强。pcDNA3-HuE7质粒单独转染的COS-1细胞中优化密码E7基因可获得有效表达,共转染后,荧光阳性细胞未见明显增多。Southernblot检测结果显示,在400bp处可见特异DNA条带,说明质粒pSV2tRNAser已转入COS-1细胞。结论:补充外源性pSVtRNAser对COS-1细胞中野生型HPV6bE7基因的表达有一定程度的增强作用。     

人乳头瘤病毒16型(湖北株)E7基因在体内和体外的表达

构建人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７湖北株（ＨＢ）基因真核表达质粒,探讨其在哺乳动物体外,体内表达状况,为本地区ＨＰＶ相关肿瘤的基因治疗提供依据。方法采用分子克隆技术,构建ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ重组表达质粒,磷酸钙－ＤＮＡ沉淀技术及基因免疫技术将外源目的基因（ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ）导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞及大、小鼠体内ＰＣＲ,ＲＴ－ＰＣＲ,免疫荧光染色技术对外源目的基因及其产物（ｍＲ－ＮＡ,蛋白质。