抗肺癌单克隆抗体的研制

采用新鲜肺癌组织制成的细胞悬液及肺腺癌细胞株做为免疫原,免疫Balb/c小鼠。取脾细胞与经活体增殖的无支原体污染的高活力SP2/O骨髓瘤细胞融合,联合应用酶联免疫吸附和多组织切片免疫组化染色法进行筛选,得到两株分泌对肺癌具高特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。抗体与被检测的大多数人体正常组织无交叉反应,可初步用于肺癌病理鉴别诊断。     

PP2Ac在人不同类型肺癌组织和肺癌细胞中的表达

目的研究PP2Ac在人不同类型肺癌组织和肺癌细胞中的表达．方法用免疫组化方法从组织水平上观测临床获取人不同类型肺癌标本组织的PP2Ac蛋白表达；用Westernblot分子生物学方法从细胞水平上测定两种人肺癌细胞株（YTLMC-90和GLC-82）的PP2Ac和p-AKT蛋白表达．结果免疫组化结果显示：在人肺鳞癌、腺癌和小细胞肺癌三种肺癌组织中的PP2Ac蛋白表达与肺癌患者的性别、年龄和肿瘤分化程度均无明显相关性（P〉0．05）；在人肺鳞癌组织和小细胞肺癌组织细胞浆中均未见有PP2Ac蛋白表达，但在其间质有阳性表达；在人肺腺癌组织中PP2Ac蛋白呈阴性表达，而p-AKT蛋白却呈现强阳性表达．Westemblot结果表明：在人正常肺组织细胞中PP2Ac蛋白呈正常表达；YTI．MC-90细胞中PP2Ac蛋白较人正常肺组织表达稍弱，而在GLC-82细胞中表达明显减弱，甚至缺失；在人正常肺组织细胞中p-AKT蛋白呈低表达，给予GLC-82细胞加入PP2A抑制剂OA（岗田酸），在6h、12h、24h的不同时间点，p-AKT蛋白的表达均较未加OA组明显增强，PP2Ac和p-AKT蛋白表达呈反相关．结论PP2Ae可能参与肺癌的发生，其表达水平可能与肺癌细胞病理类型有关．AKT的活化（P-AKT）可能与肺癌的发生发展密切相关．     

两个新的抗人小细胞肺癌单克隆抗体的制备及其应用研究

用人小细胞肺癌细胞系免疫BALB/C小鼠。免疫脾细胞与SP2/0细胞融合,获得两株分泌抗人小细胞肺癌表面相关抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞系,2D6和2F1。经ELISA测定,它们与人小细胞肺癌细胞呈强阳性反应。与肺腺癌、肺鳞癌、食管癌、喉癌、人白血病细胞系(molt4)、Hela细胞系及人周血单核细胞均呈弱反应。~(120)Ⅰ标记的抗体在人小细胞肺癌裸鼠异种移植模型上的放射免疫显像表明,在72h时放射标记物在瘤区高度浓集。提示,单克隆抗体对人小细胞肺癌具有相当高特异性和亲和力。对这两个单克隆抗体的其他特性及临床应用前景正在研究中。     

抗人肺癌单克隆抗体的制备及其生物特征的研究

目的制备抗人肺癌细胞的单克隆抗体（McAb），鉴定其生物学特征。方法用人肺癌细胞株A549作为抗原，采用杂交瘤技术制备抗人肺癌细胞McAb，用ELISA进行筛选和鉴定其亚类，并用细胞扒片免疫化学方法检测其特异性。结果获得了1株分泌抗人肺癌细胞McAb杂交瘤细胞（命名为1D11），其染色体呈双亲特点，该McAb与人卵巢癌细胞株SKOV3有交叉反应，与肝癌细胞株SMMC7721，宫颈癌细胞株Hela.表皮癌细胞株A431，正常肝细胞株L02无交叉反应。结论该McAb对肺癌和卵巢癌具有特异性。     

肺癌相关基因的RNA干扰实验研究

目的为研究点突变的PP2Aα基因对单克隆抗体N-35相关蛋白N35表达的影响，探讨其作为肺癌基因治疗侯选靶基因的可行性．方法将云南个旧肺腺癌细胞系GLC-82作为靶细胞，点突变的PP2Aα基因作为靶基因，设计并构建shRNA质粒表达载体，通过阳离子脂质体导入GLC-82细胞，经G418筛选阳性克隆，采用蛋白质印迹法检测N35表达量的变化．结果所有shRNA质粒表达载体均成功导入GLC-82细胞并能使它们在含G418培养基中长时间生长：[第一段]     

肺癌可溶性抗原致敏的DC诱导CTL特异性杀伤肺癌细胞的实验研究

目的 通过对负载人肺癌GLC-82细胞可溶性抗原的树突状细胞（DC）体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）对肺癌细胞的杀伤研究，为以DC为基础的肺癌免疫瘤苗的临床应用提供一定的实验依据。方法 通过用3MKCl提取法和弱酸洗脱法获得人肺腺癌细胞GLC-82的可溶性抗原多肽，用GLC-82细胞抗原多肽冲击致敏从人外周血单核细胞（PBMC）中用GM-CSF、IL-4和TNF—α体外诱导扩增并经鉴定的DC；利用负载GLC～82细胞抗原多肽的DC，刺激同种异体外周血T淋巴细胞活化增殖，诱导产生具有识别肺癌细胞抗原的特异性CTL；进一步探讨该CTL对GLC-82，肺癌CALU-6和人红白血病K562细胞的体外杀伤效应。结果 人PBMC体外经7d诱导出的DC，经光镜、电镜、免疫组化证实具有典型的树突状细胞特性；经GLC-82抗原致敏的DC诱导同种异体T淋巴细胞活化增殖产生CTL，诱导激活的CTL与靶细胞共育时镜下发现CTL靠近并聚集在肿瘤细胞周围，致使肿瘤细胞发生凋亡和坏死。结论肺癌可溶性蛋白抗原能活化致敏DC，无需明确肿瘤特异抗原，获取方法简便可行；联合应用GM—CSF、IL-4和TNF—α诱导人PBMC中的单核细胞，能诱导出功能较强的DC；致敏DC能强烈刺激初始型同种异体T淋巴细胞增殖产生CD8^＋表达增加的CTL;激活的CTL对肺癌靶细胞发挥高效而特异的细胞毒效应，对非肺组织瘤靶细胞也具有非特异性杀伤效应。     

肺癌相关蛋白N35的纯化及鉴定

目的利用免疫亲和层析技术用自行制备的抗人肺癌单克隆抗体N35纯化其相应的肺癌相关抗原N35蛋白并对其进行鉴定。方法培养P35杂交瘤细胞,收集培养上清,利用Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化单抗N35;用纯化得到的单抗与溴化氰活化的Protein A-Sepharose CL-4B制备免疫亲和柱;再将肺腺癌GLC-82细胞的裂解液通过此免疫亲和柱,纯化肺癌相关抗原N35;最后,对纯化得到的N35蛋白进行Western blot鉴定。结果应用Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化得到纯度较高的单抗N35蛋白;应用溴化氰活化的Protein A-SepharoseCL-4B免疫亲和层析法纯化得到相对分子质量80 000的肺癌相关蛋白N35。结论纯化得到的肺癌相关蛋白N35是一种新的肿瘤相关抗原,可为肺癌的生物治疗提供新的靶点。     

用单克隆抗体研究人类结肠癌的相关抗原

用人类大肠癌细胞株 HI29作抗原,融合成三株杂交瘤细胞 Hb_3、Ab_5和 Ad_5,用间接免疫荧光检查,发现这三株细胞产生的抗体,对人类结肠癌组织反应的阳性率分别为86%,45%和58%。三株抗体也对胃癌、胰腺癌和肺癌呈阳性反应。但对肾癌和各种肉瘤组织阴性。三株抗体对正常结肠上皮阴性。所以能鉴别结肠癌和正常大肠上皮组织。具有相对的器管特异性。用聚丙洗胺电泳结合放射自显影发现:Hb_3作用抗原     

抗蛋白酶激活受体?鄄2单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备出一种具有多种用途的抗蛋白酶激活受体-2(PAR-2)单克隆抗体(mAb).方法:用人工合成的11肽PAR-2作为免疫原,采用皮下多点注射方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞采用间接ELISA法筛选.通过ELISA、Dot blot、免疫组化染色、流式细胞分析、激光共聚焦显微镜技术鉴定mAb的特异性.结果:获得1株可稳定分泌抗:PAR-2 mAb的杂交瘤细胞.其分泌的mAb为IgM型,ELJSA法检测杂交瘤细胞培养上清效价为1:16;点杂交分析表明此抗体可特异性结合PAR-2;免疫组化染色显示该单克隆抗体与人肺组织中的肺泡上皮细胞和平滑肌细胞,结肠组织中的腺上皮细胞和疑似淋巴细胞,扁桃体中的淋巴细胞,包皮组织中的鳞状上皮细胞呈阳性反应;流式细胞仪分析显示与人肺腺癌细胞系A549细胞中的PAR-2呈阳性反应;激光共聚焦扫描显微镜观察发现荧光标记的阳性反应物位于A549细胞的胞膜和胞浆.结论:成功地制备出可用于免疫组化和点杂交的抗PAR-2单克隆抗体,为PAR-2相关性疾病的研究提供了有用的工具.     

应用抗肿瘤McAb3D5和抗CEA McAb对肺癌的免疫组化研究

应用抗肿瘤单克隆抗体McAb 3D5和抗CEA单克隆抗体,对101例肺癌手术切除标本,作免疫组织化学研究。结果表明,抗肿瘤单克隆抗体McAb 3D5可与63.4%的肺癌标本反应,且对肺鳞癌有较高的阳性率。抗CEA单克隆抗体可与77.2%的肺癌起反应,特别对肺腺癌有较高的阳性率。两种单克隆抗体不具相同抗原性,联合应用时可提高阳性率。     

分泌抗体的杂交瘤细胞株的制备

目的应用杂交瘤技术制备出分泌抗肺癌抗体杂交瘤细胞株,为肺癌的早期诊断和免疫治疗提供可能靶点．方法用肺癌细胞株作免疫原免疫健康BALB／C小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得分泌高滴度抗肺癌抗体的杂交瘤细胞株,用间接ELISA和检测单抗体的特异性,双抗体夹心法测定免疫球蛋白同种型．结果通过细胞融合,筛选出2株持续分泌抗肺癌抗体的杂交瘤细胞株C5、B8,其分泌的抗体为IgM亚类,κ亚型,并和肺癌细胞发生特异性反应．结论成功完成细胞融合,制备了分泌抗体的杂交瘤细胞株．     

HUMAN COLONIC CANCER ASSOCIATED ANTIGENS DETECTED BY THREE MONOCLONAL ANTIBODIES

Three monoclonal antibodies (Hb3, Ab5, and Ad5) were produced with spleen cells from mice im munized against the human colon cancer cell line HT-29. Hb3 reacted with 86%, while Ab3 and Ad5 with 40-60%, of the colon cancer tissues tested. Re- activity was also seen with the cancerous stomach, pancreas, lung, nasopharynx, breast and prostate, although in Hb3 the intensity of immunofluorescent staining of these tissues was not as great as of colon cancer tissues. None of the monoclonal antibodies reacted with normal colon samples so they were able to distinguish the normal from the cancerous colon tissues. Yet monoclonal antibodies did react with the normal duodenum, stomach, pancreas, lung, and kidney. The three antibodies can be differentiated from each other on the basis of their cell and tissue specificities and from the colon cancer reactive mo- noclonal antibody 19-9. Neuraminidase digestion of the tissue or cells had no effect on their reactivities. - 63 -     

Pim-3在肺癌组织中的表达

目的探讨Pim-3在肺腺癌A549细胞系和肺癌组织中的表达及临床意义。方法免疫组化法检测Pim-3蛋白在肺癌细胞系、不同类型肺癌组织和非肺癌支气管肺组织中的表达,分析组间差异。结果 Pim-3蛋白在肺癌细胞系和不同类型肺癌组织中阳性表达率均为100%,而癌周组织未见明显阳性表达;在正常支气管肺组织中,未见阳性表达;不同类型肺癌组织阳性表达率无统计学差异。结论 Pim-3蛋白有可能成为新的肺癌标志物。     

hTERT启动子的克隆及其在端粒酶阳性肺癌细胞中的靶向转录活性研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子序列片段，并探讨hTERT启动子在肿瘤细胞中的靶向转录活性。方法用PCR方法克隆293细胞DNA hTERT 5＇端上游旁侧序列长约1．1kb的启动子片段，经测序无误后将其克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游，构建pGL3-hTERTp重组质粒，瞬时转染肺癌细胞A549、SPC-A-1、LTEPα-2、NCI-H446、YTMLC-9、GLC-82、95D、A2以及正常成纤维细胞MRC-5，检测荧光素酶活性。并用RT-PCR和TRAP-ELISA方法分析各细胞hTERT mRNA的表达及其端粒酶活性。结果琼脂糖电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1．1kb，DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致，位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp（-1126～-40），片段长度为1084bp；采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒，均显示构建成功；hTERT mRNA和端粒酶活性在肺癌细胞中呈不同水平的表达，而正常细胞则均为阴性；瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示，hTERT启动子片段在所有检测的肺癌细胞中均有高低不同的转录活性，在正常细胞MRC-5无转录活性。结论克隆的1084bp大小的hTERT启动子片段在hTERT mRNA和端粒酶阳性的肺癌细胞中有特异性的转录活性，hTERT启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件。     

大肠癌组织Runx3基因启动子甲基化的研究

目的:检测大肠癌患者肿瘤组织及其相应的癌旁组织中Runx3基因表达和启动子区域甲基化状态,探讨甲基转移酶抑制剂5-aza-dc对结肠癌细胞系中Runx3表达的作用。方法:将手术切除的37例大肠癌组织和对应癌旁组织提取RNA和基因组DNA,采用RT-PCR检测Runx3基因的表达,甲基化特异PCR方法(MSP)检测Runx3基因启动子区域甲基化状态,用5-aza-dC处理结肠癌细胞系后,RT-PCR方法检测Runx3基因的表达。结果:37例大肠癌和对应癌旁组织中Runx3基因表达阳性率分别为100%(37/37),2.7%(1/37)。癌组织中Runx3基因表达明显降低(P<0.01)。MSP检测发现11例(30%)大肠癌标本及1例(3%)癌旁正常组织中Runx3基因呈甲基化状态。癌组织中Runx3基因甲基化明显高于癌旁组织(P<0.05)。结肠癌细胞系HT29 5-aza-dC处理后Runx3基因表达水平增加。结论:Runx3基因启动子甲基化和Runx3基因表达在大肠癌的癌旁组织和原发癌灶间存在显著性差异,可能与结肠癌的发生发展有关。     

ABCG2在肺癌干细胞标志中的应用价值

目的：：探究分析ABCG2在肺癌干细胞标志中的应用价值。方法：采用经HE染色、常规石蜡包埋、切片处理的肺癌组织,并应用免疫组化SP 法对肺癌组织及肺癌细胞系A459和GLC－82中ABCG2的定位与表达情况进行检测,通过显微镜观察ABCG2蛋白表达分布的情况及部位,ABCG2蛋白表达强度的阳性单位采用LeicaQ500MC图像分析系统进行定量分析。结果：ABCG2蛋白在肺癌细胞质和细胞膜中表达,其中在肺腺癌和鳞腺癌组织中呈现阳性表达,并且分布弥漫,而ABCG2蛋白在肺大细胞癌和肺小细胞癌中不表达。 ABCG2蛋白的阳性表达率与表达强度由高到低的排列顺序依次为肺腺癌、肺鳞癌、肺小细胞癌和肺大细胞癌,但是各组表达情况对比差异无统计学意义( P>0.05)。结论：AB-CG2的在肺癌组织中的表达情况说明ABCG2不适合作为肺癌干细胞的标注物,但是可以作为肺癌分型的标记物。     

肺癌膜蛋白识别分子与抗肿瘤反应的初步研究

目的探讨肺癌血清中肿瘤自身识别和抗肿瘤反应物质。方法取肺鳞癌、腺癌、大细胞癌、小细胞未分化癌术后新鲜组织匀浆,离心,超声粉碎提取胰蛋白,与溴化氰活化的Ｓｅｐｇｈａｒｏｓｅ４Ｂ偶联,通过免疫亲合层析分离血清中肺癌胰蛋白识别分子,并对其理化特性和免疫学特性进行了初步研究。结果肺癌血清中存在识别肺癌胰蛋白的活性分子,其相对分子质量约为７００００、６６０００、１５２００;经特异蛋白分析仪分析,提示为一类与抗体无关的免疫识别分子;细胞抑制试验证实,在１０～４０１ｍｇ／Ｌ（终浓度）时,能够抑制ＧＬＣ－８２细胞生长,抑制率为２４．４％～３７．２％;细胞毒试验证实,在５～２０ｍｇ／Ｌ（终浓度）时能够提高ＬＡＫ细胞对ＧＬＣ－８２细胞杀伤活性,杀伤率为２８．３１％～２８．８８％,对照组为１５．６３％（Ｐ＜０．０５）。结论提示肺癌病人血清中存在肿瘤免疫识别物质和抗肿瘤免疫反应,并且具有双向调控肿瘤细胞生长的作用。     

槲皮素诱导人肺癌GLC-82细胞凋亡及机制

目的：探讨黄酮类中药成分槲皮素（Quercetin）对人肺癌GLC-82细胞生长抑制和凋亡的影响.方法：采用细胞培养技术,用不同浓度的槲皮素作用GLC-82细胞48 h,用Hoechst33258染细胞核,在荧光显微镜下观察凋亡细胞核形态变化,用QWin图像分析软件测量细胞核面积和凋亡率.采用MTT法测定细胞的生长能力.采用荧光免疫细胞化学SABC-Cy3法检测Mdm2、p53、Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表达,用QWin图象分析软件测定Mdm2、p53、Bax、Bcl-2和caspase-3荧光强度值.结果：槲皮素剂量依赖性的抑制GLC-82细胞生长,呈现典型的凋亡形态学特征,胞核缩小,核质浓集,呈斑块状,有凋亡小体.上调凋亡抑制因子Mdm2和Bcl-2蛋白表达,下调凋亡促进因子Bax和Caspase-3的蛋白表达,对p53蛋白表达量没有明显影响.增加Mdm2、p53、Bax、Bcl-2的阳性表达率,降低caspase-3阳性表达率.结论：槲皮素能够抑制肺癌GLC-82细胞生长并诱导细胞凋亡,而Mdm2的蛋白表达增加,可能抑制了p53发挥促凋亡作用,使部分GLC-82肺癌细胞逃避死亡.     

非小细胞肺癌组织中p16基因表达的意义

目的探讨p16基因蛋白在人非小细胞肺癌组织中的表达情况。方法应用免疫组化SP法检测45例非小细胞肺癌组织、21例肺良性疾病组织中p16基因蛋白的表达情况。结果肺良性疾病中p16蛋白阳性率85．7％,高于肺癌组织的51．1％,差异有统计学意义（P=0．004）;p16蛋白表达阳性率肺癌Ⅰ、Ⅱ期高于Ⅲ、Ⅳ期,无淋巴结转移者高于有淋巴结转移者（P〈0．05）。结论p16基因蛋白的表达情况与非小细胞肺癌的发生、发展有关。