荧光偏振方法快速检测HPV16 E7第29位密码子点突变

目的:通过TDI-FP方法检测宫颈病变组织中HPV16 E7基因第29位密码子突变(A→G)并探讨其与宫颈癌的相关性,同时建立一种HPV点突变检测的新方法. 方法:以53例HPV16阳性宫颈组织为研究对象.首先PCR扩增含待检测位点的靶基因片段,然后用TDI-FP方法检测荧光素碱基的掺入情况,判断所研究位点的基因型. 结果:宫颈浸润癌组织中HPV16 E7第29位密码子的突变率为43.48%(10/23),对照组为10.00%(2/20),病例组为39.39%(13/33),组间突变率差异有显著性(P<0.05).该法与随机抽查标本测序结果一致率为100%. 结论:本研究中HPV16病毒发生E7第29位密码子突变的情况与其他地区相比存在差异;HPV点突变TDI-FP检测方法是一种快速简便、高通量的基因突变检测技术.     

湖北地区22例宫颈癌组织中HPV 16型LCR基因变异特点分析

目的:研究人乳头瘤病毒(HPV)16型LCR基因在湖北地区部分宫颈癌组织中的变异特点,通过系统发生学分析探讨宫颈癌患者感染的HPV16型变异株的流行型别及特征。方法:从22例宫颈癌手术切除标本中提取组织DNA,用HPV16LCR特异性引物进行PCR扩增,对扩增的LCR产物片段进行测序,用Paup 4.0软件使用邻接法对HPV16变异株进行系统发生学分析。结果:在22例宫颈癌组织中LCR基因存在着12个位点的基因变异。高频率突变位点有5个。其中第7 521位核苷酸由G变异为A,变异频率为100%;第7 730位核苷酸由A变异为C,变异频率为86.4%,第7 842位核苷酸由G变异为A,变异频率为77.3%,第7 714位由T变异为G,变异频率为31.8%;第7 930位核苷酸由C变异为T,变异频率为31.8%。HPV 16LCR中的5个高频位点,均位于可与多个转录因子结合的区域。对LCR基因进行的系统发生学分析表明,湖北地区流行的HPV16病毒株主要为亚洲型(As)变异体(77.2%),其次为欧洲型(E)(22.8%),没有发现非洲-1型(Af-1),非洲-2型(Af-2)和亚洲美洲型(AA)HPV16变异体。结论:湖北地区宫颈癌组织中LCR存在着一定程度的基因变异,其中一些高频位点与国内、外报道的结果有明显差异,可能是湖北地区LCR的突变热点。     

重庆地区1例宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6,E7基因的结构和变异

目的：报告1例重庆地区宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6，E7基因的结构及其变异，方法：应用聚合酶链式反应（PCR）从宫颈癌组织扩增出人乳头瘤病毒16型重庆株E6，E7基因，分子克隆技术进行基因的克隆，测序。结果：成功地扩增出重庆地区宫颈癌人乳头瘤病毒16型株E6，E7基因，并克隆于质粒载体pBKS( )，结论：该例宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6，E7与标准株HPV16 E6，E7基因的长度相同，E6基因无变异，但E7基因有两处点突变。     

GST-HPV16E7融合蛋白的原核表达与纯化

目的 构建HPV16地方株E7基因原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并进行纯化.方法 将成都本地某宫颈癌患者所感染的HPV16 E7全长片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组子pGEX-4T-1-HPV16E7,转化宿主菌E.coli BL-21.经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE、Western blot分析证实蛋白表达的特异性.并用GST亲和层析法对融合蛋白进行纯化.结果 该患者所感染的HPV16为东亚株,成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-HPV16E7并表达出GST-HPV16E7融合蛋白,证实了蛋白表达的特异性,并获得了GST-HPV16E7融合蛋白的纯品.结论 成功表达、纯化了本地流行株GST-HPV16E7融合蛋白,为进一步研究HPV16E7蛋白的功能奠定了实验基础.     

宫颈癌组织中HPV16 E7序列多态性分析

目的探讨广东地区宫颈癌组织中HPV16肿瘤相关性抗原E7基因序列的多态性.方法采用通用引物PCR直接测序法对宫颈癌标本中的HPV分型,从含有HPV16型的标本中采用自行设计的多重引物通过巢式PCR扩增出HPV16E7,经DNA序列测定法检测其基因变异,进而寻找其热点突变.结果50例宫颈癌组织HPV-DNA的检出率为78%,其中HPV16和HPV18型混合感染18例,单纯HPV16型感染15例.33例含有HPV16型的标本中扩增出25例HPV16E7,其中17例647位核苷酸“T”变异“C”,导致相应的蛋白质由天冬氨酸变异为丝氨酸.结论广东地区宫颈癌组织中HPV16E7DNA序列发生碱基替换的区域主要在647位至846位,热点突变点为Nt647和Nt846.     

L1、E6和E7基因序列分析

目的了解中国西南地区HPV16亚型基因的一级结构特点,为由HPV16亚型感染引起的疾病特别是宫颈癌的临床诊断、治疗提供理论依据。方法选取经分型明确为HPV16型感染的官颈癌组织32例,用PCR方法获得其E6、E7及L1基因的全长序列并进行测序分析。结果与德国标准株相比,32个标本中总共发现131（G—A）（Gly-Arg）、178（T—G）（Asp—Glu）、350（G-T）（Val—Leu）、647（A—G）（Asn-Asp）、846（T—C）（同义突变）、IA基因第966（C—T）（同义突变）、L1基因第1302（C-T）（同义突变）和L1基因第1434（A—G）（同义突变）等20个突变位。结论与标准序列比较,中国西南地区HPV16亚型L1、E6和E7基因存在一定范围变异,提示在预防治疗西南地区妇女宫颈癌病人以及研制该地区HPV疫苗时,需要注意这些位点的变异,特别是一些引起氨基酸变异的位点。     

TDI-FP法检测宫颈癌组织中HPV16E7基因647位点突变

目的:人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7基因的变异可能和HPV的致癌能力直接相关,E7 647位点的突变可能增强了致癌能力. 本课题通过应用TDI-FP法检测宫颈癌HPV16阳性标本中E7 647位点突变情况,可以对确定高危人群、恶性病变的预警筛查、辅助诊断、疗效判定及预后提供临床价值,并可以为宫颈癌及其癌前病变的基因治疗、疫苗治疗和预防提供分子水平方面的重要依据. 方法:TDI-FP技术是一种在聚合酶链反应的基础上具备液相探针杂交和碱基掺入三重特异反应的检测新方法,具有极高的特异性和敏感性. 本课题实验在TDI-FP方法的基础上检测宫颈癌患者HPV16 E7基因647位点突变情况,以进一步明确这些位点突变与宫颈癌变的相关性. 结果:应用TDI-FP法检测宫颈癌组织中HPV16型E7 647位突变率为32.35%,HPV16型E7 647位突变与对照组相比具有统计学差异(χ2=12.437,P＜0.001). 结论:本实验初步提示宫颈癌患者中HPV16型E7 647位突变可能是HPV致癌的一个高危因素.     

人乳头瘤病毒16 E7基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建pET-28a(+)-HPV16 E7原核表达质粒,并对其表达条件进行优化,为进一步研究HPV16E7致病机制及HPV疫苗提供相应的技术平台。方法:应用基因重组技术,构建pET-28a(+)与HPV16 E7(标准株和湖北株)的原核表达重组质粒,用PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒DNA进行鉴定,将其转入宿主菌E.coliBL21(DE 3)进行诱导以表达蛋白;SDS-PAGE及Western blot检测鉴定表达蛋白的分子量及特异性。优化诱导表达的条件,如温度、IPTG浓度、适用的培养基,探讨不同温度下蛋白的表达形式;纯化回收HPV16 E7蛋白。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV16 E7(标准株)蛋白得到高效原核表达,最佳表达条件:表达HPV16 E7的工程菌BL21(DE 3)的最佳诱导温度是37℃,诱导剂IPTG的浓度为0.3-0.4 mmol/L,最佳培养基为1.5倍LB。结论:pET-28a(+)-HPV16 E7标准株和湖北株重组载体构建成功,人乳头瘤病毒16 E7标准株获得高效原核表达。     

宫颈癌组织中HPV16E7序列多态性分析

目的 探讨广东地区宫颈癌组织中HPV16肿瘤相关性抗原E7基因序列的多态性。方法 采用通用引物PCR直接测序法对宫颈癌标本中的HPV分型,从含有HPV16型的标本中采用自行设计的多重引物通过巢式PCR扩增出HPV16E7,经DNA序列测定法检测其基因变异,进而寻找其热点突变。结果 50例宫颈癌组织HPV-DNA的检出率为78%,其中HPV16和HPV18型混合感染18例,单纯HPV16型感染15例。33例含有HPV16型的标本中扩增出25例HPV16E7,其中17例647位核苷酸“T”变异“C”,导致相应的蛋白质由天冬氨酸变异为丝氨酸。结论 广东地区宫颈癌组织中HPV16E7DNA序列发生碱基替换的区域主要在647位至846位,热点突变点为Nt647和Nt846。     

肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌的表达及其与HPV感染的关系

目的探讨肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中的蛋白表达以及人乳头瘤病毒(HPV)16E6、E7和HPV18E6/E7感染对其表达的影响。方法采用免疫组化SP法检测70例浸润性宫颈癌、15例原位癌、20例正常宫颈组织中KAI1蛋白的表达,采用PCR扩增-琼脂糖凝胶电泳法检测浸润性宫颈癌组织中HPV16E6、E7和HPV18E6/E7的DNA状况。结果宫颈浸润癌及原位癌组织中的KAI1蛋白表达与正常宫颈上皮中的表达相比明显下调(P<0.05),原位癌与浸润癌中的表达差异无统计学意义;HPV16E6、E7和HPV18E6/E7在浸润性宫颈癌中的阳性率分别为67.1%、54.3%和12.9%,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染与宫颈癌中的KAI1蛋白表达无相关性。结论肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中呈下调表达,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染不影响其表达。     

宿主p53基因多态性与HPV16感染、宫颈癌发生发展的相关性

目的 研究宿主p53基因多态性（p53基因第4外显子72位密码子,rs1042522）与HPV16感染、宫颈癌发生发展的相关性.方法 采用TaqMan SNP Genotyping Assays方法进行p53基因多态性（p53基因第4外显子72位密码子）分析.结果 p53基因第4外显子72位密码子的基因型频率和等位基因频率在病例组与HPV16感染组、对照组之间差异有统计学意义（P＜0.01）;但基因型频率和等位基因频率在对照组与HPV16感染组之间无统计学差异,P值分别为0.924和0.870.结论 p53基因第4外显子72位密码子突变与HPV16感染无明显相关性,但是该突变与宫颈癌的发生有相关性.     

TGF-β_1的表达、HPV16 E7基因多态性与宫颈癌的相关性

目的:探讨宫颈病变中TGF-β1的表达、HPV16E7型内变异与宫颈癌的关系。方法:对宫颈组织标本[39例宫颈鳞癌,34例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅱ-Ⅲ级与64例CINⅠ级宫颈组织]进行免疫组化法观察TGF-β1蛋白表达,同时多重HPV16E7引物进行巢式PCR扩增,并选择阳性扩增的基因片段DNA进行纯化、测序,检测基因变异。结果:TGF-β1的阳性率在CINⅠ组、CINⅡ-Ⅲ组、浸润癌组中分别为:14.06%,41.18%,82.05%,其表达与宫颈病变的进展程度呈正相关(P<0.001,r=0.556)。在宫颈鳞癌临床分期各组别中,TGF-β1的阳性率在Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb组中依次增高(P=0.024)。检测到HPV16E7阳性样本共55例(CINⅠ组9例、CINⅡ-Ⅲ组14例和浸润癌组32例),其中原型15例。HPV16E7基因突变株最常见的为T846C变异株,该变异株在CINⅠ、CINⅡ-Ⅲ和鳞癌组中突变频率分别为66.67%、78.57%、81.25%,总检出率为78.18%。TGF-β1的表达在HPV16E7原型组和在HPV16E7A647G突变株组中无统计学差异(P=0.456)。结论:TGF-β1的表达与宫颈鳞癌的发生发展呈正相关,TGF-β1可能成为宫颈癌早期防治检测指标之一。HPV16E7A647G突变株较原型未通过改变TGF-β1介导的信号途径影响其致瘤性。     

HPV16E7基因的原核克隆及表达

目的:探讨从喉癌组织中HPV16 E7蛋白的原核克隆及表达.方法:采用PCR方法扩增HPV16 E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET28a(+)载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选.经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况.结果:成功构建了原核表达质粒pET28/E7、HPV16 E7融合蛋白在BL21(DE3)菌株中高效表达.结论:HPV16 E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

HPV16相关宫颈癌细胞系和组织中E7和DRR1蛋白的表达

目的:研究人乳头瘤病毒16(HPV16)相关宫颈癌细胞系和组织中E7和肾细胞癌下调基因1(DRR1)表达的关系。方法:以HPV16 E7阳性的宫颈癌Ca Ski和Si Ha细胞、HPV16 E7阴性的宫颈癌C-33A细胞及184例宫颈鳞状细胞癌组织为研究对象,采用Western blot方法和免疫组化染色方法检测E7和DRR1蛋白的表达,分析E7与DRR1蛋白表达的关系。结果:Western blot结果显示,C-33A细胞中HPV16 E7无表达,DRR1蛋白的表达显著高于Ca Ski细胞和Si Ha细胞(F=454.982,P<0.001);Ca Ski细胞和Si Ha细胞表达HPV16 E7,二者DRR1蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化染色结果显示,HPV16 E7阳性宫颈鳞状细胞癌组织141例,其中DRR1蛋白阳性34例;HPV16 E7阴性宫颈鳞状细胞癌组织43例,其中DRR1蛋白阳性32例;HPV16 E7阳性组织中DRR1蛋白的表达显著低于HPV16 E7阴性组织(χ2=36.250,P<0.001)。结论:DRR1可能是HPV16 E7作用的潜在靶基因。     

宿主p53基因多态性与HPV16 感染、宫颈癌发生发展的相关性

［摘要］目的　研究宿主p53基因多态性（p53基因第4外显子72 位密码子,rs1042522）与HPV16 感染、宫颈癌发生发展的相关性．方法　采用TaqMan SNP Genotyping Assays 方法进行p53基因多态性（p53基因第4外显子72 位密码子）分析．结果　p53基因第4外显子72 位密码子的基因型频率和等位基因频率在病例组与HPV16感染组、对照组之间差异有统计学意义（P＜0.01）;但基因型频率和等位基因频率在对照组与HPV16感染组之间无统计学差异,P值分别为0.924和0.870．结论　p53基因第4外显子72 位密码子突变与HPV16感染无明显相关性,但是该突变与宫颈癌的发生有相关性．     

人乳头瘤病毒16型E7基因的原核克隆与表达

目的:研究人乳头瘤病毒(Human papillomavirus HPV)16型E7在原核表达系统中的表达情况和活性,为制备HPV16型E7蛋白疫苗奠定实验基础.方法:通过聚合酶联反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从HPV16 DNA阳性的宫颈癌组织中扩增HPV16 E7全长基因,进一步将其克隆入原核表达载体pET32a( ),并构建重组质粒pET32a( )/HPV16 E7,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达的融合蛋白,用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTA Agarose)纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法(Western blot,WB)分析鉴定.结果:测序证明成功构建重组质粒pET32a/HPV16E7,IPTG诱导下HPV16E7融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的16%,蛋白质印迹鉴定重组E7蛋白与表达载体的标签蛋白形成相对分子质量约30×103的可溶性融合蛋白.结论:重组质粒pET32a/HPV16E7在大肠杆菌BL21中高效表达目的蛋白.     

宫颈癌组织HPV16 URR及E7基因突变和序列多态性分析

目的 分析山东省青岛地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16)上游调控区(URR)和E7开放读码框(OFR)基因突变和基因序列多态性.方法 收集山东省青岛地区妇女宫颈癌标本共111例,提取DNA作为模板,应用通用引物和型特异引物经聚合酶链反应(PCR)筛选HPV16阳性标本,PCR结合测序检测HPV16阳性标本URR和E7基因全序列,经DNAStar 100软件和在线BLAST分析其变异情况.结果 宫颈癌组织中HPV和HPV16感染率分别为99.10%(110/111)和73.63%(81/110);核苷酸水平上HPV16 URR形成24种变异模式,同源性在98.02%～99.26%之间,nt7518 G→A和nt7861 A缺失变异率均为100%(26/26).HPV16 E7形成12种变异模式,同源性在99.23%～100%之间;nt647 A→G突变率58.54%(24/41),氨基酸由Asn→Ser(N29S)、nt666 G→A突变率24.39%(10/41),为同义突变.结论 山东省青岛地区妇女宫颈癌组织中HPV16 URR和E7基因均存在变异;HPV16 URR突变热点为nt7518和nt7861,HPV16 E7突变热点为nt647,且二者尚存在未见报道的变异位点.     

深圳地区人乳头瘤病毒18型E6E7基因的克隆、序列分析及E6/E7融合基因的构建

目的克隆人乳头瘤病毒18型E6E7基因序列,构建E6/E7融合基因,为HPV治疗性疫苗的研制打下基础。方法采用PCR技术扩增1例HPV18阳性患者组织中HPV18 E6E7基因。将PCR产物回收,插入pSC-A质粒载体构建pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒并进行核酸限制性内切酶鉴定及DNA测序分析;通过点突变方法使HPV18 E6、E7基因的开放读码框(ORF)融合以简化后续的基因表达问题。结果成功构建了pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒,测序分析表明克隆的HPV18 E6E7基因与GenBank收录的德国株(AY262282)完全一致,点突变成功使E6基因的终止密码子突变,使HPV18 E6、E7基因融合。结论本研究获得了正确的HPV18 E6E7基因,为其重组表达及其相关研究奠定了良好基础。     

深圳地方株人乳头瘤病毒18型E6E7基因的克隆、序列分析及E6/E7融合基因的构建

[摘要] 目的 克隆人乳头瘤病毒18型E6E7基因序列,构建E6/E7融合基因,为HPV治疗性疫苗的研制打下基础。方法 采用PCR 技术扩增1例HPV18阳性患者组织中HPV18 E6E7基因。将PCR产物回收,插入pSC-A质粒载体构建pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒并进行核酸限制性内切酶鉴定及DNA测序分析;通过点突变方法使HPV18 E6、E7基因的开放读码框(ORF)融合以简化后续的基因表达问题。结果 成功构建了pSC-A/HPV18E6E7重组质粒,测序分析表明克隆的HPV18 E6E7基因与GenBank收录的德国株(AY262282)完全一致,点突变成功使E6基因的终止密码子突变,使HPV18 E6、E7基因融合。结论 本研究获得了正确的HPV18 E6E7基因,为其重组表达及其相关研究奠定了良好基础。     

宫颈癌组织中HPV16 E6、E7蛋白水平与患者临床病理特征及预后的关系

目的 探究宫颈癌组织中16型人乳头瘤病毒E6蛋白（human papilloma virus type 16 E6 protein,HPV16 E6）、16型人乳头瘤病毒E7蛋白（human papilloma virus type 16 E6 protein,HPV16 E7）水平与患者临床病理特征及预后的关系。 方法 选取行宫颈癌根治术87例患者的肿瘤组织、癌旁组织、正常宫颈组织标本进行研究,采用免疫组织化学法检测组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达情况,并结合患者临床病理特征进行分析,采用Kaplan-Meier生存曲线比较患者3年生存情况,采用COX回归分析各项因素对患者预后的影响。 结果 免疫组化结果显示肿瘤组织中HPV16 E6、HPV16 E7阳性率高于癌旁组织和正常组织（P＜0.05）; HPV16 E6及HPV16 E7蛋白阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者（P＜0.05）;多因素分析显示HPV16 E6、HPV16 E7阳性是宫颈癌患者预后不良的独立危险因素（P＜0.05）。 结论 HPV16 E6、HPV16 E7蛋白在宫颈癌组织中阳性表达,与患者临床病理特征和预后相关,可能作为治疗宫颈癌的新靶点发挥作用。