人胰岛素样生长因子在pET-DsbA载体中的克隆及表达

目的 通过重组技术,对胰岛素样生长因子IGF-Ⅰ基因进行缺失、突变以获得最有利于高水平表达的IGF-Ⅰ cDNA.构建原核表达载体,并进行表达,以获得能够高水平表达高活性产物的基因工程菌珠.方法 提取人肝脏组织总RNA,RT-PCR后琼脂糖电泳初步鉴定产物.将cDNA回收、补平后插入克隆质粒KS,酶切鉴定后,对IGF-Ⅰ基因进行序列分析.采用PCR法从克隆质粒中扩增IGF-Ⅰ片段,亚克隆至pET-DsbA原核表达载体,酶切鉴定,并进行序列测定.转化到大肠杆菌BL21(DE3)PLysS中,IPTG诱导表达,聚丙稀酰胺凝胶电泳、Western Blot分析目的蛋白.结果 成功构建原核表达载体pET-DsbA-IGF-Ⅰ,测序结果与预期序列完全一致,并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS表达出IGF-Ⅰ融合蛋白.结论 IGF-Ⅰ融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3) PLysS中的表达,对进一步研究IGF-Ⅰ的功能及开发其生物制品具有重要意义.     

荧光蛋白标记的促红细胞生长素融合蛋白的设计和预测

目的：探讨pTRE顺式作用元件调控，EGFP标记hEPO(hEPO-EGFP)融合蛋白设计的合理性。方法：应用Gene Construction Kit2．5、www．expasy．com网站提供的分析方案，分析重组体的开放读框以及融合蛋白的柔性．并作蛋白质二级结构模拟。结果：重组体的转录受pTRE顺式作用元件调控，Linker所在部位柔性高，融合蛋白表达后，二级结构预测Linker不改变蛋白结构，完全符合作者设计EGFP标记hEPO融合蛋白的初衷。结论：重组蛋白设计合理，融合蛋白有很大可能保留了hEPO和EGFP的理化特性，为进一步的实践操作提供了可靠的理论基础。     

重组人组织激肽释放酶基因转染人脐静脉内皮细胞

目的探讨重组人组织型激肽释放酶(HK)基因腺相关病毒载体(rAVV/HK)对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作用.方法将HK基因定向克隆入腺相关病毒质粒pAAV-MCS中,形成重组腺相关病毒(rAAV-HK)质粒,经聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序后,将rAAV-HK、pAAV-Helper和pAAV-RC 3种质粒通过脂质体共转染293细胞,包装成带有HK目的基因的重组rAVV/HK,采用β半乳糖苷酶原位染色法测定报告基因rAVV/LacZ在HT1080中的表达,间接计算病毒滴度,并观察转染基因在传代细胞中的表达.在相同的条件下体外分别培养HUVECs(对照组)和rAVV/HK转染的HUVEC(HK转染组)48 h,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测两组HUVECs HK mRAN的表达,并利用硝酸还原酶法和分光光度法分别检测两组HUVECs一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性.结果 rAVV/HK病毒滴度为6.2×107个/mL,LacZ基因能够在第一传代和第六代HT1080细胞内稳定持续表达.与对照组比,HK转染组HUVECs HK mRNA表达增加(P<0.001);而且HK转染组HUVECs细胞培养液中NO的含量和NOS活性明显增高,P值分别<0.01和<0.05.结论 HK基因通过重组腺相关病毒载体可成功转染体外培养的HUVECs,使其HK mRNA表达增加,NOS活性和NO含量升高,此结果为基因治疗人类血管内皮细胞异常提供客观依据.     

核酸杂交检测HBV DNA及基因分型

检测血清中HBVDNA并进行基因分型。采用聚合酶链反应（PCR）扩增HBV DNA后，采用不同的探针，利用微板杂交法将其分为六个亚型。50例广东地区HBVDNA阳性病人中C型占68％（34例），B型占10％（5例），D型占6％（3例），F型占2％（1例），另有8％为混合型（3例BC，1例BCD），没有发现A型和E型，3例分型结果阴性，为未定型。广东地区HBV基因亚型以C型为主，B型次之，其它较少。可能存在其他亚型。     

肾脏疾病基因治疗研究进展

本文简要综述目前基因治疗常用载体系统的优、缺点，以及针对肾脏进行基因转移的策略和应用前景。     

维持性血液透析患者经血液传播嗜肝病毒感染状况

目的：探讨血液透析（血透）患者HBV,HCV,HDV,HGV和TTV等经血液传播的肝炎病毒感染状况。方法;对80例长期维持性血透患者和12位血透工作人员应用ELISA法检测HBV两对半及HCV,HDV抗体;逆转录－套式PCR检测血清HGV RNA;巢式PCR检测TTV DNA。结果：80例患者中,经血液传播肝炎病毒感染51例（63.8%),其中HBV阳性21例（22.5％）,未检出HDV,HGV阳性15例（18.7％）,TTV阳性28例（35％）。二重或二重以上感染18例（22.5％）,其中二重感染12例（15.2%) ,三重感染4例（5％）,四重感染2例（2.5％）。HBV单独感染8例（10％）,合并HCV感染4例（5％）,合并TTV感染4例（5％）;与HGV和TTV三重感染3例（3.8％）,与HCV,HGV和TTV四重感染2例（2.5％）。HCV单独感染10例（12.5％）,合计TTV感染1例（1.2％）;与HGV和TTV三重感染1例（12.5％）。HGV单独感染8例（10％）,合并TTV感染2例（2.5％）。TTV单独感染15例（18.8％）。12例工作人员HBV,HCV,HDV和HGV检测均阴性,1例TTV阳性。与非输血组相比,输血 组除HDV外,HGV,HBV,HCV和TTV的感染率明显增加,均P＜0.05。结论：血液透析患者经血液传播性肝炎病毒感染严重,重叠感染率高,其高发生率与输血有关。     

系统性红斑狼疮患者血清IL-18和sFas/sFasL的变化及相关性研究

系统性红斑狼疮 (ｓｙｓｔｅｍｉｃｌｕｐｕｓｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ ,ＳＬＥ)是典型的自身免疫性疾病 ,免疫学特征为体内大量自身抗体的产生。最近越来越多的研究表明这些自身抗体的产生与ＳＬＥ病人体内淋巴细胞凋亡紊乱有关。Ｆａｓ和ＦａｓＬ作为凋亡的抑制因子和诱导因子 ,ＩＬ 18则可直接增强ＦａｓＬ介导的Ｔｈ1细胞毒效应 ,参与Ｔ淋巴细胞的凋亡发生。本研究采用ＥＬＩＳＡ检测了 4 5例ＳＬＥ患者血清中ＩＬ 18和ｓＦａｓ及ｓＦａｓＬ水平 ,以探讨ＩＬ 18和Ｆａｓ ＦａｓＬ在ＳＬＥ发病中的作用机制及ＩＬ 18和Ｆａｓ ＦａｓＬ…     

饲克山病病区粮大鼠血清和组织维生素E含量的改变

在克山病病因学研究中,目前人们普遍认为低硒(Se)是其发病的主要因素之一。最近,王凡等提出,维生素E(VE)和Se的共同缺乏是克山病发病的基本因素。但在克山病发病中,VE和