实时荧光定量PCR检测核糖体蛋白S13基因在NK/T细胞淋巴瘤中的表达

目的应用实时荧光定量PCR技术检测NK／T细胞淋巴瘤核糖体蛋白S13（RPS13）基因的表达。方法提取石蜡包埋NK／T细胞淋巴瘤组织总RNA，逆转录为cDNA。应用实时荧光定量PCR技术检测NK／T细胞淋巴瘤RPS13表达水平。结果20例NK／T细胞淋巴瘤RPS13表达水平明显低于对照．结论RPS13基因表达水平明显低于正常人外周血淋巴细胞，这可能在NK／T细胞淋巴瘤发生、发展中起到一定作用。     

肝细胞癌组织中microRNA表达谱研究

目的 检测人肝癌组织和对应的肝硬化组织microRNA表达的差异谱,为研究microRNA在肝细胞癌变机制中的作用提供实验基础.方法 Trizol法提取25例配对的肝癌和肝硬化组织总RNA,microRNA芯片分析肝癌和肝硬化组织中差异表达microRNA,实时定量PCR验证芯片的结果 .结果 肝癌与肝硬化组织间差异表达的microRNA共12个,其中3个表达上调,9个表达下调.实时荧光定量PCR结果 与芯片一致.结论 肝癌和肝硬化组织存在差异表达的microRNA,这些上调和下调表达的microRNA可能参与了肝癌的发生.     

血清/血浆microrna检测方法探讨与建立

目的:观察实时荧光定量PCR技术检测血清/血浆microRNA表达水平的影响因素。方法:从样本来源、抗凝剂选择、样本储存时间等方面探讨实时荧光定量PCR技术检测血清/血浆miRNA表达的影响因素。结果:miRNA表达在血清和血浆中没有明显差异,样本储存时间对miRNA的表达没有明显影响,但使用肝素抗凝会明显抑制miRNA的表达。结论:成功建立了一套标准化的血清/血浆miRNA表达检测方法。     

实时荧光定量PCR检测原发性肝癌中CDK4基因的表达

目的：应用实时荧光定量PCR法检测原发性肝细胞癌中CDK4基因的表达。方法：提取手术切除人肝癌和癌旁组织总RNA并逆转录为cDNA。应用实时荧光定量PCR法观察人肝细胞癌组织及癌旁组织中cDK4的表达水平。结果：20例肝细胞癌标本中有18例肿瘤组织中CDK4基因表达明显高于癌旁肝组织，其中7例高出4倍以上。结论：实时荧光定量PCR可以准确定量测定基因的表达；CDK4基因在肝细胞癌的发生、发展中可能起重要作用。     

Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。结果:重组质粒经PCR扩增及序列测定表明,pGMT/Satb2基因已成功克隆。结论:所构建的pGMT/Satb2基因实时荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此法可作为实时荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞CD_(58)基因的表达

目的:应用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)CD58基因的表达。方法:提取PBMC总RNA并逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR法分别检测43例HBV感染者及11例正常对照的PBMCCD58基因的表达水平,同时检测血清ALT、AST水平。结果:乙型肝炎各组患者PBMCCD58mRNA表达水平较正常对照组明显增高,差异均有显著性。乙型肝炎患者PBMCCD58mRNA水平与血清ALT、AST呈显著正相关。结论:实时荧光定量PCR可以准确定量检测基因的表达;乙型肝炎患者PBMCCD58基因表达水平与疾病严重程度及肝细胞损伤严重程度有关。     

快速高效从石蜡包埋肿瘤组织中提取micro-RNA方法的研究

目的探索一种从石蜡包埋组织标本中快速、便捷、低成本的提取miRNAs的方法。方法收集2年内石蜡包埋的人乳腺癌组织和保存6个月的MMTV基因工程小鼠乳腺癌组织石蜡样本,同时选用进口A公司生产的提取石蜡组织miRNAs试剂盒作为对照;通过2种方法提取人和鼠的石蜡切片中miRNAs做对比分析,包括采用凝胶电泳验证,检测miRNA纯度、浓度分析。为了进一步验证其提取效果,采用定量PCR对所提取的总miRNAs进行miRNA-375和miR-218检测。结果①采用本实验方法从石蜡包埋乳腺癌组织中提取的miRNAs其纯度在1．86—2．210D之间,其浓度可以满足常规实验要求（最低38．50mg／L）;②荧光定量PCR能够检测到miRNA-375和miRNA-218,其拷贝数与对照组比较,2种方法差异无统计学意义（P〉0．05）。③该方法提取时间短、成本低,成本是试剂盒法的1／10,提取时间至少节省1／3。结论从石蜡包埋组织标本中提取miRNAs方法切实可行,为从石蜡组织样本提取miRNA进行分子诊断和肿瘤相关的研究提供了便利,对采用回顾性石蜡标本研究miRNAs提供了有力的帮助。     

肝癌石蜡包埋组织miRNA提取方法的优化

目的改进并优化从肝癌(HCC)甲醛固定石蜡包埋组织(FFPE)提取并检测微小RNA(miRNA)的方法。方法使用miRNeasy FFPE试剂盒探讨提取HCC石蜡组织miRNA最佳切片厚度及蛋白酶K作用时间。实时定量RT-PCR检测miR-221、miR-146a、let7-a、miR-191、miR-103及RNU6B的表达量。将HCC细胞制成石蜡组织,对比同一细胞系新鲜细胞及石蜡包埋细胞的各个miRNA表达量差异。结果切片厚度30μm,蛋白酶K作用时间48h时提取miRNA效果最佳。各HCC细胞系及临床HCC石蜡组织均有不同水平的miRNA-221、miR-146a、let7-a、miR-191、miR-103及RNU6B表达。同一细胞系新鲜细胞与石蜡包埋后的各miRNA表达无明显差别。结论改良后的miRNeasy FFPE提取方法能提取石蜡组织中的miRNA,可重复性强,可推广用于临床各种石蜡包埋组织的miRNA提取。     

荧光定量PCR与半定量PCR检测猕猴不同器官组织中黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因的mRNA表达差异的比对

目的 分析荧光定量PCR 与半定量PCR 检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中黄嘌呤氧化脱氢酶（XDH/XO）的mRNA的相对表达量的差异,其结果具有一定的参考价值。方法 提取健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中总RNA,使用相同的引物序列及内参基因,分别用荧光定量PCR 与半定量PCR 进行相对定量检测,结果做比对分析。结果 两种检测方法的特异性没有差异,荧光定量PCR较半定量PCR灵敏性高,均显示猕猴不同组织XDH/XO的mRNA表达在肝脏组织中表达水平最高,对于表达量较低的其他组织,荧光定量PCR 与半定量PCR检测结果有一定差异。结论: 荧光实时定量PCR优于半定量PCR 法。     

Aurora-B在胶质瘤中的表达及其意义

目的 探讨丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员Aurora-B在脑胶质细胞瘤中的表达及其意义.方法 常规提取41例胶质瘤及11例正常脑组织中总RNA.在总RNA被逆转录成cDNA后,利用实时荧光定量PCR比较Aurora-B基因mRNA在胶质瘤组织与正常脑组织中表达差异;随后利用免疫组化的方法验证Aurora-B蛋白在胶质瘤组织与正常脑组织之间的表达差异.结果 实时荧光定量PCR检测发现,在mRNA水平,Aurora-B基因的表达在胶质瘤组织中明显高于正常脑组织.免疫组化检测后发现,Aurora-B蛋白在胶质瘤组织细胞核内呈高表达,这与mRNA表达特征相一致.结论 Aurora-B基因mRNA和蛋白在胶质瘤组织中明显高表达,其可能是胶质瘤发病过程中的恶性标志物之一.     

实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA表达水平

目的探讨实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌乒,以表达的方法。方法以BB270femA基因表达为标准,建立实时荧光定量PCR方法,对实验菌株femA表达进行相对定量。结果建立的实时荧光定量PCR方法所得结果标准曲线线性关系好,熔解峰单一。随MIC变化,金黄色葡萄球菌femA表达水平也随之变化。结论用实时荧光定量PCR方法研究金黄色葡萄球菌femA表达量结果可靠、敏感、重复性好。     

微小RNA在直肠癌组织中的表达及其临床意义

目的研究微小RNA（MicroRNA）在直肠癌组织与正常直肠组织中的表达差异。方法提取60例直肠癌及癌旁正常组织中总RNA,对标本中MicroRNA表达状况应用实时荧光定量PCR方法进行检测。对其他20例直肠癌组织及其癌旁正常组织应用问题分析（PAM）法进行定性判断。结果在直肠癌发生过程中有41种MicroRNA表达量显著下降（〈0.66）。对20例直肠癌组织应用PAM法进行定性判断的结果与病理检查结果基本一致。结论 MicroRNA与直肠癌联系密切,可以成为直肠癌早期预测和诊断的有效手段。     

建立RQ-PCR方法检测急性早幼粒细胞白血病患者６种不同PML/RARα异构体

［摘要］目的: 建立检测急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia, APL）患者PML/RARα融合基因６种特异性异构体（bcr1/2、P4R3、P46R3、bcr3及P2R3）的实时定量PCR（RQ-PCR）技术,并评价其特异性。方法: 设计不同异构体的特异性引物和探针,建立异构体特异性RQ-PCR方法对６种特异性异构体PML/RARα阳性模板进行扩增,评价异构体定量检测的特异性,并检测10例APL患者中不同异构体的含量。结果： 所建立的各异构体特异性RQ-PCR法最大敏感性均达10拷贝/μL,但其重复性较差,108~102拷贝/μL阳性模板的重复性良好,正常对照及空白对照无扩增信号,每个异构体特异性RQ-PCR均不能扩增其他异构体。5例长型（bcr1）和1例变异型（bcr2）阳性APL患者中bcr1/2异构体表达量为7.71%~89.71%（中位数13.70%）,P4R3异构体表达量为0.71%~16.26%（中位数4.48%）,P46R3异构体表达量为3.57%~14.09%（中位数6.33%）。4例短型（bcr3）患者中bcr3异构体表达量为21.43%~197.04%（中位数100.69%）,P2R3异构体表达量为0.34%~9.07%（中位数2.45%）。1例短型患者经诱导治疗缓解后bcr3和P2R3异构体转录本明显下降,复发时又明显升高。结论： 检测PML/RARα异构体特异性RQ PCR方法敏感、可靠,可用于APL患者不同异构体的定量检测和微小残留病灶的随访监测。     

食管癌中高表达的钙结合蛋白1基因的序列分析及意义

目的:筛选食管癌中差异表达的基因,为进一步了解食管癌发生的分子机制奠定基础.方法: 利用荧光差异显示技术(DD-PCR)获得差异片段,对这些片段进行克隆和序列分析.通过在GenBank中同源性检索,查找差异片段相对应的同源基因.利用定量PCR检测验证该基因表达的差异性,并对该基因的结构进行预测和分析.结果:通过DD-PCR得到差异片段中的一个片段对应于人类钙结合蛋白1基因(Cabin1).荧光定量PCR技术检测结果表明钙结合蛋白1基因在食管癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织,在食管癌细胞株TE1中的表达量高于其他被测试的5种肿瘤细胞株.生物软件分析表明:该基因的读码框长6 663bp,编码2 220个氨基酸,至少有4种剪切方式.结论:Cabin1在食管癌组织及食管癌细胞中异常表达,可能在食管癌发生过程中起着重要的作用.     

蛋白激酶CK2β在食管癌中的表达及其临床意义

目的探讨蛋白激酶CK2β在食管癌组织中的表达及其在食管癌发生发展中的临床意义。方法采用免疫组化方法检测含
60对食管癌及其癌旁正常粘膜组织芯片中CK2β的表达水平。同时收集南方医院胸外科2012年2~4月期间手术切除的食管组
织标本10例,并提取蛋白和RNA,通过Western blot和实时荧光定量PCR的方法检测其CK2β的表达变化。结果CK2β在食管
癌组织中表达为：1.79%表达阴性,1.79%表达弱阳性,10.71%表达中阳性,85.71%表达强阳性;而正常粘膜组织96.67%表达阴
性,3.33%弱阳性。CK2β在肿瘤及癌旁正常组织中阳性表达的分布有显著差异（P<0.001）。CK2β蛋白在食管癌中的表达水平
与TNM分期显著相关（P=0.010）。Western blot及荧光定量PCR同样证实了食管癌组织中的蛋白激酶CK2β的表达水平明显升
高。结论蛋白激酶CK2β的表达与食管癌的发生发展及其恶性程度显著相关。
     

高迁移率蛋白A2在浆液性卵巢癌中高表达及其与let-7家族microRNA的关系

目的：检测高迁移率蛋白A2（high mobility group A2, HMGA2）、let-7家族microRNA和P53在浆液性卵巢癌中的表达,分析HMGA2和let-7家族microRNA的关系,比较HMGA2与P53在浆液性卵巢癌中的表达情况。方法：用免疫组织化学方法检测50例卵巢癌和4例正常输卵管石蜡包埋标本中HMGA2和P53蛋白的表达,采用实时荧光定量逆转录-PCR方法检测对应标本以及卵巢癌细胞系中HMGA2 mRNA和let-7家族microRNA的表达。结果：HMGA2 和P53在浆液性卵巢癌中免疫组织化学染色阳性率分别为70%（35/50）和78%(39/50)。HMGA2在输卵管纤毛上皮中有微弱表达,在分泌型上皮细胞中不表达;HMGA2的表达存在随着肿瘤病理分级的增高而增高的趋势,但与肿瘤临床分期没有关系。HMGA2 mRNA在所有卵巢癌标本中均能检测到,但在72%（36/50）的标本中表达量高于正常输卵管组;恶性程度高的细胞系（SKOV3.ipl）比恶性程度低(SKOV3)的细胞系HMGA2 mRNA表达更高。let-7家族各成员在所有浆液性卵巢癌标本中均表达,其表达量与HMGA2 mRNA呈低度负相关(r=-0.305,P＜0.05)。结论：HMGA2可能与P53一样,可以作为浆液性卵巢癌的生物标志物,其表达与浆液性卵巢癌恶性程度有关。let-7表达降低是HMGA2在浆液性卵巢癌中高表达的一种、但非唯一机制。     

风疹病毒RNA Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法及参考标准的建立

目的建立风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。方法设计引物与探针,优化PCR条件,建立风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法,并制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。结果制备的风疹病毒特异性扩增子参考标准品为503 bp的片断,原液浓度为2.75×109copies/μl,纯度为92%;采用该特异性扩增子参考标准品建立的标准曲线相关系数r为-0.9993（r2=0.9986）,P〈0.001。结论本研究建立的风疹病毒特异性扩增子参考标准品稳定性好,纯度高;特异性扩增子参考标准品浓度的对数值与Ct值之间具有良好的线性关系,证实了本研究建立的风疹病毒RNATaqMan实时荧光定量RT-PCR方法定量的准确性。因而,建立的风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法简便快捷、定量准确,可用于临床标本中风疹病毒RNA的定量检测。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测前列腺癌抗原3mRNA表达水平

目的采用SYBR Green I实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,建立检测前列腺癌抗原3(DD3)mRNA的标准,定量检测人体不同组织中该基因的表达水平。方法从LNCaP细胞中采用RT- PCR法扩增特异性DD3基因片段,将其与pMD18-T载体连接,转化宿主菌JM109,对质粒标准进行聚合酶链反应(PCR)检测及测序。纯化后检测质粒拷贝浓度,制备梯度浓度标准品。应用LightCycler荧光定量PCR仪对标准品进行检测。取正常人乳腺组织、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢、正常前列腺组织、前列腺增生及前列腺癌组织,定量检测DD3 mRNA表达。结果建立稳定的检测DD3 mRNA的标准,正常人乳腺、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢中无DD3 mRNA表达,在正常前列腺及前列腺增生组织中低表达,两者间差异无显著性 (P>0．05);在前列腺癌中高表达(P<0．05)。结论应用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR技术检测 DD3 mRNA表达水平简便、可行、经济。DD3基因的表达具有良好的前列腺癌特异性。     

信号传导与激活因子2基因在食管癌中的表达

目的:筛选食管癌中特异表达的基因,进一步了解食管癌发生的分子机制。方法:利用荧光差异显示技术(DD-PCR)获得差异表达的片段,对这些片段进行克隆和序列分析。通过在基因库中同源性检索,查找差异片段相对应的同源基因。利用实时荧光定量PCR技术在食管癌临床标本中进行验证。结果:通过DD-PCR获得的差异片段中有一个片段对应于信号传导与激活因子2(stat2)基因,该基因的读码框长2556 bp,编码852个氨基酸,编码蛋白分子量约97.9 kD。应用实时荧光定量PCR方法进一步验证发现该基因在食管癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织(P<0.05,n=16)。结论:stat2基因在食管癌组织中呈高表达,推测其可能在食管癌的发生发展中起一定的作用。     

miRNA-192在人体手术切除肺癌组织中的表达及临床意义研究

［摘要］目的　发掘与肺癌相关的特异性miRNA用于肺癌的分型分期和预后判断．方法　对47例肺癌患者手术切除的肺癌组织和癌旁正常肺组织用SYBR Green实时荧光定量PCR对miRNA-192进行定量检测,比较肺癌组织和癌旁正常肺组织miRNA-192的表达是否有差异．结果　吸烟者,每天吸烟支数＞3支者,吸烟年数＞2 a及饮酒者的肺癌患者肺癌组织miRNA-192表达量较不吸烟、每天吸烟支数＜3支者,吸烟年数＜2 a及不饮酒者高．总的47个病例miRNA-192在肺癌组织中表达量△CT值为（8.19±2.94）,正常肺组织的表达量ΔCT值为（7.42±2.64）,经配对t 检验,P＞0.05 ,miRNA-192在肺癌组织中的表达与正常肺组织差异无统计学意义（P＞0.05）;经相关分析肺癌组织中的miRNA-192表达倍数与临床资料之间无相关关系．结论　 miRNA-192在具有吸烟及饮酒危险因素的人群中表达增高,可认为miRNA-192在肺癌的发生中具有一定的作用,但因总的47个病例的miRNA-192在肺癌组织和正常肺组织中表达差异无统计学意义,因此还无法确定miRNA-192是否属于肺癌的癌基因或抑癌基因,miRNA-192目前还不能用于肺癌的分型分期和预后判断．