大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养的适宜条件。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠骨髓MSCs,观察其形态,流式细胞仪检测细胞表面标记,MTT法观察不同浓度的胎牛血清(FBS)对MSCs生长曲线的影响及不同代MSCs的生长曲线和细胞贴壁率。结果:大鼠MSCs呈梭形或纺锤形,CD34、CD45表达阴性,CD44表达71.5%、CD166表达83.2%;MSCs用10%的FBS培养,其增殖明显高于用无血清、5%及20%的FBS培养;第1、3、5、10代MSCs的生长曲线及细胞贴壁率无明显差异(P>0.05)。结论:密度梯度离心法结合贴壁分离法适于大鼠MSCs的分离;10%的FBS适合MSCs的培养;早期传代对MSCs的增殖无影响。     

骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学鉴定

目的：建立体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的方法，描述MSCs的生物学特征，探索MSCs作为组织工程种子细胞的可行性。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法，分离纯化大鼠MSCs。利用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD14、CD29、CD34、CD45、CD105的表达率。取第4代MSCs进行成骨、成脂肪、成软骨诱导分化，观察细胞的形态变化情况，在诱导第14d进行茜素红染色和油红染色以检测MSCs是否分化成骨和脂肪细胞；在诱导第21d用阿新蓝染色法检测MSCs是否分化成软骨细胞。结果：从骨髓分离获得的MSCs为体积小、核浆比大、呈旋涡状生长的梭形细胞。第3代细胞表面标记物阳性率分别为CD14：0．67％，CD29：94．5％，CD34：0．72％，CIM5：0．39％，CD105：86．36％。MSCs在相应的诱导条件下，分化成骨、脂肪、软骨细胞。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法可分离出较纯的MSCs，经扩增培养后获取足够数量的MSCs，能满足组织工程的需要。MSCs具有多向分化的潜能，可在体外诱导分化成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，具有广阔的应用前景。     

慢性高原病患者骨髓间充质干细胞的体外扩增及鉴定

目的探讨慢性高原病（chronic mountain sickness,CMS）患者骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）的体外培养方法、生物功能及分子生物学特征。方法采用密度梯度离心和贴壁筛选法对15例CMS患者（CMS组）和15例正常人（对照组）骨髓MSCs进行分离培养,于倒置显微镜下观察MSCs形态,用流式细胞仪行细胞表面抗原检测,检测MSCs生长情况,测定生长曲线。结果采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞（BMMNC）后培养,骨髓MSC均分离培养成功,贴壁细胞呈梭形;两组骨髓MSCs均表达CD29、CD105和CD13,不表达CD45、CD4、CD8、CD14、CD3、CD34、HLA—DR和CD20。CMS组MSCs增殖能力高于对照组（P〈0．01）,但传代率低于对照组（P〈0．05）,对P3代细胞生长曲线进行观察发现CMS骨髓MSCs生长较对照组活跃。结论CMS患者骨髓MSCs在体外可有效分离培养,所培养扩增的细胞成分单一,CMS患者骨髓MSCs具有其特有的生物学特性。     

兔血管内皮祖细胞的体外获取

目的:探讨如何获得高浓度的兔血管内皮祖细胞(EPC).方法:抽取兔双下肢骨髓,应用Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞,进行体外培养、传代,应用细胞生长因子VEGF和bFGF联合诱导培养传代细胞,观察诱导前和诱导后第2代、3代细胞形态的变化,并对培养所得的细胞进行免疫细胞化学染色,观测CD34、CD133、CD31表达水平的变化.结果:培养细胞第2 d出现簇状贴壁生长,第4 d由圆形变成纺锤形,呈条索状排列.与诱导前相比,诱导后第2代细胞CD34、CD133和CD31阳性细胞率无明显变化,诱导后第3代细胞CD34细胞阳性率无明显改变,CD133细胞阳性率明显下降,CD31细胞阳性率明显升高(P均＜0.05).结论:兔骨髓源的单个核细胞可以在体外分离培养,诱导所得细胞具有EPC的特性.     

体外培养的婴幼儿MSCs生物学特性研究

目的 探讨体外分离和培养的婴幼儿骨髓间充质干细胞（MSCs）的基本生物学特性。方眭无菌条件下抽取先心病婴幼儿骨髓，经密度梯度离心、接种获得MSCs，观察其形态、贴壁率、克隆形成能力、超微结构和生长曲线，流式细胞仪检测细胞表面标记物。结果体外培养的MSCs3～4h后开始贴壁，贴壁率为65％～80％；2～3d可见集落形成，10d左右融合90％以上，随着传代次数增加，克隆形成率逐渐降低。透射电镜观察显示体外培养的MSCs具有MSCs典型的超微结构，其表面标记物CD29、CD44、CD71、CD90表达阳性。结论体外分离培养的先心病婴幼儿MSCs生长稳定且增殖较快，可作为体外构建工程化先心病修复材料的种子细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离和培养扩增的方法。研究MSCs的生物学特性，为利用MSCs作为种子细胞治疗多种疾病提供实验基础。方法通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs，测定其接种贴壁率；在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化，利用MTT法测定MSCs生长曲线；并应用流式细胞术测定细胞周期和表面标记物。结果MSCs体外培养生长状况良好，具有活跃的增殖能力，接种10h后贴壁率为96％以上；细胞周期显示有91．4％处于G0／Gl期；培养的MSCs阳性表达CD29、CD44，阴性表达CD34、CD45。结论在实验条件下，体外培养8代以前的MSCs生长稳定，增殖较快，细胞周期表现出较早期细胞特点，可作为组织工程的种子细胞。     

人骨髓间充质干细胞的培养及细胞增殖测定

目的 分离培养并鉴定人骨髓间充质干细胞.方法 成人骨髓取自非血液系统疾病、非肿瘤及乙肝表面抗原阴性的胸外科手术中摘取的肋骨,采用密度梯度离心法和贴壁筛选法进行培养;免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原.结果 人骨髓间充质干细胞(MSCs)的CD44表达阳性;早、中、晚3代传代培养具有以下共性特征:传代培养潜伏期约为24～36 h;传代培养对数增殖期约为4～6 d;对数增殖期结束后至接种后第9 d,MSCs生长逐渐缓慢,进入平台期.结论 培养的细胞不是骨髓中的造血干细胞或骨髓基质中的成纤维细胞,是处于未分化阶段的骨髓间充质干细胞.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、鉴定和体外标记

目的：探讨分离、体外培养、鉴定及体外标记兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stemcells,MSCs）的方法,为进一步的实验研究打下基础。方法：选择健康幼龄新西兰大耳白兔,于双侧髂后上嵴及胫骨上端内侧部行骨髓穿刺提取骨髓。采用全骨髓培养法（直接贴壁法）分离培养MSCs,对第2、3、4、5、6代MSCs应用MTT法测定生长曲线,分析MSCs的生长规律。对MSCs进行形态学观察,通过流式细胞术对CD34、CD44、CD45、CD105这4种MSCs表面抗原进行鉴定,证明所培养的细胞为MSCs。采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyuridine,BrdU）体外标记兔MSCs,检测其标记阳性率。结果：全骨髓培养法培养的原代MSCs接种4天后可以被观察到,形态均匀成梭形,生长增殖迅速,符合MSCs生长的特性,7～8d MSCs融合接近80%,传代培养生长良好。MSCs生长曲线呈S型,由生长曲线分析可知,MSCs在培养第4～8d为高速生长期,MSCs在第3～5代生长最为旺盛。经流式细胞术鉴定,CD34（-）、CD45（-）、CD44（＋）、CD105（＋）,证明所培养的细胞为较纯的MSCs。BrdU体外标记兔MSCs的阳性率达到85%～90%。结论：应用本实验方法,可以分离、纯化培养兔骨髓间充质干细胞且操作简便,效率高,经济实用。所培养的MSCs体外生长稳定、增殖速度快、贴壁率高、可连续传代,可用于MSCs功能及应用的进一步研究。应用BrdU体外标记兔MSCs是安全可靠的。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性观察

目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞(MSCs)部分生物学特性。方法：自健康人骨髓中分离出MSCs,进行原代培养,第5d首次更换培养液,以去除未贴壁细胞,以后每周换液2次,细胞铺满整个培养瓶底90％时开始传代培养。倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态及生长特性,并绘制传代细胞的生长曲线。流式细胞仪检测第3代MSCs细胞表面分子CD29、CD44,以进行MSCs鉴定。结果：MSCs体外培养为贴壁生长。MSCs原代培养约18～21d才达传代要求;传代培养细胞生长潜伏期仅24～36h,对数增长期约3～5d,之后为平台期,4～6d传1代。传至第8代,出现凋亡征象。第3代MSCs细胞表面CD29、CD44的表达率分别为90．6％和91．5％,MSCs均一性较高。结论：从人骨髓中分离出的MSCs在体外环境中具有很强的自我更新和分裂增殖能力。     

体外培养的婴幼儿MSCs生物学特性研究

目的探讨体外分离和培养的婴幼儿骨髓间充质干细胞(MSCs)的基本生物学特性. 方法无菌条件下抽取先心病婴幼儿骨髓,经密度梯度离心、接种获得MSCs,观察其形态、贴壁率、克隆形成能力、超微结构和生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标记物.结果体外培养的MSCs 3 ～ 4 h后开始贴壁,贴壁率为65% ～ 80%;2 ～ 3 d可见集落形成,10 d左右融合90%以上,随着传代次数增加, 克隆形成率逐渐降低.透射电镜观察显示体外培养的MSCs具有MSCs典型的超微结构,其表面标记物CD29、CD44、CD71、CD90表达阳性.结论体外分离培养的先心病婴幼儿MSCs生长稳定且增殖较快,可作为体外构建工程化先心病修复材料的种子细胞来源.     

两种分离方法培养成体大鼠骨髓间充质干细胞的比较分析

目的比较分析目前较简单易行的贴壁培养法和密度梯度离心法培养大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的效果.方法用贴壁培养法和密度梯度离心法分别培养大鼠MSCs,流式细胞仪检测MSCs的表面标记物.结果贴壁培养法培养的原代细胞较密度梯度离心法培养的原代细胞生长快,但传代细胞这一差异不明显;而密度梯度离心法培养的原代细胞较贴壁培养法培养的原代细胞形态一致,随着传代的增加,贴壁培养法培养的细胞形态逐步趋于一致.流式细胞仪检测示：贴壁培养法培养的细胞：CD29（99.8%）、CD90（99.6%）、CD34（3.01%）;密度梯度离心法培养的细胞：CD29（100%）、CD90（97.1%）、CD34（0.89%）.结论用贴壁培养法和密度梯度离心法都可以得到纯度较高的MSCs,两种培养方法的效果无明显差异.     

淫羊藿苷对骨髓问充质干细胞免疫调控能力的影响

目的研究淫羊藿苷对人骨髓问充质干细胞（MSCs）免疫调控能力的影响。方法从人骨髓中分离MSCs并进行传代培养,通过流式细胞术观察其表型。选取第5代MSCs进行研究,通过混合淋巴增殖反应和定量PCR方法检测淫羊藿苷对MSCs免疫抑制能力和免疫调控相关基因表达情况的影响。结果所获得的骨髓贴壁细胞CD34和CD45表达阴性,CD44、CD71、CD90和CDl05阳性表达,符合MSCs的特征。在体外混合淋巴细胞培养体系中,淫羊藿苷处理后的MSCs对淋巴细胞增殖的抑制作用增强,且淫羊藿苷处理后的MSCs中表达更多的HMOX-1、IL-10、iNOS和IL-2基因,而IL-1α、IL-1β和IFN-γ基因的表达水平下降。结论淫羊藿甘可提高骨髓MCSs的免疫抑制能力,淫羊藿苷处理后的MSCs免疫抑制相关基因表达增加,促炎相关基因表达减弱。     

经冠状动脉病变血管植入体外培养扩增的自体骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死区的疗效研究

目的 探讨经冠状动脉病变血管植入体外培养扩增的自体骨髓间充质干细胞(MSCs)对急性心肌梗死区的影响.方法 体外扩增培养巴马香猪MSCs.用球囊扩张封堵冠状动脉前降支制备巴马香猪急性心肌梗死模型,成模1个月后,经冠状动脉前降支植入体外扩增培养的自体MSCs至急性心肌梗死区,观察其对心肌梗死区的影响.结果 梯度离心法分离...     

成人骨髓间充质干细胞的体外诱导培养及向脂肪细胞的定向分化

目的：确定人骨髓的间充质干细胞(MSCs)体外培养扩增、培养，向脂肪细胞表型转化的方法，并了解其生物学特性变化。方法：用Percoll分离液(1．073g／ml)分离成人MSCs，传代培养。流式细胞仪检测表面标记物CDl4，CD34，CD45，CD44，VLA—1，HLA—DR和细胞周期，用1—甲基—3—异丁基—黄嘌吟、吲哚美辛、牛胰岛素、地塞米松实现向脂肪细胞的定向诱导分化。油红O染色，光镜下观察橙红色脂滴沉着的细胞比例。结果：分离培养获得贴壁细胞，流式细胞仪检测CDl4，CD34，CD45，HLA—DR阴性，CD44阳性，VLA—1表达微弱。G0／G1期细胞约为86％。诱导72h后出现脂墒，第3周油红O染色示85％以上细胞转变为脂肪细胞。结论：从人骨髓分离、体外诱导培养间充质干细胞，可定向促进向脂肪细胞表型转化。     

小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和鉴定

目的建立一种实用高效的小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的体外分离培养方法,并进行初步表型鉴定。方法采取贴壁细胞分离法分离和培养MSCs。倒置显微镜观察原代及传代细胞的形态及生长过程,使用免疫细胞化学方法进行MSCs的初步表型鉴定。结果 MSCs贴壁生长,形态均一,呈成纤维缓胞样,生长状态良好。免疫细胞化学检测CD44、CD105、CD34阳性率分别为94.3%、82.3%、3.3%。结论采用贴壁培养法可分离培养出高纯度的MSCs。     

兔骨髓间充质干细胞培养与多向分化潜能鉴定的实验研究

目的原代培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察体外培养中MSCs的生物学特性及多向分化潜能。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察形态学特点,测绘传代MSCs生长曲线,检测细胞周期及表面标记,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果原代及传代MSCs为长梭形成纤维细胞样细胞;生长曲线显示传代细胞具有类似的生长规律;流式细胞仪分析MSCs CD44表达阳性,CD45表达阴性;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红染脂滴。结论通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化MSCs,所获细胞具有高度自我更新和多向分化潜能。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养、多向分化与鉴定

 目的 探索一个高效分离和扩增人骨髓间充质干细胞的方法，并通过形态学和多向分化能力进行鉴定。方法 抽取人胸椎骨髓标本，联合利用密度梯度离心和差异贴壁法分离MSCs，体外扩增后传代，相差显微镜形态学观察和流式细胞仪检测细胞表面标记CD13、CD29、HLA-2、CD34、CD45和HLA-DR。在地塞米松、左旋VitC、b-磷酸甘油、FK506作用下向成骨细胞诱导分化；在TGF-beta 3、重组人胰岛素、丙酮酸钠、亚硒酸等作用下向软骨细胞诱导分化；在地塞米松、IBMX、吲哚美辛的作用下向脂肪细胞诱导分化；在VEGF、bFGF作用下向血管内皮细胞分化。结果 原代和传代细胞呈梭形外观，生长增殖能力良好。细胞表面标记物CD13、CD29，HLA-2阳性，CD34、CD45 和HLA-DR阴性。经定向诱导分化后，细胞分别呈现成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞的表型特征。结论 该方法能从人骨髓中高效分离和扩增MSCs，能成功定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞。     

兔骨髓间充质干细胞体外软骨向诱导的实验研究

目的:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞(MSCs),并定向诱导其向软骨细胞表型分化。方法:抽取兔股骨骨髓,经密度梯度离心与贴壁培养分离得到MSCs。用含有TGF-β、b-FGF、胰岛素、维生素C、转铁蛋白等的DMEM/Ham′s-F12培养基进行软骨向诱导。通过形态学观察,阿辛蓝-PAS特染及Ⅱ型胶原免疫组化染色,鉴定经过诱导后细胞的软骨细胞的表型。结果:兔MSCs原代细胞呈梭形,克隆样生长,经过诱导培养7d后,细胞形态由梭形、多角形变为椭圆形,胞浆丰富,细胞核和核仁清晰可见。阿辛蓝-PAS和Ⅱ型胶原染色阳性。结论:密度梯度离心与贴壁培养两种方法相结合可获得相对高纯度的MSCs,该细胞经诱导后可向软骨细胞分化。     

MSCs 2种分离培养方法及其培养液中的 VEGF、SDF-1α浓度比较

目的：通过2种分离培养方法所得骨髓间充质干细胞（MSCs）的生长特征和微环境中细胞因子的比较,提供一种可以快速、安全、高效地为临床和实验提供大量优质MSCs的方法。方法提取C57BL／c小鼠的骨髓,分别作密度梯度离心法和全骨髓贴壁培养分离法分离培养MSCs ,通过流式细胞仪检测细胞表面CD29＋、CD31－、CD34－、CD45－表达水平,并比较各自所得细胞的生长曲线;ELISA检测培养液中的血管内皮生长因子（VEGF）、SDF‐1α浓度并比较二者的差异。结果与密度梯度离心法比较,全骨髓贴壁分离法所得原代细胞有较快的生长速度,较短的生长周期;培养液中VEGF和SDF‐1α浓度也稍高于密度梯度离心法。结论全骨髓贴壁培养法可以快速、方便、有效地为临床和实验提供大量MSCs ,所得细胞的培养环境优于密度梯度离心法,减少了对细胞功能的损害。