抗炭疽PA15单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立

目的:制备抗炭疽保护性抗原15(protective antigen,PA15)单克隆抗体,初步建立双抗体夹心ELISA检测炭疽感染者血清中的保护性抗原?方法:以纯化的PA63蛋白为免疫原免疫小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体纯度,间接ELISA?Western blot?免疫沉淀(IP)和蛋白质谱分析单抗特异性,并建立双抗体夹心ELISA检测方法?结果:制备了2株抗PA15单克隆抗体,命名为3D7和8E9?SDS-PAGE电泳可见抗体的重链和轻链,间接ELISA?Western blot发现单抗3D7和8E9可与PA15?PA63特异性结合,IP和蛋白质谱分析发现单抗3D7可与PA83特异性结合,双抗体夹心ELISA方法检测炭疽感染血清中保护性抗原的最低检出浓度为16 ng/ml?结论:成功制备了抗PA15单克隆抗体,并建立了双抗体夹心ELISA方法检测炭疽感染血清中的保护性抗原?     

炭疽杆菌致死因子LF253的制备及活性分析

目的 :制备具有生物学活性的重组致死因子253(lethal factor 253,LF253)抗原,获得纯化的目的蛋白,检测其与全分子致死因子(lethal focfor,LF)蛋白竞争性结合保护性抗原(protective antigen,PA)的能力。方法:PCR扩增致死因子LF253片段的DNA,将目的基因插入p ET-28a(+)表达载体中,利用大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌,IPTG诱导重组蛋白表达,通过His标签亲和层析柱获得目的蛋白,Western blot和ELISA法检测蛋白抗原性,Biacore T-100测定重组蛋白与保护性抗原PA结合的亲和力,细胞毒性实验检测其生物学活性。结果:成功构建原核表达载体p ET-28a/LF253,诱导获得重组蛋白s LF253的表达。Western blot和ELISA检测结果证实,该重组蛋白具有良好抗原特异性;细胞毒实验结果表明,重组蛋白可在体内外中和致死毒素引起的生物学效应。结论:本研究制备的融合蛋白s LF253能够与保护性抗原PA结合,可竞争性抑制LF全分子蛋白与PA的聚合,阻断炭疽毒素的致死作用,为今后炭疽疫苗等药物的研发奠定了基础。     

布氏杆菌PBP39蛋白抗原表达及免疫效果的研究

目的获得纯化的布氏杆菌PBP39重组蛋白抗原,观察PBP39重组蛋白的免疫原性.方法扩增不同种布氏杆菌PBP39基因,测序、连接表达载体PET32a,诱导表达,柱纯化PBP39重组蛋白抗原,免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗体及抗体亚型.结果我国牛、羊、猪布氏杆菌PBP39基因与国外已报道的PBP39编码基因不完全相同.在蛋白N端58位碱基后多一G,造成移码突变.故在85、86、87位编码终止子TCA.而在134、135、136位的ATG又编码了新的起始密码.布氏杆菌PBP39蛋白在大肠杆菌高效表达,表达量达40%,纯化重组蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,产生了较高水平的特异性抗体免疫应答,抗体亚型主要是IgG1.结论我国牛、羊、猪布氏杆菌PBP39编码抗原蛋白同国外已报道的不完全相同,纯化的PBP39重组蛋白抗原可诱导高水平的抗体反应,为筛选布氏杆菌病新型疫苗保护性抗原分子奠定了基础.     

人Norpeg蛋白的原核表达及其抗体的制备

目的 原核表达Norpeg C端编码区并制备小鼠抗Norpeg多克隆抗体。方法 将Norpeg基因C端编码区克隆进原核表达载体pGEX4T-1中，转化E.coli，以WFG诱导重组蛋白的表达。以纯化的重组目的蛋白作为免疫原免疫小鼠，制备相应的多克隆抗体。结果 成功构建原核表达载体，表达了重组蛋白并制备了小鼠抗Norpeg多克隆抗体。结论 人Norpeg C端编码区能够在体外大肠杆菌中获得融合表达，制备的小鼠抗Norpeg多克隆抗体特异性较高，为下一步深入Norpeg功能研究提供了重要基础。     

狂犬病毒G蛋白基因的克隆?表达及生物学活性鉴定

目的:将狂犬病毒G蛋白(rabies virus G protein, RVG)基因片段克隆到原核表达载体中,表达并纯化GST融合G蛋白,为研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供诊断抗原?方法:根据GenBank发表的狂犬病病毒CVS-11株G蛋白结构基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增出RVG基因片段,并定向克隆于pGEX-6P-1载体中,构建原核表达载体pGEX-RVG?阳性重组质粒转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过对表达条件的优化,确定可溶性表达的最佳条件?利用谷胱甘肽转移酶(GST)亲和层析法获得纯化的目的蛋白,Western blot对表达的蛋白进行鉴定?结果:构建了原核表达载体pGEX-RVG,经IPTG诱导后可表达分子量约36 000融合蛋白,经纯化获得高纯度的目的蛋白?Western blot检测表明重组的融合蛋白有较好的生物学活性?结论:成功表达并纯化狂犬病毒G蛋白,为进一步研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供抗原?     

狂犬病病毒糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫学特性分析

目的:利用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统对狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)基因进行克隆?表达?纯化,并对重组 RVG 进行免疫学特性鉴定?方法:参照 GenBank 收录的狂犬病病毒 CVS-11 株RVG基因序列,设计特异性引物,扩增目的基因?RVG 基因经BamHⅠ/KpnⅠ 双酶切后定向克隆到 pFastBac-GP67B 载体上,阳性重组转座质粒进一步转化E.Coli DH10Bac 感受态细胞,经蓝白斑筛选及 PCR 鉴定后获得重组穿梭载体 rBacmid-RVG,将其转染至对数生长期的Sf-9昆虫细胞,进行重组RVG的真核表达?His-TrapHP 纯化目的蛋白,SDS-PAGE 和 Western blot 进行鉴定?重组RVG免疫小鼠,检测其免疫原性和血清中和活性?结果:用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统表达并纯化了重组RVG,分子量约58 000?经重组RVG免疫后的小鼠血清具有中和活性?结论:重组RVG具有天然RVG的活性,为进一步研制亚单位疫苗及制备筛选中和抗体奠定了基础?     

人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的 通过构建人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶(ALT1)的原核表达载体,并用纯化的ALT1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备有生物活性的单克隆抗体.方法 用GST-ALT1融合蛋白作为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗ALT1的单克隆抗体,用间接ELISA、Dot-Elisa、Western blot等方法对抗体的抗原结合特性进行鉴定.结果 获得1株能稳定分泌抗ALT1单克隆抗体的细胞株8A9,亚类鉴定这种单抗为IgG2.间接ELISA法测定细胞株腹水抗体的效价为10×10~5.Dot-ELISA、Western blot显示ALT1单克隆抗体能特异性地识别免疫原.结论 成功制备ALT1单克隆抗体.     

人类肿瘤相关蛋白hyrdC的原核表达、抗体制备及其在胃癌中的初步检测

目的:制备原核表达的hyrdC纯化蛋白及相应单克隆抗体,并以该抗体初步检测胃癌中hyrdC蛋白的表达.方法:用RT-PCR方法获取人hyrdC基因序列,插入原核表达载体pET32a构建重组质粒,纯化得到TRX-hyrdC融合蛋白,将其作为抗原免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备抗hyrdC单克隆抗体,以ELISA、Western印迹法筛选及鉴定;采用免疫组织化学法(SP法)比较胃癌组织及瘤旁正常组织中hyrdC抗体水平的差异.结果:测序结果显示克隆的hyrdC ORF与GenBank中登录的序列一致.所获TRX-hyrdC融合蛋白相对分子质量与理论计算值相符,获得2株分泌抗hyrdC单克隆抗体的细胞株;Western印迹法显示该抗体能特异性地结合人hyrdC蛋白;SP法测定显示,hyrdC蛋白在胃癌组织中表达明显高于正常胃组织(P＜0.001).结论:成功制备了抗hyrdC单克隆抗体;SP法测定胃癌组织与瘤旁正常组织中hyrdC抗体水平有显著差异.     

重组人骨形态发生蛋白-2原核表达及单克隆抗体制备

目的 利用原核表达系统(E.coli)表达纯化重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2m),并制备rh-BMP-2m的单克隆抗体.方法 将工程菌株进行常规发酵,自诱导表达,裂菌离心分离包涵体,包涵体变性后经阳离子交换色谱分离纯化.纯化后的变性rhBMP-2m经稀释复性,获得具有生物学活性的rhBMP-2m.并以此作为抗原,免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体.结果 获得还原SDS-PAGE下95％以上纯度的rhBMP-2m.细胞活性结果分析显示,所获得的rhBMP-2m具有较强的生物学活性.免疫小鼠最终获得两株稳定分泌抗rhBMP-2m抗体的杂交瘤细胞株.结论 成功制备了具有生物学活性的rhBMP-2m及其单克隆抗体,为rhBMP-2未来的研究和制备奠定良好的基础.     

抗人MIF单克隆抗体的制备及其活性的初步鉴定

目的构建人巨噬细胞移动抑制因子(human macrophage migrationinhibitoryfactor,hMIF)原核表达系统并制备其单克隆抗体.方法采用RT-PCR从乳腺癌细胞株MDA-MB453细胞克隆hMIF cDNA,测序后构建pET11b/hMIF重组表达质粒,转化入大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达hMIF;重组hMIF经纯化和鉴定后,作为抗原常规免疫和CpG ODN加强免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体并鉴定活性.结果构建pET11b/hMIF重组表达质粒,表达出预期hMIF蛋白,表达率30%,纯化后纯度达95%.Western blotting鉴定为hMIF,NO释放实验证实具有生物学活性.两种免疫方案共获得9株分泌抗hMIF抗体的杂交瘤细胞株,其中一株经Western blotting和活性鉴定证明具有特异性和生物学活性.结论获得hMIF重组蛋白和抗hMIF单克隆抗体,为其基础性研究和在脓毒症的治疗等临床应用研究奠定基础.     

输血前11606例患者HIV和HCV及TP抗体检测结果分析

目的为避免因输血传播疾病引起医疗纠纷和防止职业感染。方法采用酶联免疫吸附试验对2010-01～2011-0311606例就医患者进行输血前人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体、丙型肝炎病毒（HCV）抗体、梅毒螺旋体（rI’P）抗体三项指标筛查。结果共检出阳性例数856例。结论患者输血前进行三项感染性指标检测,对诊断和预防医患交叉感染、减少医疗纠纷的发生具有重要意义。     

抗SSA和抗SSB抗体在肝病患者的检测及临床意义

目的探讨抗SSA、抗SSB在肝病患者的临床意义。方法对143例抗SSA和(或)抗SSB抗体阳性的肝病患者自身抗体的检出情况及其与疾病的关系进行回顾性分析。结果 143例患者中,126例(88.1%)单一抗SSA阳性,3例(2.1%)单一抗SSB阳性,14例(9.8%)抗SSA、抗SSB均阳性;抗SSA的阳性率显著高于抗SSB(掊2=143,P0.05)。140例抗SSA阳性患者中,79例(56.4%)抗Ro52阳性,33例(23.6%)抗Ro60阳性,28例(20.0%)两者均阳性。本组患者中,126例(88.1%)抗核抗体(ANA)阳性,ANA滴度为1:320～1:1000和1:100的患者分别为102例(71.3%)、24例(16.8%),差异具有统计学意义(掊2=113.99,P0.05);17例(11.9%)患者ANA阴性,且均为单一抗SSA阳性者。抗SSA、抗SSB阳性主要见于原发性胆汁性肝硬化(61例,42.7%)、药物性肝损害(22例,15.4%)、自身免疫性肝炎(20例,14.0%)、慢性丙型肝炎(20例,14.0%)和慢性乙型肝炎(15例,10.5%)。143例患者中,13例(9.1%)合并干燥综合征。结论抗SSA和(或)抗SSB不仅见于干燥综合征、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎等自身免疫性疾病中,还可见于药物性肝损害、病毒性肝炎等非自身免疫性疾病中,提示在肝病患者中出现抗SSA和(或)抗SSB抗体阳性时,应综合考虑其是否合并干燥综合征等结缔组织病,并密切随访,避免误诊漏诊。     

抗前列腺癌/抗CD3双特异性单链抗体的构建及表达

目的 构建并表达抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体,观察其生物学活性及临床意义。方法 利用PCR方法及分子生物学基因克隆技术,构建抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体融合基因,测序正确后,利用EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,将融合基因亚克隆入真核表达载体进行表达,表达产物纯化后,利用流式细胞仪进行生物学活性测定。结果 经酶切、测序分析证实插入的基因片段大小为1．5kb,序列与设计完全一致;SDS-PAGE和Western印迹实验证明：表达产物分泌于细胞培养上清,相对分子质量为6l000;流式细胞仪结果显示：双特异性单链抗体与PBMC和PC-3细胞的阳性结合率分别为54．1％和53．7％。结论 抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体具有较好的生物学活性,为进一步的体内实验奠定了基础。     

骆驼来源单域抗体的研究进展

骆驼科动物的血清中存在一种只含重链的同型二聚体(homodimer)构成的特殊抗体,这类抗体由1个重链可变区和2个恒定区(CH2和CH3)组成,缺少CH1和轻链.由该类抗体重链可变区筛选制备而得到的抗体称为单域抗体.单域抗体较常规抗体具有相对分子质量小、热稳定性强、易通过血脑屏障等优点,越来越多地应用于生物探测、诊断、制药等领域.本文主要阐述了单域抗体的结构特征、理化性质及其在生物医学领域的应用.     

输血不良反应的抗体分析

目的 通过对发生输血不良反应的样本进行分析,探讨有效降低发生输血不良反应的手段和措施.方法 对71例输血反应样本进行血清学分析,即进行红细胞抗体、HLA抗体、血小板抗体筛查,分析产生输血反应的原因.结果 输血不良反应以发热多见,多次输血的患者易产生红细胞抗体(20例,占28%)、HLA抗体(30例,占42%,10例同时有细胞抗体),产生血小板抗体的比率小(1例,占4.1%).结论 建立规范化的制度并严格执行,应用输血新方法和新技术能够有效降低输血不良反应率.     

原因不明不孕患者血清抗精子抗体、抗子宫内膜抗体和抗心磷脂抗体测定

目的：探讨免疫因素抗精子抗体（AsAb）、抗子宫内膜抗体（EmAb）和抗心磷脂抗体（ACL）在原因不明孕患者发病中所起的作用。方法：采用凝集试验和ELISA方法对537例原因不明不孕患者和40名正常对照组的血清AsAb、EmAb和ACL进行检测。结果：（1）不孕组AsAb阳性率为24.02%，明显高于正常对照组5.00%（P＜0.05）；（2）不孕组EmAb总阳性率为49.53%，其中IgG阳性率11.73%，IgM32.40%，2者同时阳性5.40%，均明显高于正常对照组（P＜0.05）；（3）不孕组ACL总阳性率为51.14%，其中IgG阳性率8.33%，IgM32.20%，2者同时阳性10.61%，均明显高于正常对照组（P＜0.05）。结论：AsAb、EmAb和ACL在不孕症的发病中均起着不可忽视的作用。     

四种抗体联合检测在SLE患者中的诊断价值

目的 探讨抗双链DNA(dsDNA)抗体、抗Smith(Sm)抗体、抗核小体抗体(AnuA)、抗组蛋白抗体联合检测在系统性红斑狼疮(SLE)患者中的诊断价值.方法 抗dsDNA抗体、抗Sm抗体、AnuA、抗组蛋白抗体均采用欧蒙斑点法测定98例SLE患者(分为活动期和稳定期)、90例其他结缔组织病患者及40例健康人血清中的四种自身抗体.结果 98例SLE患者中抗dsDNA抗体、抗Sm抗体、AnuA、抗组蛋白抗体阳性率分别为45.9%、 29.6%、 57.1%、33.6%,特异性分别为100%、99.2%、98.5%、89.2%;抗dsDNA抗体和AnuA在活动期SLE中的敏感性与稳定期相比差异有统计学意义(P<0.05);抗dsDNA抗体和AnuA以及四种抗体联合检测时阳性率分别为70.4%和79.6%,明显高于其中任何单项检测的阳性率,且明显高于疾病对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 所检测的四种抗体在SLE中都具有很高的特异性和敏感性,其中抗dsDNA抗体和AnuA对活动期SLE具有很好的诊断价值,抗体的联合检测可较大程度提高SLE检测阳性率,四种抗体有明显的互补作用,尤其抗dsDNA抗体和AnuA的联合检测具有很好的组合价值. Abstract： Objective To investigate the diagnostic significance of combined detection of anti-double stranded DNA antibody(anti-dsDNA),anti-Smith antibody(anti-Sm)and antinuclesome antibody(AnuA) and anti-histone antibody in systemic lupus erythematosus(SLE),and evaluate the significance of combined detection of these autoantibodies in the diagnosis of SLE. Methods Ninety-eight cases of SLE patients who were divided into active and stable stage group and 90 disease controls and 40 healthy people were detected with Euro immunoblot assay.Results In the assays mentioned above. The serum positive rates of anti-dsDNA,anti-Sm, AnuA and anti-histone antibody were 45.9%,29.6%,57.1% and 33.1% in SLE, and the specificities were 100%,99.2%,98.5% and 89.2% respectively in patients with SLE.The positive rates of anti-dsDNA and AnuA in active SLE group were 57.5%,65.1%,which was apparently higher than that in the stable stage group;The sensibility of combined detection of anti-dsDNA and AnuA was 70.4%, four autoantibodies combined detection in SLE was 79.6%, which was apparently higher than any single autoantibodies, the difference had statistical significance. Conclusions These four autoantibodies have very high sensibility and specificity respectively, combined detection of four autoantibodies can markedly raise the relevance ratio in SLE, while their specificity didn't have a visual reduction. Especially, the sensibility of combined detection of anti-dsDNA and AnuA can markedly increased in active SLE patients. This compose can raise effectively the diagnosis of active SLE.So the detections of the four antibodies are complementary for the diagnosis of SLE.     

习惯性流产患者抗精子抗体、抗子宫内膜抗体和抗心磷脂抗体检测

目的 :探讨免疫因素抗精子抗体 (AsAb)、抗子宫内膜抗体 (EmAb)和抗心磷脂抗体 (ACL)在习惯性流产发病中的作用。方法 :采用凝集试验和ELISA方法对 335例习惯性流产患者和 40名正常对照者的血清AsAb、EmAb和ACL进行检测。结果 :习惯性流产组AsAb、EmAb和ACL的总阳性率分别为 9.85 %、40 .59%和2 5 .0 7% ,均高于正常对照组 (分别为 5 .0 % ,5 .0 % ,0 % ) (P <0 .0 5)。结论 :EmAb和ACL在习惯性流产的发病中可能起一定作用 ;AsAb的检出提示习惯性流产患者的免疫功能处于紊乱状态     

治疗性工程抗体的研究进展

单克隆抗体从问世到应用于临床，经历了一段曲折的发展历程，其中基因工程抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新。利用抗体工程技术可研制出性能和特点各不相同的高效治疗性抗体，如增强效应功能的全长抗体、传递细胞毒作用的免疫毒素、抗体与细胞因子连接的融合蛋白，以及锚定多种受体的双特异抗体等。本综述介绍了近年来治疗性抗体工程的进展。     

自体抗体与反复流产的关系

[目的]探讨反复流产(RSA)与自身抗体,包括抗心磷脂抗体(aCL)、抗子宫内膜抗体(EmAb)和抗精子抗体(AsAb)的关系。[方法]对116例原因不明RSA患者(研究组)和40例正常非孕妇女(对照组),采用酶联免疫吸附法检测血清aCL和EmAb;采用凝集试验法检测AsAb。其中,研究组又按不同人流次数分为4组。[结果]整个研究组中aCL、EmAb和AsAb的阳性百分比均高于对照组,差异均有显著性(P<0.05),且人工流产次数与血清EmAb阳性率呈正直线关系(r=0.996)。[结论]体内aCL、EmAb和AsAb的存在可能是原因不明RSA的病因之一,且EmAb可能与人工流产导致后来反复自然流产有关。