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1.
目的拯救表达免疫检查点CTLA4抗体的重组流感病毒,全面鉴定并体内外实验评价其溶瘤效果。方法利用流感病毒反向遗传学(reverse genetics,RG)技术,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)为载体,分别在PR8病毒PB1和PA基因片段插入免疫检查点CTLA4抗体的重链和轻链构建重组质粒pFlu-CTLA4-PB1、pFlu-CTLA4-PA,与PR8病毒的其余6个质粒pHW191-PB2、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M、pHW198-NS共转染COS-Ⅰ和MDCK细胞,经拯救、筛选、鉴定获得重组溶瘤流感病毒,命名为rFlu-muCTLA4。通过血凝试验、EID_(50)、PCR等方法全面鉴定;ELISA测定anti-CTLA4抗体含量;3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulphophenyl)-2H-tetrazolium 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5(MTS)细胞活力测定重组病毒对小鼠肝癌H22细胞的杀伤效果;利用小鼠肝癌模型,评价重组病毒在体内对肿瘤的抑制效果。结果 rFlu-muCTLA4的血凝效价为2~9~2~(10),且能够在鸡胚中稳定传代;EID_(50)为10~(-8)EID_(50)/ml;重组病毒的PB1、PA片段与预期大小一致;重组病毒接种鸡胚培养2 d可检测到anti-CTLA4抗体,4天达到高峰值。MTS结果显示,rFlu-muCTLA4能特异性杀伤H22细胞活力,呈现剂量依赖性。动物实验表明,重组病毒能显著减小小鼠肝癌肿瘤体积,提高动物存活率并延长存活时间。结论表达免疫检查点CTLA4抗体的重组流感病毒rFlu-muCTLA4在体内外能靶向杀伤肝癌细胞,有望为溶瘤病毒靶向治疗肝癌提供新的思路。  相似文献   
2.
目的制备抗乙型流感单克隆抗体,为建立特异、灵敏、简便的乙型流感病毒快速检测方法奠定基础。方法应用鸡胚接种法、ELISA方法、免疫扩散法、血凝抑制法筛选能稳定分泌抗乙型流感病毒单抗的杂交瘤细胞,并对分泌的单抗的安全性,有效性、抗体亚型,特异性及灵敏性进行了全面评价。结果获得了3株能稳定分泌抗乙型流感病毒单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3G11、4F9、8G6;制备的抗乙型流感病毒单克隆抗体无鼠源病毒污染;抗体亚型为IgG2a亚型,轻链均为κ链;对乙型流感病毒具有高度特异性,而与甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、呼吸道腺病毒等无交叉反应。结论制备的乙型流感病毒单克隆抗体具有特异性强、灵敏性高,为临床乙型流感的早期快速诊断及流行病调查奠定了实验基础。  相似文献   
3.
目的观察从死禽体内分离的禽流感H5N1病毒株对小鼠的致病情况,筛选一株可用于小鼠攻毒实验的H5N1毒株。方法将17株禽源H5N1病毒分别滴鼻感染6~8周龄Balb/c小鼠,观察其对小鼠的致病和致死情况。通过测定其中毒力较强一株的EID_(50)、TCID_(50)、小鼠LD_(50)及濒死小鼠不同组织中病毒载量,判定其致病力;采用遗传进化分析绘制HA基因进化树,了解其进化特征。结果动物实验表明,17株高致病性禽源H5N1毒株中,仅有一株对小鼠为高致病性。该毒株TCID_(50)/100μl=7.2,EID_(50)/100μl=8.325,小鼠1 LD_(50)/100μl=6.318≈10~2EID_(50)。鼻粘膜感染4~6 d小鼠发病,表现为精神萎靡、食欲减退、竖毛、弓背等临床症状,体重明显减轻。小鼠死亡集中在发病后的2~5 d,耐过死亡者12 d完全恢复正常。从濒死感染小鼠脾、肺、鼻及脑组织中皆可检出流感病毒NS片段,病毒数载量以脑组织中最多,达3.56×10~(10)拷贝/5μl。结论筛选到一株对小鼠呈强致病性H5N1亚型禽流感毒株,可以用于禽流感疫苗交叉保护效果评价的小鼠攻击实验,也可以作为感染模...  相似文献   
4.
目的对5株EV71分离株(LCH01、LCH02、BJ01、BJ02、AH01)进行毒力、免疫原性和基因组的比较分析。方法分别用5株EV71分离株攻击Balb/c乳鼠,比较毒力差异;免疫6~8周龄Balb/c小鼠后收集血清,ELISA检测抗体效价,微量中和实验检测中和抗体效价;反转录获得5株EV71的全长cDNA进行全基因组测序;最后,用CLC Main Workbench 5.5软件对序列进行比较分析。结果通过对VP1基因的比较分析发现,这5株EV71分离株均为C4a亚型。1周龄Balb/c小鼠经脑部注射LCH01株,表现出后肢瘫痪和后继死亡;而注射其它4株EV71的小鼠在观察了14 d之后仍然存活。5株EV71血清抗体效价为210~211,中和抗体效价为27~28,无显著差异。LCH01毒株与其它几株序列相比,在5′-NTR、3′-NTR、3D等处均有明显差异。结论这5株EV71分离株为近几年流行的C4a亚型,具有较高的免疫原性;LCH01毒株的毒力高于其它几株,从基因组水平上找到了差异序列,这为EV71疫苗评价和致病机制研究提供了实验数据和实验材料。  相似文献   
5.
淋球菌LOS 2C7表位筛选及其与HBc融合蛋白的原核表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:将淋球菌脂寡糖的2C7表位插入乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的MIR区,通过原核表达系统进行融合蛋白的表达,以期获得高免疫原性的淋球菌亚单位疫苗的候选靶位。方法:通过间接ELISA法,以CMCC29403菌株的LOS为包被抗原,对7个表位进行筛选;并通过杀菌试验检测肽段免疫动物产生血清的保护力。对已筛选好的肽段基因进行人工合成,通过重叠PCR将肽段基因嵌入HBc基因中,以增强表位的免疫原性,并进行原核表达。结果:初步研究表明了表位PEP1,PEP2,PEP7具有较强的脂寡糖(LOS)的免疫原性,能够模拟脂寡糖的抗原性。这3个肽段可能成为候选疫苗亚单位。通过重叠PCR方法:成功地将PEP1,PEP2,PEP7三个表位基因序列插入乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的刺突(MIR)部位,构建了HBc-PEP1,HBc-PEP2,HBc-PEP7融合基因,通过PET22b(+)载体进行原核表达,为下一步疫苗的研究奠定了基础。结论:2C7表位PEP1,PEP2,PEP7具有较强的脂寡糖(LOS)的免疫原性,能够模拟脂寡糖的抗原性。表位与HBc的融合蛋白可以通过原核表达系统进行可溶性表达,为下一步疫苗的研究奠定基础。  相似文献   
6.
目的 制备CA16型VP1蛋白疫苗并进行免疫原性初步分析,为手足口病CA16疫苗的深入研究提供资料.方法 利用RT-PCR技术获得CA16 VP1基因,克隆到载体pFastBac HT A,与Bacmid DNA重组,转染Sf9昆虫细胞,重组CA16 VP1蛋白与Al(OH)_3佐剂混合制备重组CA16 VP1蛋白疫苗,腹腔免疫BALB/c小鼠,2次免疫后进行免疫效果初步评价.结果 用间接免疫荧光、SDS-PAGE和Western blot法,证明重组CA16 VP1蛋白在昆虫细胞Sf9中得到表达,用ELISA和微量中和法检测到免疫小鼠血清有特异IgG和中和抗体产生,最佳免疫抗原剂量为20μg,其特异IgG效价为1:1600,中和抗体效价为1:250;通过淋巴细胞增殖试验和细胞因子测定,证明诱导T细胞应答,诱发Th1/Th2型免疫应答.结论 CA16 VP1基因克隆成功,并在Sf9昆虫细胞中获得表达,构建的蕈组CA16 VP1亚单位疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,为今后研制手足口病CA16疫苗奠定了基础.  相似文献   
7.
目的 构建自杀性质粒载体,对布鲁杆菌M16株pgm基因进行精确突变,并对得到的pgm基因突变活菌苗株进行鉴定.方法 在puc19质粒载体上构建正向筛选标记--蔗糖敏感基因和反向筛选标记--卡那霉素抗性基因融合序列;用卡那霉素抗性基因融合序列对布鲁杆菌pgm基因进行修饰(插入突变),完成pucS1.6K自杀性质粒载体的构建;通过电转化获得布鲁杆菌M16株pgm基因突变菌株;应用PCR方法对pgm基因突变菌株进行鉴定.结果 鉴定结果显示,布鲁杆菌M16株pgm基因在卡那霉素抗性基因插入后失活,突变后的布鲁杆菌M16株pgm基因DNA片段长度约为3525 bp,与预期的相符,布鲁杆菌M16株pgm基因突变菌株构建成功.结论 构建的自杀性质粒载体能成功对布鲁杆菌进行精确毒力基因突变,为获得布鲁杆菌突变株提供了一个有效的技术平台,也为新型减毒活疫苗的研制奠定了基础.
Abstract:
Objective The construction of suicide plasmid vector could be used to make mutation of pgm gene which attenuates the virulent of Brucella melitensis strain 16, the research may lay a foundation for the development of novel live attenuated vaccines. Methods Sucrose sensitive gene as forward screening sign and fusion sequences of kanamycin resistance gene were constructed based on plasmid pucl9; pucS1.6K suicide plasmid vector was established by modifying pgm gene with fusion sequences of kanamycin resistance gene (insertion mutation); pgm gene mutation of Brucella melitensis strain 16 was obtained by electro transformation and mutation was confirmed by PCR amplification. Results The results showed that the identified Brucella melitensis strain 16 pgm gene was inactivated after insertion of kanamycin resistance gene, and the mutant pgm gene DNA fragment length was approximately 3525 bp, in line with expectations, Brucella pgm gene mutant melitensis strain 16 was successfully constructed. Conclusions The construction of suicide plasmid vector and precise mutation of Brucella melitensis strain 16 is successful, the study is not only provided an effective technology platform for constructing mutants of Brucella but also lays a foundation for the development of novel live attenuated vaccines.  相似文献   
8.
甲型H1N1流感病毒疫苗株高适应性MDCK细胞的筛选及鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的筛选甲型H1N1流感病毒疫苗株高适应的MDCK单克隆细胞株,用于培养生产流感病毒疫苗,为细胞代替鸡胚生产制备流感病毒疫苗提供保证。方法通过有限稀释法将MDCK细胞进行单克隆化,扩大培养建立单克隆化细胞库,通过血凝和TCID50筛选甲型H1N1流感病毒疫苗株的高适应性单克隆化细胞株,并鉴定所获得的细胞株细胞表面NeuAcα2,6 Gal的丰度。结果共制备了97株单克隆化MDCK细胞,经过甲型H1N1流感病毒疫苗株的筛选,共筛选到2株高适应甲型H1N1流感病毒疫苗株的MDCK单克隆化细胞株,其TCID50分别为6.68 log10 TCID50/ml和6.77 log10 TCID50/ml,其表面NeuAcα2,6 Gal的丰度明显提高。结论成功培养了MDCK单克隆细胞株,经筛选获得的单克隆细胞株其血凝滴度,TCID50都比普通MDCK细胞有明显提高,为细胞培养生产流感病毒疫苗奠定了基础。  相似文献   
9.
M2基质蛋白是A型流感病毒膜蛋白,在A型流感病毒的生命周期中,M2具有重要的生物学功能,已成为抗病毒药物研究的靶蛋白。其胞外区M2e(M2 ectodomain,M2e)为24个氨基酸残基,该片段在多病毒株中具有极高的保守性。针对M2e产生IgG型抗体能够防止流感病毒引发的死亡,减少动物模型中流感的发病率。了解有关M2e疫苗的研究进展,以及关于M2e作为A型流感疫苗靶抗原的关键问题很重要。  相似文献   
10.
M2基质蛋白是A型流感病毒膜蛋白,在A型流感病毒的生命周期中,M2具有重要的生物学功能,已成为抗病毒药物研究的靶蛋白.其胞外区M2e(M2 eetodomain,M2e)为24个氨基酸残基,该片段在多病毒株中具有极高的保守性.针对M2e产生IgG型抗体能够防止流感病毒引发的死亡,减少动物模型中流感的发病率.了解有关M2e疫苗的研究进展,以及关于M2e作为A型流感疫苗靶抗原的关键问题很重要.  相似文献   
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