重组腺相关病毒介导内皮抑素的表达及体外活性研究

目的 构建携带人内皮抑素基因的重组腺相关病毒rAAV-hEndo,介导其体外表达并检测其生物活性。方法 采用无需包装辅助病毒的双质粒共转染方法制备rAAV-hEndo,测定其滴度及感染效率。免疫荧光染色检测内皮抑素蛋白在体外感染细胞中的表达,并通过MTT法、细胞周期检测及TUNEL法检测细胞凋亡指数,观察其对人脐静脉内皮细胞ECV304的影响。结果 所制备的重组腺相关病毒滴度为2×10¹²vg/ml,感染效率达98%。免疫荧光染色显示内皮抑素蛋白主要表达于细胞胞质。rAAV-hEndo感染细胞培养上清对ECV304细胞72h增殖抑制率为67.3%。内皮细胞转染内皮抑素基因后细胞周期明显阻滞于G₁期,其G₁期占(72.5±4.0)%,与对照组(52.1±2.1)%比较有显著差异(P<0.01)。TUNEL法检测实验组内皮细胞凋亡指数为(32.6±3.2)%,与对照组(4.2±1.9)%比较有显著差异(P<0.01)。结论 所制备的重组腺相关病毒rAAV-hEndo能有效介导具有生物活性的内皮抑素表达,为进一步肿瘤抗血管生成基因治疗动物实验奠定了基础。     

人GRP94基因慢病毒载体构建及稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌HeLa细胞株筛选及鉴定

目的:构建人葡萄糖调节蛋白 94(GRP94)基因慢病毒载体,筛选稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌细胞株,筛选GRP94结合蛋白,为探讨GRP94对宫颈癌的调控作用提供细胞模型。方法:采用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增GRP94基因片段,连接到慢病毒载体pLVX-IRES-Hyg中,获得重组载体。瞬时转染293T细胞,采用Western blotting 法检测GRP94蛋白表达量。pLVX-FLAG-GRP94重组质粒通过与包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。以慢病毒感染HeLa细胞,筛选并鉴定稳定表达GRP94蛋白的细胞株。用稳定表达FLAG-GRP94的HeLa细胞株,银染后利用质谱筛选结合蛋白,并经免疫共沉淀验证。结果:重组慢病毒载体经双酶切和基因测序比对鉴定正确。HeLa细胞经慢病毒感染,药物筛选后获得的稳定表达株中GRP94蛋白表达量高于野生型HeLa细胞(P<0.01)。成功钓取出一种与肿瘤发生发展密切相关的SND1蛋白。结论:成功构建了GRP94基因慢病毒载体pLVX-FLAG-GRP94,并筛选出稳定表达GRP94蛋白的HeLa细胞株,为进一步明确肿瘤的发生、发展机制奠定了基础。     

人乳头瘤病毒早期癌蛋白E6/E7稳定表达细胞系的构建及其对Rab12表达的影响

目的 探究人乳头瘤病毒(HPV)编码的早期癌蛋白E6/E7对小GTP酶蛋白Rab12表达的影响。 方法 利用逆转录病毒包装系统获得含pBabe-Vector质粒和pBabe-16E7质粒的高滴度病毒颗粒,感染细胞,并用嘌呤霉素筛选获得稳定表达HPV16E7的UMSCC 10A-16E7细胞系,Western blotting检测E7相关蛋白p53和E2F1的表达变化,比较UMSCC 10A-Vector细胞系和UMSCC 10A-16E7细胞系的Rab12蛋白表达水平。用同样方法在HaCaT、RPE1细胞系中进一步验证。用siRNA干扰SiHa、Caski细胞(HPV-16阳性的宫颈癌细胞)中16E6/E7及HeLa细胞(HPV-18阳性的宫颈癌细胞)中18E6/E7的表达,通过Western blotting比较siRNA干扰前后E6和E7相关蛋白(E2F1、p53和Rab12)的表达差异。 结果 利用逆转录病毒包装系统成功构建稳定表达的细胞系,过表达E6/E7的细胞系中Rab12表达升高,干扰E6/E7的细胞系中Rab12的表达降低。 结论 HPV编码的早期癌蛋白E6/E7可调控Rab12的表达。     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34+细胞

目的 研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34⁺细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法 用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞,免疫磁性分离仪纯化CD34⁺细胞,重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞,并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果 荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32.8%,CD34⁺细胞的基因转导效率最高为25%,在所观察的时间内,转染率呈先升高后降低趋势。结论 重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34⁺细胞,绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因,为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

STAT3-siRNA慢病毒表达载体的制备及其在SW480细胞中的表达

【目的】通过慢病毒感染SW480细胞观察RNAi对细胞内STAT3基因表达的影响。【方法】制备STAT3干扰质粒,与其它3种质粒共同转染至293T细胞中组装为STAT3-siRNA慢病毒表达载体。流式测定病毒滴度后选择最适滴度感染SW480细胞并进行分选。Real-time PCR及Western blotting分析该慢病毒在SW480细胞中对于STAT3基因表达的影响。【结果】测序结果说明制备的慢病毒表达载体符合实验预期。该siSTAT3慢病毒感染SW480细胞后,流式细胞仪检测发现SW480细胞凋亡比率增加,Real-time PCR检测发现慢病毒对于STAT3 mRNA表达量的干扰效率为78.68%,Western blotting检测发现STAT3蛋白表达量下降,与对照组相比差异有统计学意义（P〈0.05）。【结论】本研究制备的STAT3-siRNA慢病毒表达载体,能够有效干扰结直肠癌SW480细胞株STAT3表达。     

人血管生成素1基因慢病毒表达载体的构建及其在脐带间充质干细胞的表达

目的 通过基因重组技术构建人血管生成素-1(Ang-1)基因慢病毒表达载体,并检测其在人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的表达及对hUC-MSCs免疫抑制能力的影响。 方法 应用Trizol法从hUC-MSCs提取总RNA,反转录获取cDNA,PCR扩增获得编码Ang-1的序列克隆到GV287载体中。将重组GV287-Ang-1载体质粒和慢病毒包装质粒pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染293T细胞,收集病毒上清,纯化浓缩测定病毒滴度。采用荧光显微镜观察转染效率,Western blotting法检测Ang-1蛋白表达,并通过CCK8试剂盒检测T淋巴细胞增殖活性。 结果 Ang-1基因扩增PCR产物与预期大小一致。重组慢病毒GV287-Ang-1质粒经PCR和DNA测序分析显示,所得结果与目的基因序列一致且插入方向正确。包装慢病毒浓缩悬液滴度为2×10⁸TU/mL,最佳感染复数为8。GV287-Ang-1转染组细胞Ang-1表达显著高于未转染组和GV287转染组。过表达Ang-1的hUC-MSCs对T淋巴细胞的增殖抑制显著高于单纯的hUC-MSCs。 结论 成功构建携带Ang-1基因的慢病毒载体GV287-Ang-1,并可有效转染hUC-MSCs过表达Ang-1蛋白,且能显著提高hUC-MSCs的免疫抑制能力。     

膀胱平滑肌细胞乙酰胆碱M3受体干扰RNA慢病毒载体的构建

目的 构建膀胱平滑肌细胞（bladder smooth muscle cells,BSMCs） M₃型受体干扰RNA慢病毒载体。方法 合成4条M₃受体干扰序列,构建GV118-sh-M₃慢病毒载体,测序验证序列。将GV118-sh-M₃慢病毒载体与质粒pHelper1.0、pHelper 2.0三个载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并用荧光法检测4组病毒滴度。体外原代培养BSMCs,4组GV118-sh-M₃慢病毒（KD1、KD2、KD3和KD4）转染BSMCs,观察绿色荧光蛋白表达并通过RT-PCR、Western blotting法检测各组干扰效率。结果 成功构建4个GV118-sh-M₃慢病毒载体,测序结果符合设计序列。4组GV118-sh-M₃慢病毒滴度分别为2×10⁸、6×10⁸、5×10⁸和5×10⁸ TU/mL。分别转染BSMCs后,KD1组绿色荧光蛋白表达量最高且干扰效率最高。结论 成功包装并筛选了GV118-sh-M₃慢病毒载体,为后续进一步研究干扰M₃受体在神经源性膀胱中的作用奠定了基础。     

重组腺病毒Ad-DDAH2转染大鼠脂肪干细胞的可行性

目的 探讨腺病毒载体(Ad-DDAH2)转染大鼠脂肪干细胞(ADSCs)的可行性。方法 构建Ad-DDAH2-GFP质粒。原代培养大鼠ADSCs,流式细胞术检测免疫表型CD29、CD45、CD90表达情况。以不同滴度的Ad-DDAH2-GFP转染ADSCs,用荧光显微镜计数转染效率及细胞形态。通过RT-PCR及Western Blot检测DDAH2在ADSCs中的表达情况。结果 Ad-DDAH2-GFP重组腺病毒载体构建、包装成功,且病毒滴度达到2E+10PFU/ML。第4代ADSCs生长曲线呈现“S”形。细胞免疫表型CD29、CD90阳性率分别为(95.83±0.53)%、(91.32±0.27)%, CD45阳性率为(1.59±0.06)%,符合ADSCs免疫表型特征。当病毒感染复数值为80、100时,转染效率均可达到90%以上。但病毒感染复数值为100时,ADSCs出现明显细胞病理现象,因此病毒感染复数值为80被视为最佳感染复数,RT-PCR及Western Blot鉴定可见阳性扩增条带。结论 Ad-DDAH2-GFP重组腺病毒载体构建成功,可以高效转染大鼠ADSCs。DDAH2在mRNA及蛋白稳定长期表达,为后续体内实验奠定了实验基础。     

人肺腺癌细胞A549对蜱媒脑炎病毒的易感性分析

目的 研究蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)在易感细胞中的培养特性,为抗病毒药物的筛选研究提供合适的细胞模型。方法 qRT-PCR检测TBEV在Vero细胞内RNA复制,蛋白质印迹检测病毒蛋白表达。显微镜下观察TBEV感染A549细胞的病变。免疫荧光检测TBEV感染A549、Vero细胞内病毒包膜蛋白的表达。空斑实验检测TBEV在A549和Vero细胞内的滴度。结果 同TBEV孵育48 h相比,孵育72 h的Vero细胞内TBEV RNA水平升高,并检测到TBEV包膜蛋白的表达。Vero细胞培养的TBEV滴度为2×106 PFU/mL。TBEV感染A549细胞引起明显的细胞病变效应。包膜蛋白的表达水平在TBEV感染的A549细胞远高于Vero细胞。同Vero细胞相比,TBEV感染A549细胞上清内的病毒滴度升高(P<0.05)。结论 Vero细胞可用于培养TBEV,A549细胞对TBEV更易感。     

肺癌遗传易感差异表达miRNA的筛选及生物信息学分析

目的 肺癌是目前我国死亡率最高的恶性肿瘤,发病率和病死率持续升高,且预后较差,患者的5年生存率小于15％,严重威胁人们的健康。筛选肺癌遗传易感差异表达的miRNA,分析差异表达的miRNA的靶基因功能,可为进一步研究miRNA在肺癌发生发展过程中的作用提供实验基础。方法 采用高通量测序技术检测海南地区汉族肺癌患者和对照患者血清中差异表达的miRNA,通过生物信息学方法预测差异miRNAs的靶基因,并对靶基因进行GO功能富集分析、KEGG信号通路分析和蛋白相互作用分析。结果 肺癌患者和对照患者共筛选出3个显著差异表达的miRNA (P<0.05,|log2 (Fold Change)|≥1) ,且均呈下调状态。差异表达miRNAs所预测的靶基因显著参与癌症通路、 轴突导向通路、代谢通路,NUFIP2、PLAGL2、IGF1R基因编码的蛋白在互作网络中具有重要作用。结论 海南地区肺癌患者和对照患者间存在3个差异表达的miRNAs,这些miRNAs可能通过调控癌症、轴突导向、代谢等信号通路,调节下游靶蛋白参与肺癌的发生过程。     

TLR7在呼吸道合胞病毒感染A549细胞诱导I型干扰素中的作用

目的：探讨 Toll 样受体7（TLR7）在呼吸道合胞病毒（RSV）感染 A549细胞诱导产生 I 型干扰素（IFN）抗病毒免疫反应中的作用。方法实验分正常对照组、RSV 感染组、TLR7 siRNA 沉默组,分别于感染的4、8、12、24 h 后收集各组细胞以及培养上清液。TLR7 siRNA 通过瞬时转染 A549细胞,半定量 RT-PCR 法检测 TLR7基因沉默效果;TRIzol 试剂提取细胞总 RNA,检测 TLR7、干扰素调节因子7（IRF7）、IFN-α、IFN-β的 mRNA 表达量变化;通过 Western blot 法检测 TLR7蛋白表达量;ELISA 法检测感染不同时间点 A549细胞培养上清液中 IFNα／β含量的变化。结果①转染24 h 后 TLR7 siRNA-2有效抑制 TLR7 mRNA 表达;② RSV 感染A549细胞后,TLR7、IRF7、IFN-α／β的 mRNA 以及 TLR7蛋白的表达量均升高,并与 RSV 感染之间存在时间依赖性关系;沉默 TLR7后,TLR7、IRF7、IFN-α／β的 mRNA 以及 TLR7蛋白的表达量较感染组均有明显下降;③ RSV 感染 A549细胞后,明显上调细胞培养上清液中 IFN-α／β的水平,TLR7 siRNA 沉默组 IFN-α／β的表达水平较 RSV 感染组均下降,差异有统计学意义,且 IFN-α的表达量下调更为显著。结论RSV 感染A549细胞后,TLR7被活化能够诱导产生I 型IFN,发挥抗病毒作用,且TLR7诱导产生的I 型IFN 以IFN-α为主。     

沉默A549细胞中的CD46和DSG2可抑制人3型和7型腺病毒的侵入及IL-8的释放

目的 探讨沉默受体CD46、桥粒芯蛋白（DSG2）对人3型腺病毒（HAdV-3）和7型腺病毒（HAdV-7）的侵入及炎症因子释放的影响。方法 通过RNA干扰技术沉默A549细胞中CD46、DSG2的表达。实验分为HAdV-3组、HAdV-3+siRNA-NC组（siRNA无关序列对照组）、HAdV-3+siRNA-CD46组（转染siRNA-CD46）、HAdV-3+siRNA-DSG2组（转染siRNA-DSG2）;HAdV-7组、HAdV-7+siRNA-NC组（siRNA无关序列对照组）、HAdV-7+siRNA-CD46组（转染siRNA-CD46）、HAdV-7+siRNA-DSG2组（转染siRNA-DSG2）。HAdV-3、7感染A549细胞后0.5、2 h,通过激光共聚焦显微镜观察两种腺病毒与受体CD46、DSG2结合水平;体外转染siRNA-CD46、siRNA-DSG2后不同时间点,qRT-PCR技术检测HAdV-3、7拷贝数,ELISA检测转染后IL-8表达情况。结果 腺病毒感染A549细胞后0.5、2 h,HAdV-3、7与其受体CD46、DSG2结合共定位;腺病毒入胞后,随时间延长,病毒拷贝数增加,转染 siRNA-CD46 后 2、6、12、24 h,HAdV+siRNA-CD46 组的病毒拷贝数较 HAdV 组降低（HAdV-3+siRNA-CD46 vs HAdV-3：6 h,P<0.05;12、24 h,P<0.0001;2 h,降低趋势无统计学差异;HAdV-7+siRNA-CD46 vs HAdV-7：2 h, P<0.01;6 h,P<0.001;12、24 h,P<0.0001）。转染siRNA-DSG2后2、6、12、24 h,同样明显降低了病毒载量（HAdV-3+siRNA-DSG2 vs HAdV-3,HAdV-7+siRNA-DSG2 vs HAdV-7,P<0.0001）。HAdV-3、7 感染 A549 细胞后,炎症因子 IL-8 释放增多（P<0.0001）,沉默CD46和DSG2的表达后2、6 h,炎症因子IL-8水平降低（P<0.0001）。结论 HAdV-3、7与其受体CD46、DSG2结合后入胞,病毒拷贝数随时间延长而增加,沉默CD46、DSG2后,抑制HAdV-3、7型腺病毒的侵入及IL-8释放。     

NS2激活TLR7抑制RSV感染肺泡上皮细胞中IFN的表达

目的 探讨非结构蛋白NS2在呼吸道合胞病毒(RSV)感染人Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549)活化TLR7信号转导过程中的可能作用.方法 以RSV感染体外培养的A549细胞,设立正常对照组、RSV感染组、RSV NS2小干扰RNA沉默组(NS2 siRNA+ RSV组)及TLR7激动剂组(R848+RSV组).各组分别于病毒感染后的4、12、24、48 h收集细胞和培养上清液.Western blot法检测各组不同时间点TRIF、TRAF6及p-IκB-α蛋白表达;ELISA法检测各组细胞培养上清液中Ⅰ型干扰素α(IFN-α)、IFN-β含量的变化.结果 正常对照组中TRIF、TRAF6、p-IκB-α蛋白的表达量较低,经RSV感染之后,随感染时间增加,表达量升高;在NS2siRNA+ RSV组三者表达量较正常对照组上调,但相对于RSV感染组,表达下降,表明RSV NS2可以活化TRIF、TRAF6及p-IκB-α蛋白的表达.RSV感染组及NS2 siRNA+ RSV组、IFN-α、IFN-β含量随感染时间增加逐渐升高,4h开始升高,差异有统计学意义(P＜0.01);R848+RSV组IFN-α和IFN-β呈时间依赖性增加,感染4h升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 NS2在病毒感染A549细胞过程中激活TLR7,抑制了IFN-α和IFN-β的表达.     

胰腺癌组织miRNA let-7a与HMGA2的表达及血清miRNA let-7a水平对胰腺癌的诊断价值

  目的  探讨胰腺癌组织中miRNA let-7a、高迁移率族蛋白2（high mobility group A2,HMGA2）的表达情况及血清miRNA let-7a水平在胰腺癌中的诊断价值。  方法  回顾性收集我科2014年1月?2019月1月行手术治疗的60例胰腺癌患者术中获得的新鲜胰腺导管腺癌组织及癌旁正常胰腺组织,同时收集胰腺癌患者手术前后血清标本,并收集同期于我院体检的60例体检结果正常者的血清标本作为对照组。采用实时荧光定量PCR法检测健康体检者及患者血清标本miRNA let-7a表达,癌组织、癌旁正常组织miRNA let-7a和HMGA 2 mRNA表达,Western blot法检测患者癌组织、癌旁正常组织HMGA2蛋白的表达。分析血清miRNA let-7a水平,癌组织miRNA let-7a、HMGA2 mRNA 表达与胰腺癌临床病理特征的关联,并用受试者工作特征曲线分析术前血清miRNA let-7a水平对胰腺癌的诊断价值。  结果  与癌旁正常组织相比,胰腺癌组织中miRNA let-7a表达水平下降（t=20.291,P<0.01）,HMGA2 mRNA表达上升（t=46.681,P<0.01）;癌组织HMGA2蛋白表达较癌旁正常组织增高（t=22.973,P<0.01）。miRNA let-7a在胰腺癌患者血清中的表达较健康对照者降低（t=24.854,P<0.01）;在胰腺癌患者术后1周血清中miRNA let-7a相对表达量较术前下降（t=6.885,P<0.01）;癌组织与术前血清中miRNA let-7a表达量呈正相关（r=0.411,P=0.000）。胰腺癌中miRNA let-7a、HMGA2 mRNA水平在不同TNM分期及有无淋巴结转移间差异均有统计学意义(P<0.05)。以术前血清miRNA let-7a诊断胰腺癌的曲线下面积为0.823,95%置信区间为0.665~0.917,取0.614为最佳临界值,对应的灵敏度为82.3%,特异度为74.1%。  结论  胰腺癌组织和血清miRNA let-7a均出现下调,可能通过调控HMGA2的表达参与肿瘤的侵袭和转移;血清miRNA let-7a水平可为胰腺癌的诊断及术后病情监测提供一定的参考。     

汉滩病毒76-118株G2S0.7嵌合基因重组腺病毒的构建及表达产物鉴定

目的：在本室前期工作的基础上构建汉滩病毒M基因G2片段与S基因0．7kb片段嵌合基因的重组腺病毒．方法：构建含有汉滩病毒G2S0．7嵌合基因的转移载体pShuttle-G2S0．7，然后通过特异性的酶切将嵌合基因与腺病毒DNA相连，电转化E．coli JM109并用PCR方法进行筛选和鉴定，获得重组腺病毒Adeno-G2S0．7DNA，转染HEK293细胞得到重组腺病毒．进一步对重组腺病毒滴度和表达产物进行鉴定．结果：构建了含G2S0．7嵌合基因重组腺病毒，滴度可达10^13～10^15pfu／L；该重组腺病毒感染HEK293细胞后，表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单抗(mAb)所识别的融合蛋白．结论：利用腺病毒表达系统，成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G2生物学活性的融合蛋白G2S0．7，为进一步研究其免疫学特性奠定了基础．     

食蟹猴体内、外感染SIVmac251后产毒水平的比较研究

目的探索在猴免疫缺陷病毒（SIV）造模之前选择适宜于制作此模型的猕猴个体的方法,以减少感染后血浆病毒水平过低的几率,从而保证实验的质量.方法测定SIV感染前实验猴外周血单个核细胞（PBMC）在试管内感染SIV后的产毒水平,并与该个体在感染同一株SIV后血浆病毒载量的水平进行比较分析,判断此法能否用于选择适于造模的实验猴.结果根据14只食蟹猴的结果,体外与体内的病毒水平符合比为10/14,体内病毒载量偏低的猴6只（6/14）,体外病毒水平偏低者4只,如把这4只猴排除,则余下10只猴体内病毒载量偏低的猴为3只（3/10）.结论应用检测体外PBMC病毒产量水平的方法,选择病毒水平高的猴才用于体内感染SIV.这样能部分去除体内感染的病毒载量偏低的猴.但最终的解决方法仍是建立培育遗传背景清楚的SPF实验猴群.     

miRNA表达谱改变与儿童急性淋巴细胞白血病复发的相关性

摘 要: 【目的】 筛选与儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)预后相关的microRNA(miRNA),旨在寻找与ALL预后相关的分子标记物,为临床ALL患儿分层治疗提供实验室依据? 【方法】 采用基因芯片技术检测10例初发-缓解配对的ALL患儿骨髓细胞的miRNA表达谱(基因芯片组),定量RT-PCR(qRT-PCR)方法验证异常miRNA在ALL患儿骨髓细胞内的表达(qRT-PCR组),结合患儿临床资料分析异常表达的miRNA与ALL预后的关系?【结果】 基因芯片结果显示:初发患儿miR-708?miR-181b?miR-199a-3p?miR-320a和miR-145表达上调最为明显,而miR-223?miR-1244?miR-494?miR-124?miR-23a?miR-27a?miR-181a*和miR-23b表达下调最明显;qRT-PCR结果显示:miR-708?miR-223和miR-27a在ALL患儿骨髓细胞内表达与基因芯片结果一致.;无复发生存分析提示ALL初发时高表达miR-708?miR-223?miR-27a者,3年无复发生存率较高,反之预后较差?【结论】 miRNA是预测ALL预后的有效分子标记物,初发患儿miR-708?miR-27a和miR-223高表达提示预后良好,在指导临床ALL患儿分层治疗方面具有重要意义?     

乙肝患者HBV感染相关特异性miRNA筛选及其功能研究

目的寻找乙型肝炎病毒特异性的miRNA,并在体内验证找到的miRNA的功能,从而为阻断乙肝进一步发展提供新方法。方法利用miRNA芯片分析3对正常肝脏组织与慢性乙型肝炎组织的miRNA,寻找两者之间差异表达的miRNA。用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR,RT-PCR)在更多的组织标本中验证差异表达,确定有意义的miRNA。在鼠病毒性肝炎模型中通过静脉注射有意义的miRNA或anti-miRNA进行干预,同时刺激向肝癌方向转变,观察其病毒复制情况。结果与正常肝脏组织相比,慢性HBV病毒感染组织中表达上调的miRNA有8个,表达下调的miRNA有16个。miR-143在肝癌组织中的表达降低(P=0.0029);miR-520d-5p在肝癌组织中的表达提高(P=0.0320)。结论 miRNA在乙型肝炎的发生、发展中起重要作用,其功能的失调可能导致其最后发展成为肝硬化甚至肝癌,并且可以影响乙型肝炎治疗效果。     

用MDCK细胞培养副流感病毒的初步尝试

目的:初步探索用MDCK细胞培养副流感病毒。方法:用不同血凝效价副流感病毒感染MDCK细胞,观察副流感病毒在细胞上的生长情况,并检测血凝效价的变化。结果:1∶512副流感病毒感染MDCK细胞后24h即出现明显的细胞病变效应,但病毒的血凝效价有所下降。结论:副流感病毒可以引起MDCK细胞出现细胞病变效应,但在该细胞内不能复制。