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1.
目的构建带有亲和素标签的汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白(NP)表达质粒,转染HEK293T细胞并表达后,鉴定与其相互作用的宿主蛋白。方法合成亲和素标签基因(SF)与HTNV NP基因,先后克隆入哺乳动物真核表达载体pCAGGS,构建带有亲和标签SF的HTNV NP表达质粒,酶切鉴定重组质粒,获得的重组质粒命名为pCAGGS-SF-NP。将重组表达质粒瞬时转染到HEK293T细胞中, Western blot法检测重组质粒的表达;瞬时转染并收获蛋白样品,与StrepTrap~(TM) HP琼脂珠混匀后, 4℃过夜孵育;转移到层析柱中,经缓冲液洗涤、脱硫生物素洗脱完成亲和层析,获得洗脱样本;洗脱样品进行SDS-PAGE,分离得到与NP相互作用的宿主蛋白。结果酶切鉴定结果表明成功构建pCAGGS-SF和pCAGGS-SF-NP,重组质粒成功表达串联SF与NP的融合蛋白;在亲和层析过程中,成功特异富集融合蛋白SF-NP;洗脱样品成功分离出与NP相互作用的宿主蛋白。结论构建的重组表达质粒可以在真核细胞中成功表达融合蛋白SF-NP并获得了与NP相互作用的宿主蛋白。  相似文献   
2.
目的:构建含有汉坦病毒M基因(编码糖蛋白G2)和部分S基因(编码核蛋白主要抗原区段)以及S基因的多个CTL表位的多种重组腺病毒表达载体,并对这些重组腺病毒的免疫学特性进行研究。方法:构建含目的基因的重组腺病毒载体,并在VeroE6细胞中进行表达,利用纯化后的重组腺病毒免疫BALB/c小鼠,通过ELISA、微量细胞中和试验、T淋巴细胞增殖实验及CTL杀伤实验等方法检测免疫反应。结果:成功表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单克隆抗体(mAb)所识别的融合蛋白;重组的腺病毒可以有效诱导针对汉坦病毒NP及GP的体液免疫应答和细胞免疫应答;同时我们发现含有CTL表位的重组腺病毒比不含CTL表位的重组腺病毒可以诱导小鼠产生更为有效的细胞免疫反应。结论:构建的含CTL多表位的重组腺病毒可以有效的提高嵌合基因刺激细胞免疫应答的能力。  相似文献   
3.
整合素β_3与汉坦病毒囊膜糖蛋白在RRS系统中的相互作用   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:采用RRS酵母双杂交系统,研究人整合素β3与汉坦病毒囊膜糖蛋白的相互作用,进一步揭示汉坦病毒入胞机制.方法:大量制备前期构建的β3-pYesM△PolyA、 G1-Met和G2-Met质粒,共转染至酵母温度敏感株cdc25-2,进行双杂交鉴定.结果:双杂交结果表明,β3可与汉坦病毒囊膜糖蛋白G2在酵母菌中相互作用,而不与G1相互作用.结论:在汉坦病毒与整合素β3受体相互作用的过程中,汉坦病毒囊膜糖蛋白G2可能起到主要作用.  相似文献   
4.
目的:利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质,探讨分泌型抗成骨肉瘤单链双功能抗体基因的表达。 方法:①将单链抗体基因(ScFv)与白细胞介素2基因亚克隆至反转录病毒表达载体PLxSN,重组质粒pL(ScFv-IL-2)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人成骨肉瘤细胞命名为OSC/ScFv-IL-2。②以PCR,RT-PCR以及Western blotting 对ScFv-IL-2基因修饰的OSC9901细胞进行鉴定。在构建融合蛋白之后,运用DNA分析软件(DNAssist)和蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质。 结果:①经酶切及PCR分析鉴定,成功地构建了融合基因表达载体pL(ScFv- IL-2)SN,并获得高滴度产毒细胞株C26;Western blotting分析证明ScFv- IL-2基因融合蛋白的表达。②运用DNAssist核酸序列分析软件分析ScFv-IL-2DNA序列翻译并获得了氨基酸序列,运用蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析融合蛋白的二级结构及其理化性质。 结论:利用生物信息学网络资源可以分析预测融合蛋白的性质,为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据。  相似文献   
5.
目的在本室前期工作的基础上构建汉滩病毒M基因G1片段与S基因0.7kb片段嵌合基因的重组腺病毒。方法构建含有汉滩病毒G1S0.7嵌合基因的转移载体pShuttle-G1S0.7,然后通过特异性的酶切将嵌合基因与腺病毒DNA相连,电转化E.coli JM109,获得重组腺病毒Adeno-G1S0.7 DNA,转染HFX293细胞得到重组腺病毒。进一步对重组腺病毒的滴度和表达产物进行鉴定。结果构建的含G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒,滴度可达10^13~10^15 PFU/L;该重组腺病毒感染Vero-E6细胞后,表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1的特异性单抗(mAb)所识别的融合蛋白。结论利用腺病毒表达系统,成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G1生物学活性的融合蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。  相似文献   
6.
目的:将汉滩病毒核蛋白(NP)主要抗原位点活性片段与囊膜糖蛋白G2进行融合原核表达及鉴定,为该融合蛋白的真核表达及汉滩病毒基因工程疫苗研究打基础。方法:构建了汉滩病毒76-118株M基因G2片段与S基因5'端700bp片段的嵌合片段原核表达载体pGEX-4T1-G2S0.7,诱导表达相应的融合蛋白,用Western blotting和ELISA 方法进行鉴定。结果:酶切结果显示成功构建了原核表达载体pGEX-4Tl-G2S0.7。IPTG诱导表达4h后,Western blotting显示诱导出分子量约100kD的含GST的融合蛋白(GST-G2N0.7)。ELISA结果表明该融合蛋白与抗汉坦病毒NP特异性McAb有较高的结合活性(P/N值为0.71/0.07),与抗汉滩病毒蛋白特异性McAb也有较弱的结合活性(P/N值为0.21/0.08)。结论:S、M基因拼接方式是成功的,能够表达出有活性的汉滩病毒G2糖蛋白与NP片段的融合蛋白。  相似文献   
7.
目的 利用生物信息学分析单纯疱疹病毒2型(HSV-2)基因序列的特点,设计HSV-2诊断芯片的Oligo探针. 方法 利用Matlab7.0和ANTHEPROTV5对HSV-2序列进行分析,并通过BLAST软件对HSV-2的DNA序列进行序列比对,得到有意义的特异序列;用生物学软件Oligo6.0设计特异性高、Tm值相近、长度均一的Oligo探针. 结果 利用Madab7.0和ANTHEPROT V5分析HSV-2二级结构的分布以及其理化性质,同时生物学软件Olig06.0获得13条60-merOligo探针.结论通过生物信息学设计HSV-2诊断芯片的探针,可为后期打印成DNA芯片,用于HSV-2的检测打下基础.  相似文献   
8.
与传统教学形式相比,小班课教学有着许多优势,教学组近年来一直承担着本校生物技术专业的病毒学课程,该专业人数少、学生素质高,教学组通过利用小班课教学优势,在教学中切实抓好授课的每一个环节,不断优化教学方法,从而提高教学质量。  相似文献   
9.
目的检测汉坦病毒感染BALB/c小鼠组织中特异性抗原及病毒RNA,建立汉坦病毒感染动物的评价体系。方法将1000LD50的汉坦病毒悬液经肌肉注射感染BALB/c小鼠,在感染后的第3天,分别取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑等组织研磨后制成病毒悬液,以ELISA法和qRT—PCR法分别检测各组织中的汉坦病毒特异性抗原及病毒RNA。结果BALB/c小鼠感染汉坦病毒后短期内在脑和肝组织中可以检测到大量汉坦病毒特异性抗原以及病毒RNA,而心、脾、肺、肾组织中未检测到特异性抗原及病毒RNA。结论实验结果为建立汉坦病毒感染动物模型的评价体系提供了参考依据。  相似文献   
10.
目的:利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质,探讨分泌型抗成骨肉瘤单链双功能抗体基因的表达.方法:①将单链抗体基因(ScFv)与白细胞介素2基因亚克隆至反转录病毒表达载体PLXSN,重组质粒PL(ScFv-IL-2)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人成骨肉瘤细胞命名为OSC/ScFv-IL-2.②以PCR,RT-PCR以及Western blotting对ScFv-IL-2基因修饰的OSC9901细胞进行鉴定.在构建融合蛋白之后,运用DNA分析软件DNAssist)和蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质.结果:①经酶切及PCR分析鉴定,成功地构建了融合基因表达载体PL(ScFv-IL-2)SN,并获得高滴度产毒细胞株C26:Western blotting分析证明ScFv-IL-2基因融合蛋白的表达.②运用DNAssist核酸序列分析软件分析ScFv-IL-2DNA序列翻译并获得了氨基酸序列,运用蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析融合蛋白的二级结构及其理化性质.结论:利用生物信息学网络资源可以分析预测融合蛋白的性质,为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据.  相似文献   
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