抗人大肠癌HCAb嵌合抗体在CHO细胞中的高效表达

目的 在CHO细胞中高效表达抗人大肠癌HCAb人-鼠嵌合抗体.方法 从分泌鼠源单抗CAb的杂交瘤细胞中克隆、扩增可变区基因,测序鉴定后连入真核表达载体,转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢（dihydrofolate reductase-deficient Chinese hamster ovary,CHO-dhfr-）细胞进行表达.经G418及氨甲喋呤（MTX）梯度加压筛选进行嵌合抗体的高效表达,并用夹心ELISA方法测定嵌合抗体表达产量.结果 采用RT-pCR、夹心ELISA等实验证实了所表达的抗人大肠癌HCAb嵌合抗体的人源性.培养上清中的抗体产量可达20mg/L.结论 成功的实现了抗人大肠癌HCAb人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中高效表达,为其进一步在大肠癌临床诊治中的应用奠定了基础.     

抗人p185erbB2人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建表达及活性测定

目的:HER2/neu过度表达见于多种恶性肿瘤.作为肿瘤抗原,p185erbB2是一个理想的肿瘤治疗靶点.本实验在既往工作基础上,构建嵌合型抗p185erB2单克隆抗体(单抗)的真核表达载体,并在CHO-dhfr-细胞中表达,从而降低鼠源性抗体的免疫原性,为进一步的应用研究奠定基础.方法:RT-PCR扩增p185erbB2单抗1-2的轻、重链可变区基因,插入嵌合抗体真核表达载体pWSD2中,脂质体转染CHO-dhfr-细胞.经RT-PCR、间接ELISA、Western blot检测人-鼠嵌合抗体的表达水平,用ELISA、免疫沉淀方法对嵌合抗体的亲和力和特异性进行初步鉴定.此外,采用MTT比色法检测嵌合抗体对高表达p185erbB2的乳腺癌细胞系SKBR3的生长抑制作用.结果:用RT-PCR、间接ELISA、Western blot方法证明人-鼠嵌合抗体在CHO-dhfr-细胞中表达;ELISA检测提示嵌合抗体与高表达p185erbB2的细胞反应阳性,与低表达p185erbB2的细胞反应阴性;免疫沉淀结果表明嵌合抗体可与p185erbB2分子特异性结合;MTT比色法检测表明嵌合抗体对过表达p185erbB2的乳腺癌细胞SKBR3的生长有抑制作用.结论:CHO-dhfr-细胞表达的人-鼠嵌合抗体可与p185erbB2特异性结合,并可抑制高表达p185erbB2的肿瘤细胞生长,表明抗人p185erbB2人-鼠嵌合抗体具有肿瘤生物治疗的潜在应用价值.     

CD20嵌合抗体的构建、表达及纯化的实验研究

目的构建CD20嵌合抗体,检测其活性并纯化该嵌合抗体。方法从杂交瘤细胞株中分别扩增抗鼠CD20抗体的轻链和重链基因的可变区,并与人的轻链和重链恒定区连接,分别克隆到pTY5真核表达载体,然后共转染293E细胞,通过RT-PCR检测mRNA的转录,夹心ELISA检测抗体表达量,流式细胞术(FCM)分析嵌合抗体的结合特异性。结果正确扩增得到抗CD20人鼠嵌合抗体的轻链和重链基因片段并成功构建重组真核表达载体pTY5-CD20H和pTY5-CD20L,在293E细胞中进行瞬时表达,RT-PCR显示抗体基因在细胞中进行了成功的转录,ELISA测定抗体表达量在15～24 ng/mL之间,流式检测结果证实细胞上清分泌的抗CD20嵌合抗体可与NS-1细胞株结合,并通过protein A柱亲和层析获取高纯度的抗CD20嵌合抗体。结论成功构建表达抗CD20嵌合抗体的载体,且表达的抗体具有结合活性,为下一步研究慢性荨麻疹的发病机制及治疗打下基础。     

人肠三叶因子真核载体的构建与表达

目的 构建人肠三叶因子(hITF/hTFF3)的真核载体并在真核细胞中表达.方法 从人结肠粘膜提取总RNA,逆转录多聚酶反应制备总cDNA,PCR扩增hTFF3基因,TA克隆至pGEMT载体中,测序鉴定后将hTFF3基因重组到真核表达载体pCMV5-myc中,转染真核细胞293-T,裂解细胞后分别采用鼠抗人c-myc抗体和鼠抗人11下3抗体行Western-blot了解hTFF3表达情况.结果 从人结肠粘膜成功克隆了hTFF3基因并经测序验证,构建了pCMV5-myc-hTFF3真核表达载体,转染细胞后行western-blot提示hTFF3可在293-T细胞中表达.结论 成功构建pCMV5-myc-hTFF3重组真核载体并在293-T细胞中表达hTFF3蛋白,为进一步研究hTFF3的功能、作用机制及相互作用蛋白奠定了基础.     

抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建及瞬时表达

目的构建及瞬时表达抗人CD28鼠-人嵌合抗体。方法采用基因工程技术,从分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株（克隆号：2F5）中克隆出抗体重链和轻链可变区基因及相应信号肽编码序列。分别与人免疫球蛋白IgG1恒定区重、轻链基因拼接,构建含有重组基因的pIRES表达质粒pIRES/h2F5。转染293T细胞并用抗性药物G418选择培养。采用流式细胞术,检测瞬时转染细胞后嵌合抗体的表达情况。结果抗人CD28鼠人嵌合抗体得到表达并能与CD28分子特异性结合。结论抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建和瞬时表达是成功的,为后续构建稳定分泌抗人CD28鼠-人嵌合抗体的CHO基因转染细胞株奠定了基础。     

抗HFRS病毒单抗1A8鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体的构建及表达

目的 构建HFRS病毒mAb1A8鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体，并进行表达。方法 将抗HFRS病毒mAb1A8的VH基因和人重链CH1基因加接，VL基因和人Ck基因连接，分别构建了鼠/人嵌合重链Fd基因和轻链基因，将它们克隆人pComb3，构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗表达载体，用辅噬菌体VCSM13超感染，ELISA间接夹心法检测抗体活性。结果 经多种限制性内切酶酶切鉴定载体构建正确，ELISA间接夹心法检测超感染上清为阳性。结论 成功构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体，并在噬菌体表面表达出可结合HFRS病毒抗原的鼠/人嵌合Fab抗体。     

人源性鼻咽癌抗独特型单链抗体基因G22真核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建含人源性鼻咽癌抗独特型单链抗体基因G22的真核表达载体,并观察其在直肠癌细胞(rectal cancer cells,CMT-93)中的表达.方法:将目的基因G22克隆入真核质粒pcDNA3.1( )中构建真核表达载体pcDNA3.1( )-G22,并进行酶切鉴定和DNA序列测定.用脂质体法将重组质粒转染入CMT-93细胞,以Western免疫印迹、流式细胞术和免疫荧光检测G22基因的表达.结果:酶切鉴定和DNA序列分析证实,重组质粒pcDNA3.1( )-G22含有人源性鼻咽癌抗独特型单链抗体基因G22的全长序列,转染实验表明G22基因能在真核细胞CMT-93中正确表达.结论:人源性鼻咽癌抗独特型抗体基因G22真核表达载体构建及其在CMT-93细胞中的表达均获成功,为基因疫苗的进一步研究奠定了基础.     

提高抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体的表达和抗体的功能鉴定

目的 探讨人-鼠嵌合抗体ch-BD1体内和体外的表达和功能。方法 用分子生物学方法得到系列弱化表达的双氢叶酸还原酶(DHFR)基因片段,将其克隆入载体pDHL-BD1中构建得系列弱化表达DHFR基因的人-鼠嵌合抗体pWSD1-BD1,pWSD2-BD1,和pWSD3-BD1。将这些嵌合抗体以及pDHL-BD1分别转染缺陷表达DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)/DHFR-细胞,以Northern印迹鉴定其DHFR基因表达水平。将不同浓度的氨甲蝶呤(MTX)加入转染细胞的培养液,测定上清中的抗体水平。用 ~(99m)标记纯化的ch-BD1,加入系列稀释的人膀胱癌EJ细胞溶液中,测定结合在细胞上的抗体放射活性,计算标记抗体的亲和常数。将人膀胱癌EJ细胞注射入3只Balb/C小鼠后肢根部,4周后对肿瘤进行放射免疫显像。将标记抗体注射入小鼠尾静脉,分别于2 h,6 h,22 h和24 h后进行放射显像。结果 构建载体的 DHFR基因表达活性由强至弱的顺序为 pDHL-BD1>pWS1-BD1>pWS3-BD1>pWS2-BD1。MTX浓度为10~(-6)mol/L时ch-BD1的表达水平与DHFR基因的基础表达水平明显相关,DHFR基础水平越高抗体的表达水平亦越高。EJ细胞与标记抗体孵育后,ch-BD1的免疫活性分数为76％,亲和常数为3.56×10~9 M~(-1);鼠单抗BD1的免疫活性分数为81％,亲和常数为1.22×10~9M~(-1)。~(99m)标记的ch-BD1经尾静脉     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体—低相对分子质量单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体的构建

目的：构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体。方法：应用重组DNA技术,将人工合成的尿激酶原信号肽基因与鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合基因连接,并保证在同一阅读框架,然后分别插入到pcDNA3和PMJK3两种真核表达载体中。结果：构建成可以在真核细胞中分泌表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的重组质粒pcDNA3-D1和pMJK3-D1。结论：为建立稳定分泌表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的细胞工程株奠定了基础。     

抗DR5单链抗体的构建与表达

目的:构建抗DR5单链抗体的真核表达载体,以实现真核表达。方法:RT-PCR法从分泌抗DR5抗体的杂交瘤细胞中合成第一链cDNA,用通用引物钓取单克隆抗体的轻、重链可变区基因。经测序和BLAST比对,证实为一株新的鼠源性抗体基因。利用overlapping PCR方法构建单链抗体真核表达载体pCMV-express-scFv,Lipofectamine2000法转染宿主细胞293T,72 h后ELISA法检测细胞培养上清,检测抗体表达。结果:经序列鉴定和BLAST比对证实克隆的抗体轻、重链可变区基因为新鼠源抗体基因。ELISA实验结果显示抗体有效表达在细胞培养上清中。结论:成功得到抗体轻、重链可变区基因,实现了抗DR5单链抗体的真核表达,为进一步的研究和开发奠定了基础。     

抗乳腺癌人鼠嵌合抗体的构建

目的：构建抗人乳腺癌单克隆抗体人鼠嵌合抗体，降低鼠源性抗体应用于人体的免疫排斥反应。方法：采用RT－PCR技术，从分泌抗人乳腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株CDI315B分离克隆抗体轻重链可变区基因，对其进行序列分析，将连接组建人鼠嵌合轻链和人鼠嵌合重链，然后分别将它们克隆到真核细胞表达载体pcDNA3。结果：构建的人鼠嵌合抗体基因克隆在真核细胞表达载体上。结论：人鼠嵌合抗体的构建为它的表达和临床应用打下基础。     

Nogo-66受体LRR功能区的真核分泌表达

目的: 构建含有人Nogo-66受体LRR功能区段cDNA序列的真核分泌型表达载体,并在COS-7细胞中表达. 方法: 采用定向克隆的策略,在保证阅读框正确的前提下,从原核表达载体pES-His/LRR上切下编码LRR的DNA片段,亚克隆入真核分泌型表达载体pSectag2B中,构建LRR与c-Myc表位、6His标签基因相融合的真核表达质粒pSectag2B/LRR,在Lipofectamine 2000介导下瞬时转染COS-7细胞. 结果: 利用针对c-Myc表位和6His标签的抗体分别作免疫荧光和Westernblot,证实胞内表达正确融合的目的蛋白;同时双抗体夹心ELISA也检测到转染细胞上清中存在融合蛋白. 结论: 真核表达质粒构建成功,转染后目的蛋白在COS-7细胞中实现分泌表达.     

重组抗死亡受体5人-鼠嵌合抗体的表达和活性研究

目的 获得重组抗死亡受体5(DR5)全长人-鼠嵌合抗体表达并研究其生物学活性.方法 利用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶(Furin)/口蹄疫病毒2A多肽(F/2A)连接人-鼠嵌合抗体的重链和轻链,形成一个开放阅读框(ORF),插入慢病毒表达载体pWPXL,构建重组抗DR5全长人-鼠嵌合抗体表达载体pWPXL-HF2AL;采用Western印迹测定该嵌合抗体的表达和采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其与抗原的结合特异性;使用四唑氮盐(MTS)比色法分析其对肿瘤细胞的杀伤活性.结果 利用F/2A多肽技术表达的人-鼠嵌合抗体可在F/2A处自我剪切,人-鼠嵌合抗体的轻、重链表达对称并具有与其母本鼠源抗体相似的亲和力和杀伤多种肿瘤细胞的活性.如含3μg/ml嵌合抗体的培养基使结肠癌细胞HCT116、肝癌细胞SMMC7721、肺癌细胞A549和神经胶质瘤细胞U251的细胞存活率分别降低至20.6%±2.6%,35.1%±2.7%,76.1%±6.2%和15.6%±2.0%.结论 成功实现F/2A多肽介导的全长人-鼠嵌合抗体的表达,为肿瘤的生物治疗提供了新的策略.

Abstract：

Objective To express a full-length human-mouse chimeric anti-DR5 antibody from a single open reading frame with tumoricidal activity to various cancer cells.Methods The heavy and light chains of chimeric antibody were joined by the Furin and 2A (F/2A) self-cleavage peptide and cloned into a lentiviral vector of pWPXL.Then the HEK293 cells were infected with the constructed expression vector pWPXL-HF2AL.Western blot,enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and MTS assay were used to detect the chimeric antibody expression,cleavage,binding affinity to the antigen and tumoricidal activity to various tumor cells.Results The recombinant chimeric antibody was successfully expressed from a single open reading frame in pWPXL-HF2AL construct.And it possessed a similar binding affinity to the parental murine counterpoint and strong tumoricidal activity to various cancer cells.For example,on the concentration of 3 μg/ml,it made the relative cells viability of HCT116,SMMC7721,A549 and U251 down to 20.6% ±2.6% ,35.1% ± 2.7% ,76.1% ±6.1% and 15.6% ±2.0% respectively.Conclusions The human-mouse chimeric anti-DR5 antibody of F/2A peptide is successfully expressed.Possessing a strong tumoricidal activity in various cancer cells,it may provide a novel strategy for cancer biotherapy.     

人白细胞介素18和新城疫病毒HN基因嵌合表达载体的构建与表达

目的：构建人白细胞介素18（IL-18）与新城疫病毒（NDV）HN基因嵌合表达质粒。 方法：选用适当的限制性核酸内切酶将NDV的HN基因连接至真核表达质粒pVAX1 IL-18中IL-18基因的尾部,同时替换掉IL-18基因的终止子,构建表达IL-18 HN 嵌合基因的pVAX1 IL-18 HN质粒,经酶切鉴定正确后,通过脂质体介导转染HeLa细胞,应用Western blotting及血凝试验检测其表达情况。 结果：酶切鉴定证实正确地构建了pVAX1 IL-18 HN嵌合表达质粒,Western blotting和血凝试验检测结果表明,嵌合后的IL-18和HN基因均能够表达,且表达的HN蛋白具有较高的血凝活性。 结论：IL-18和HN基因嵌合后不影响二者的表达,而且表达的HN蛋白具有血凝活性。     

甲胎蛋白与热休克蛋白70基因融合载体的构建及表达

目的：构建分泌性小鼠甲胎蛋白(α—Fetoprotein,AFP)与结核杆菌热休克蛋白70(mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70,Mt．HSP70)基因融合载体,并研究其在真核细胞中的表达情况。方法：以pSecTag2B为基本单位构建AFP及与HSP70的融合表达载体,融合基因以G-S-G-S连接子连接;用脂质体将系列载体导入COS-7细胞,48 h后以免疫化学方法检测其表达,抽提总RNA作RT-PCR测其在转录水平的表达。结果：构建的AFP和HSP70的单独及融合表达载体导入COS-7细胞48h后经细胞免疫化学染色为阳性,RT-PCR可扩增出特异性条带。结论：AFP和HSP70的单独及融合表达载体构建成功,能在真核细胞中表达。     

汉坦病毒S基因0.7 kb片段真核载体的构建、表达及基因免疫

目的 在本室前期工作的基础上,进一步进行汉坦病毒S基因0．7kb片段的真核表达及基因免疫的研究。方法 构建汉坦病毒76－118株S基因5'端700bp片段的真核表达载体pcDNA3.1-S0.7,脂质体转染COS－7细胞,免疫荧光检测表达结果;用该质粒免疫BALB／c小鼠,并用免疫荧光法及ELISA法检测免疫的体液免疫应答效果。结果 免疫荧光检测结果表明,目的基因在COS－7细胞中获得瞬时表达;用pcDNA3.1-S0.7基因免疫小鼠可引起抗汉坦病毒核蛋白（NP）特异性的抗体应答。结论 汉坦病毒S基因0．7kb片段可刺激机体产生特异的抗汉坦病毒体液免疫应答。为进一步进行细胞免疫反应的检测及基因疫苗的研究提供实验基础。     

HCV E2和HBV preS融合蛋白真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)E2和乙型肝炎病毒(HBV)preS融合蛋白的真核表达载体.方法:用PCR方法扩增HBV preS和HCV E2蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体pcDNA3中,用脂质体转染试剂将其转入COS7细胞,通过免疫荧光检测细胞瞬时表达的融合蛋白.结果:E2-preS融合蛋白基因包括了全长的HBV preS和HCV E2蛋白基因,嵌合基因长度约1.6 kb.表达载体在COS7细胞表达出了E2-preS融合蛋白.结论:构建的E2-preS融合蛋白表达载体能在哺乳动物细胞中表达融合蛋白,为获得真核表达的融合蛋白及研究此蛋白的免疫原性打下基础.