高活力原代小鼠肝细胞的分离与纯化

目的建立一种稳定的能获得高活力和高纯度原代小鼠肝细胞的分离和纯化方法。方法对传统的两步原位胶原酶灌注法进行4个方面的优化,主要包括选择逆向灌流、将持续灌注法改为间断灌注后夹闭门静脉法、严格控制胶原酶消化时间和将分离的肝细胞悬液进行低速Percoll单密度离心纯化。分离后的肝细胞进行体外培养。肝细胞活力和得率用台盼蓝染色法检测。结果新鲜分离的小鼠原代肝细胞活力能稳定达到87%±3%,平均活细胞总数为8×105每克小鼠体重,绝大部分细胞在体外培养2h后贴壁生长。结论优化后的肝细胞分离方法更为稳定、有效,分离到的肝细胞具有高活力的优点。     

小鼠肝细胞的分离与原代培养

目的：探求一种简易、经济的小鼠原代肝细胞的分离与培养方法。方法：采用非灌注法分离小鼠肝脏,利用0.2%Ⅳ型胶原酶对肝脏消化来获取肝细胞,以DMEM培养基对肝细胞进行单层培养。结果：比较成功地进行了原代肝细胞培养,并进行了形态学观察。结论：此方法适合一般实验室开展小鼠原代肝细胞的分离与培养,为进一步的实验研究提供了基础。     

高效分离屠宰成年猪肝细胞用于生物人工肝方法的建立

【目的】探讨氧合dispase及胶原酶组酶消化法从屠宰成年猪肝脏高效分离肝细胞的方法及分离肝细胞的生物活性。【方法】部分肝叶逆行灌注、氧合组酶dispase及胶原酶消化、密度梯度离心法分离、纯化肝细胞 ,并对其生物活性进行检测。【结果】肝组织细胞的收获量达10× 10 6 个 / g ,细胞平均存活率可达 92 5 % ,且无泡状变性的发生 ,原代培养生物活性与原代培养鼠肝细胞一致 ,随时间的延长而减退。【结论】氧合组酶dispase及胶原酶消化、密浓度梯度离心法自屠宰成年猪分离肝细胞产量高、且保持着良好的生物活性 ,可作为生物人工肝的理想肝细胞源用于肝脏终末性疾患的治疗。     

大鼠肝星状细胞的分离、培养与鉴定

目的:改进大鼠肝星状细胞的分离、培养方法,提高其分离质量。方法:取成年雄性Wistar大鼠,用链蛋白酶、胶原酶体内门静脉灌注消化大鼠肝脏细胞,经Nycodenz密度梯度离心分离肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力,Desmin免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。结果:肝星状细胞得率为2.8×107/肝。肝星状细胞存活率在90%以上。Desmin阳性细胞原代培养达90%以上,传代培养达95%以上。结论:改良大鼠肝星状细胞的分离、培养方法,有利于原代大鼠肝星状细胞的生物学研究。     

肝脏灌注分离大鼠肝细胞及原代培养的方法

目的　建立分离及原代培养大鼠肝细胞的实验技术方法。方法　先后用无Ca2 灌流液及 0 .0 5 %Ⅳ型胶原酶灌注大鼠肝脏 ,分离肝细胞 ,进行原代培养。结果　用台盼蓝排除试验测肝细胞活率大于 90 % ,产率大于 3 .0× 10 8个活细胞。结论　灌注分离大鼠肝脏可获得大量肝细胞 ,而且存活率高 ,原代培养 2 4h后肝细胞完全贴壁 ,形成单层     

猪肝细胞的分离与原代培养

目的：建立稳定的猪肝细胞的分离与原代培养体系,满足生物人工肝体外支持系统对肝细胞的需求。 方法:应用改良Seglen法进行肝脏原位胶原酶灌流分离猪肝细胞,进行平面培养,动态观察细胞生长过程中的形态结构变化。 结果：平均每只猪可获得2×10¹⁰个肝细胞,细胞活率达到92.5%。在平面培养过程中维持了正常肝细胞的形态。 结论：原位胶原酶灌流法是获得大量高活率的猪肝细胞的首选方法,猪肝细胞原代分离培养是目前解决组合型生物人工肝脏（HBLSS）应用中细胞来源问题的主要途径。     

改良原位二部法门脉胶原酶灌注分离单肝细胞

改良原位二部法门脉胶原酶灌注分离单肝细胞首都医科大学宣武医院普外实验室孙海晨李铎刘爽孙家邦单肝细胞在细胞生物和肝病研究中有广泛的用途。但肝脏组织细胞间结缔组织致密、连接紧密，单纯机械方法分离无法获得单肝细胞，故常需经门静脉胶原酶灌注获得单肝细胞。传统...     

Isolation and cultivation of porcine hepatocytes for extracorporeal artificial liver support system

目的　开发从屠宰器官进行高活性猪肝细胞规模分离的优化程序。方法　采用部分肝叶逆行灌注、机械及组酶肝消化并经密度梯度离心获取高产量、高纯度肝实质性细胞。结果　部分肝叶经消化可获取 1 39× 10 9肝细胞的平均产量 (9 9× 10 6肝细胞 /克组织 )及 92 5 %的平均细胞存活率。经组合性dispase/胶原酶的消化处理肝细胞的收获量及存活率明显增加。对细胞灌流及分离液进行氧化处理能阻止泡状细胞的发生。分离的猪肝细胞经原代培养其活性及机能保持着与鼠肝细胞一致的水平 ,且随时间的推移而减退。结论　通过我们改良的方法可收获高产量成年猪肝细胞 ,并保持良好的活性与分化机能。因此 ,成年猪肝细胞被证实是人工肝脏辅助支持系统中生物组的一个很有价值的肝细胞来源。     

分离日本血吸虫感染小鼠模型肝星状细胞的改良方法

目的提供适用于日本血吸虫感染小鼠模型活化后肝星状细胞分离的新方法,并确定最适宜的密度分离液浓度。方法构建日本血吸虫感染BALB/c小鼠模型,对小鼠模型分别进行经下腔静脉逆行灌注和门静脉顺行灌注,充分完全消化小鼠肝脏,获得肝脏细胞悬液。利用Optiprep密度梯度离心法逐步纯化获得活化的原代肝星状细胞。通过流式分选法和Real-time PCR验证实验结果,统计分析通过不同浓度分离液密度获得的肝星状细胞数量和纯度。结果当分离液密度分别为13.5%、15.0%、16.5%和18.0%时,富集到的肝星状细胞数量依次升高,肝星状细胞的纯度分别可达56.1%、90.3%、75.9%和71.1%。比较流式分选法得到的细胞与本实验得到的原代肝星状细胞纯度,二者间差异无统计学意义(P0.05)。结论改良后的实验方法可在日本血吸虫感染小鼠模型中高产量地分离出活化的高纯度原代肝星状细胞,且更加经济便捷、实验结果稳定。     

Optiprep法分离大鼠肝星状细胞的实验研究

目的：建立一种合理、经济、便捷的大鼠原代肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）分离方法。方法：运用改良肝脏原位灌注D-Hanks后,改用Ⅳ型胶原酶和DNA酶Ⅰ离体灌注,10%、16%Optiprep密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞,台盼蓝排斥试验鉴定细胞活力,α-SMA免疫细胞化学法鉴定细胞纯度。结果：我们采用Optiprep密度梯度离心法成功分离出大鼠HSC,且活力、纯度均达到研究要求,HSC得率约为2×107/肝,细胞存活率为95%以上,纯度为90%以上。结论：本方法分离大鼠HSC合理、经济、便捷。     

复方甘草酸苷在猪肝细胞悬浮培养中的应用

目的探讨复方甘草酸苷对体外悬浮培养肝细胞的保护作用。方法原位胶原酶循环肝灌注法分离猪肝细胞,将分离所得猪肝细胞分为2组,复方甘草酸苷组培养基中含有800ug/mL的复方甘草酸苷,对照组为普通培养组,悬浮培养1周,观察形态和功能的变化。结果2组肝细胞培养12h后均形成多细胞球样聚集体,复方甘草酸酐培养组肝细胞成团更为明显;复方甘草酸苷培养组上清液ALB在培养后24h、3d、5d高于单纯肝细胞培养组（P〈0.05）,在培养24h后,与培养后12h相比,复方甘草酸苷组ALB开始升高,普通培养组ALB开始降低,其后2组都开始升高,至7d时下降（P〈0.05）;2组肝细胞培养上清液BUN含量随培养时间延长逐渐升高,但2组之间差异无统计学意义（P〉0.05）;2组肝细胞上清液中ALT含量逐渐下降,第3～7天复方甘草酸苷培养组组ALT含量低于单纯肝细胞培养组（P〈0.05）。结论复方甘草酸苷对体外悬浮培养的肝细胞具有保护作用。     

Ficoll及Percoll分离、纯化金黄地鼠肝细胞方法比较研究

目的建立经济有效的原代地鼠肝细胞分离纯化方法,并比较Ficoll及Percoll两种分离液分离出的肝细胞纯度及活性的差异。方法对传统的两步原位胶原酶灌流法进行简化,行肝脏原位灌流,离体后Ⅳ胶原酶进行消化;采用Ficoll及Percoll两种细胞分离液进行分离、纯化;纯化后于37℃5%CO2培养箱内孵育培养,0.4%台盼蓝拒染实验检测肝细胞的存活率。结果 Ficoll及Per-coll分离的地鼠肝细胞总数分别为（1.46±0.91）cells.g-1肝组织、（1.79±0.89）cells.g-1肝组织,即时分离的肝细胞活力和纯度相近,都大于95%,但后期二者差异较大,Percoll分离得的肝细胞活率较高,且细胞活性下降较缓慢。结论通过简化的门静脉原位灌流法和低浓度胶原酶离体消化,Per-coll或Ficoll分离液纯化,即时分离的肝细胞可保持良好的功能和活力,二者无显著差别,但从细胞培养的要求出发,Percoll优于Ficoll分离液。     

一种SD大鼠肝细胞原代培养的改良方法

目的 建立一种改良的大鼠肝细胞原代培养方法.方法取6到7周龄SD 大鼠（约200g）,3%戊巴比妥钠麻醉,采用Seglen两步胶原酶灌流法分离肝细胞,Percoll密度梯度离心纯化肝细胞,种植在预先用gelatin处理的培养皿内.结果 分离所得肝细胞成活率达95%以上.24h后用相差显微镜观察细胞贴壁良好,细胞形态规则;48h后细胞开始伸展.结论 使用改良的方法获得的细胞成活率高,贴壁牵,适合常见的药理毒理实验.     

胶原酶灌注法制备小鼠肝细胞

目的:建立体外培养小鼠肝细胞的实验体系。方法:采用两步原位胶原酶灌注法分离小鼠肝细胞,在RPM I1640培养液中培养。结果:用胶原酶灌注法分离的小鼠肝细胞活率可达90%以上,产量平均为2.8×107,完全满足实验要求。肝细胞在RPM I1640培养液中2 h即可贴壁,48 h内细胞贴壁充分,伸展良好,1周后死细胞增多。结论:胶原酶灌注法成功制备出小鼠肝细胞。     

一种简化的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法

目的 建立一种简单的能获得高纯度小鼠原代肝细胞的分离与培养方法。方法 将经典的两步灌流法简化为经下腔静脉逆向脉冲式灌注,利用低速离心法对肝细胞分离液进行纯化;利用锥虫蓝染色法鉴定细胞活率;培养瓶预先用鼠尾胶原铺备,利用倒置显微镜观察细胞形态。结果 此法得到了足够数量的肝细胞,细胞活率大于90%;细胞可稳定贴壁1周。结论 成功建立了一种简单的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法。     

原代大鼠肝细胞分离与纯化方法

目的探讨改良、简化肝细胞的灌注、分离方法,以提高细胞产量,降低制作成本.方法对传统的两步原位胶原酶灌流法进行改进,改变灌注方式,分离的大鼠肝细胞采用三次低速离心,台盼兰染色检测活率,并与Percoll梯度离心纯化法进行比较.结果大鼠肝细胞经低速离心后,活率仅（48.38±6.97）%.三次离心后再经Percoll梯度离心纯化后活率为（92.63±2.50）%,纯度〉95%,纯化前后活率比较差异有显著性（P〈0.01）.结论该方法要求设备简单、容易操作,细胞产量、活率及纯度高.     

一种易操作的小鼠肝细胞的分离及培养方法

目的在传统肝细胞提取方法的基础上,优化一种易操作、快速实用获取小鼠肝细胞的方法,为从事肝脏功能相关研究人员提供改良的实验方法参考。方法以肝脏分离液逆向灌注小鼠肝脏后,剪碎,肝脏酶消化后密度梯度离心分离肝细胞,转入培养基培养。采用台盼蓝染色计算细胞活力,流式细胞检测技术计算纯度,倒置显微镜观察细胞形态。结果获得较高纯度和活力的肝细胞,具备肝细胞的典型形态特征。结论通过逆向灌注,降低了灌注的难度,同时获得较高纯度、较高活力的肝细胞,经多次实验证明该方法确实是一种易操作、高效适用的肝细胞提取方法。