pEGFP-AFP-TK重组真核表达载体的构建及在PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体介导下转染肝癌细胞

目的:构建甲胎蛋白(AFP)启动子介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)重组真核表达载体,并检测其在AFP阳性肝癌细胞株的特异性表达.方法:PCR 扩增AFP 基因启动子、HSV-TK基因,将上述片段插入EGFP-N1载体的多克隆位点,构建pEGFP-AFP-TK重组表达载体,通过包裹PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体,经其介导,转染AFP 阳性肝癌细胞株HepG2 和AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721, 利用增强型绿色荧光蛋白及Western blotting法检测目的基因在2种细胞系中的表达.结果与结论:肝癌特异性真核表达载体pEGFP-AFP-TK构建成功.利用增强型绿色荧光蛋白及Western blotting法可以检测到嵌合AFP启动子的pEGFP-AFP-TK重组真核表达载体能够特异性在AFP阳性的肝癌细胞株表达,而在AFP阴性的肝癌细胞株中基本不表达.     

pcDNA3.1-mAFP真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建真核表达载体pcDNA3．1-mAFP，观察其在293肿瘤细胞中的表达情况。方法从Hepal-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白（mAFP）基因编码区全长序列，测序确认后，插入到pcDNA3．1真核表达载体中，双酶切鉴定。用Lipofectamine脂质体将构建的重组载体转染293肿瘤细胞，检测AFP蛋白在293细胞中的表达情况。结果成功克隆了mAFP基因编码区全长序列，构建出重组真核表达载体pcDNA3．1-mAFP，脂质体转染后可检测到mAFP基因在293细胞中的表达。结论该研究成功构建了重组pcDNA3．1-mAFP真核表达载体，为进一步开展原发性肝癌的靶向性基因治疗奠定了基础。     

pcDNA3.1-hTERT真核表达载体的构建及其抗肿瘤效应

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)真核表达载体pcDNA3.1-hTERT,并观察其对荷瘤小鼠的抗肿瘤效应.方法:用RT-PCR方法扩增出带有Hind Ⅲ, BamHⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy克隆载体连接,筛选出阳性克隆,酶切获得目的片段,与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-hTERT表达载体.将真核表达载体pcDNA3.1-hTERT注射移植性H22肝癌模型C57BL/6小鼠,并设PBS组及转染空质粒pcDNA3.1组,观察3组的抗肿瘤效应.结果与结论:成功构建pcDNA3.1-hTERT真核表达载体.该载体中的hTERT基因片段全长为951 bp,可编码相对分子量为37 000、由317个氨基酸构成的多肽.该基因片段与GenBank公布的相应基因进行同源性比较,核苷酸序列的同源性为98.73%,编码产物的氨基酸序列的同源性为99.68%.该真核表达载体免疫荷瘤小鼠后,pcDNA3.1-hTERT组肿瘤生长受到抑制,且该组生存期分别长于PBS组及pcDNA3.1组 (P<0.05);pcDNA3.1- hTERT组的IL-2、IFN-γ细胞因子水平也均高于PBS组与pcDNA3.1组(P<0.05).提示该真核表达载体在受试动物体内可有效地诱导特异性抗肿瘤免疫应答.     

不同启动子调控的PNP基因载体的构建和表达差异性分析

目的分别构建巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)通用启动子和甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)组织特异性启动子调控的PNP基因表达载体并分析二者表达的差异性。方法将AF0．3启动子插入载体pcDNA3．0，构建肝癌细胞特异表达载体pAF0．3；将PNP基因分别插入到pcDNA3．0和pAF0．3中，构建不同启动子调控下的PNP基因表达载体pcDNA3．0／PNP和pAF0．3／PNP；通过酶切、PCR及测序鉴定各重组体。采用脂质体介导法将两种PNP基因表达载体转染不同的细胞株，RT—PCR检测PNP基因在各细胞株中的表达，分析二者表达的不同。结果各目的片段均成功插入相应的载体中，CMV启动子调控下的PNP基因在各株细胞中均实现了表达，而AF0．3启动子调控下的PNP基因则在AFP阳性肝癌细胞中实现了组织特异性表达。结论两PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效的治疗载体，且pAF0．3／PNP还实现了在AFP阳性肝癌细胞中的靶向性表达。     

NS特异性siRNA真核表达载体的构建

目的：构建nucleostemin(核干细胞因子，NS)特异性siRNA真核表达载体。方法：以小鼠组织基因组DNA为模板，PCR方法克隆小鼠编码U6 snRNA基因的启动于，将NS—siRNA表达序列、PolⅢ识别的终止信号与U6启动于连接起来，并将其插入pcDNA4／C载体中。结果：(1)从小鼠基因组DNA中克隆到编码U6 snRNA基因的启动子，(2)构建了含有U6启动子、NS—siRNA表达序列和PolⅢ识别终止信号的NS—siRNA表达的片段，(3)将NS—siRNA表达片段插入了pcDNA4／C真核表达载体。结论：构建了针对NS特异性的siRNA真核表达载体pcDNA4／C—NS—Silencer。     

PNP-TK融合自杀基因系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的分析PNP—TK融合自杀基因系统对HepG2肝癌细胞的杀伤作用及其对肝癌细胞的杀伤机制。方法利用重组PCR定点诱变法制备PNP—TK融合基因,将其插入真核表达载体pcDNA3．0中,构建融合基因表达载体pcDNA3．0／PNP—TK,经酶切、PCR及测序鉴定重组体,G418筛选获得稳定转染了pcDNA3．0／PNP—TK的抗性细胞克隆。RT-PCR和WesternBlotting检测PNP—TK基因在HepG2细胞中的表达。台盼兰排斥法测定细胞生长曲线,MTF法检测细胞对相应前药的敏感性及分别在一种和两种前药作用下所导致的旁观者效应。结果融合基因片段PNP—TK正确插入了pcDNA3．0载体中,pcDNA3．0／PNP—TK在肝癌细胞株HepG2中实现了表达。细胞抗性克隆对相应的前药十分敏感。在两种前药的联合作用下,pcDNA3．0／PNP—TK对肝癌细胞产生了良好的旁观者效应。结论具有双自杀基因功能的表达载体pcDNA3．0／PNP-TK对肝癌细胞HepG2有着良好的杀伤作用,有望将其应用于肝癌体内治疗。     

含HSV-TK基因的真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的　构建AFP增强子CMV启动子调控下的HSV -TK真核表达质粒用于肝细胞癌的靶向基因治疗。方法　采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增AFP基因增强子最小的功能片断 ,插入pcDNA3.1-LUC质粒的BglII位点 ,从而构建重组表达质粒 pAFP -LUC。HSV -TKcDNA全长序列替换pAFP -LUC质粒中EcoRI位点的LuciferasecDNA全序列构建重组表达质粒 pAFP -TK。质粒 pAFP -LUC采用脂质体法转染AFP阳性的肝癌细胞系HepG2及AFP阴性的非肝癌细胞系HeLa ,用Luciferase分析试剂盒分析Luciferase的表达情况。结果　PCR扩增所得AFP增强子片段的长度和序列通过琼脂糖凝胶电泳、DNA测序得到证实。采用限制性内切酶酶切及PCR方法证实质粒pAFP -LUC中插入的AFP增强子大小、位置及方向均正确。酶切后凝胶电泳分析证实HSV -TK已成功地定向克隆入真核表达载体中。Luciferase报道基因的表达受AFP增强子的调控 ,在AFP阳性肝癌细胞HepG2中高效表达 ,而在AFP阴性的HeLa细胞中表达很低 ,这种差异具有显著性 ,P <0 .0 5。结论　AFP增强子CMV启动子调控的HSV -TK真核表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的特异性表达为肝细胞癌的靶向基因治疗提供了实验基础。     

MDR1启动子调控的双自杀基因真核表达载体的构建及其在K562/A02细胞中的表达

目的：构建多药耐药基因（MDR1）启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体用于耐药白血病的靶向性基因治疗。方法：采用PCR方法从K562/A02细胞基因组DNA中扩增MDR1启动子，将其连接到双自杀基因CD TK的上游，构建pcDNA3 MDR1 Promoter CD-TK真核表达载体，用脂质体介导法将构建好的载体转染入K562、K562/A02细胞，PCR鉴定CD、TK基因的整合，RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确，通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。转染入细胞后PCR结果显示，CD、TK基因均整合入K562、K562/A02细胞中，RT-PCR结果显示,562/A02/CD TK细胞CD、TK基因有特异性条带表达，而K562/CD TK细胞无特异性条带。结论： MDR1启动子调控的CD TK双自杀基因真核表达载体的成功构建及其在K562/A02细胞中的特异性表达为耐药白血病的靶向性基因治疗提供了实验基础。     

人巨细胞病毒IE1真核表达载体的构建与表达

目的构建人巨细胞病毒（HCMV）IEl真核表达载体，观察其在真核细胞内的表达，为HC—MVIEl核酸疫苗的相关研究奠定基础。方法将质粒pNEBl93-IEl用Sal I、BamH I双酶切与载体pEGFP—C1连接构建重组载体pEGFP—C1-IEl；双酶切鉴定后，取重组载体pEGFP—C1-IEl用EcoR I 、Hind Ⅲ／双酶切与载体pcDNA3．1（-）连接构建重组质粒pcDNA3．I（-）-IEl，双酶切和测序鉴定；将重组质粒pcDNA3．1（-）-IEl转染HeLa细胞，RT—PCR检测IElmRNA的表达。结果重组载体pEGFP—C1-IEl和pcDNA3．1（-）-IEl双酶切后均可切出约1476bp目的片段；重组载体pcDNA3．1（-）-IEI测序结果登录C,enBank，作BLAST分析，含有1476bp目的基因片段，无碱基错配和移码突变，与读码框完全-致；转染重组载体pcDNA3．1（-）-IEl的细胞中可扩增出约1476bp的目的条带。结论成功地构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-IEl，且其能在真核细胞内袁达。     

PNP—TK融合自杀基因及PNP单自杀基因对肝癌细胞杀伤效率

目的分析PNP—TK融合自杀基因系统及PNP单自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用及二者对肝癌细胞潜在的杀伤机制。方法构建融合基因表达我体pcDNA3．0／PNP—TK。经酶切、PCR及测序鉴定重组体。G418筛选获得稳定转染了pcDNA3．0／PNP-TK的HepG2细胞克隆。RT—PCR和Western Blotting检测融合基因在HepG2细胞中的表达。台盼兰排斥法检测细胞的生长曲线,MTT法检测细胞对相应前药的敏感性及分别在一种和两种前药作用下所导致的旁观者效应。结果融合基因片段PNP—TK正确插入了pcDNA3．0载体中,pcDNA3．0,PNP-TK在肝癌细胞株HepG2中实现了表达。抗性细胞克隆对相应的前药十分敏感。在两种前药的联合作用下。pcDNA3．0／PNP-TK所导致的旁观者效应明显强于只给予MeP-dR一种前药以及pcDNA3．0／PNP单基因系统所致的旁观者效应。结论具有双自杀基因功能的表达载体pcDNA3．0／PNP-TK对肝癌细胞的杀伤效果优于PNP单自杀基因系统。     

靶向性双自杀基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK构建的初步研究

目的 构建由癌胚抗原启动子(CEA promoter,Cp)驱动的靶向性双自杀基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK,并观察其在CEA阳性大肠癌细胞中专一性表达和对增殖的影响.方法 采用PCR分别扩增出Cp、CD、TK三种目的 基因并采用双酶切、连接依次将Cp、CD、TK基因插入pcDNA3.1(-)质粒;将靶向性载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK分别转染CEA阳性的人大肠癌SW480细胞和CEA阴性的Hela细胞,采用RT-PCR检测CD-TK基因的表达.用MTT法检测转染pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK后的SW480细胞对化疗前药5-氟胞嘧啶(5-Fc)和丙氧鸟苷(GCV)的敏感性.结果 Cp基因片段、CD基因片段和TK基因均克隆正确.靶向性基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK经凝胶电泳和DNA测序证实构建正确.转染了靶向性载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK的SW480细胞经过RT-PCR鉴定证实有CD-TK基因的表达,CEA阴性Hela细胞则没有CD-TK基因的表达.细胞培养试验中,转染了靶向性载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK的SW480细胞对前药5-Fc和GCV敏感.结论 正确构建了靶向性双自杀基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK,靶向性双自杀基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK能够使CD-TK基因在CEA阳性细胞中专一性表达,达到靶向杀伤大肠癌细胞目的 .     

人巨细胞病毒IE1-GFP融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建增强型绿色荧光蛋白(GFP)与人巨细胞病毒(HCMV)IE1融合蛋白真核细胞表达载体,为IE1基因的表达和功能研究提供基础.方法 将质粒pNEB193-IE1和载体pEGFP-C1分别进行双酶切获得目的基因IE1片段和空载体,回收纯化后用T4连接酶将两者连接并转化E.coli JM109,用salⅠ、BamHⅠ双酶切后琼脂糖电泳鉴定阳性克隆.结果 双酶切pEGFP-C1-IE1后,琼脂糖电泳可见到大小约1476 bp的片段,与IE1预期片段大小一致,即IE1亚克隆入pEGFP-C1.结论 成功地构建了HCMV IE1-GFP融合蛋白真核表达载体pEGFP-C1-IE1.     

HGFK1基因真核表达载体的构建及鉴定研究

目的构建携带人HGFK1基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-HGFK1。方法通过PCR方法从已经构建好的病毒穿梭载体中扩增出HGFK1基因,构建pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,经PCR、酶切、测序、蛋白表达等方法进行鉴定。结果PCR、酶切、测序以及蛋白表达证实pcDNA3.1（-）-HGFK1载体序列正确。结论本研究成功构建了pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,可为后续进行肝癌细胞的生物学研究提供帮助。     

重组乙酰胆碱受体α亚单位-BirA识别多肽序列基因的构建与表达

[目的]构建重组乙酰胆碱受体亚单位-BirA识别多肽序列基因(pcDNA 3.1-AChR-αBirA),并对其进行真核基因表达.[方法]设计引物生物素蛋白连接酶(BirA)识别多肽序列基因,将载体pcDNA3.1-AChR-αBirA识别多肽序列基因连接,并用EcoRⅤ单酶切检查BirA识别多肽序列基因插入的正确性,并测定序列进行验证.将构建成功的载体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞上进行表达,经激光扫描共聚焦显微镜验证其产物.[结果]电泳检查可见大小为63 bp的条带,经测定序列验证了插入的基因序列为BirA识别多肽序列基因;转染后经激光扫描共聚焦显微镜观察到CHO细胞膜上的绿色荧光.[结论]成功构建了AChR-αBirA识别多肽序列基因重组载体,并可在CHO细胞中较好地表达.     

14-3-3基因真核表达载体的构建

目的克隆人14-3-3基因并构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3。方法从胎脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人14-3-3基因的全长cDNA,将其插入pCUm-T载体中;序列测定后,重组携带14-3-3基因的表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3。结果经限制性内切酶酶切分析、PCR和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。结论成功构建了14-3-3真核表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3,为进一步研究14-3-3在帕金森病中的作用奠定了良好的基础。     

Gene Cloning of Murine α-Fetoprotein Gene and Construction of Its Eukaryotic Expression Vector and Expression in CHO Cells

Hepatocellularcarcinoma (HCC)isamajorcauseofcancerdeathwithmorethan 1.2millionglobalan nualincidences[1] .Surgeryandlivertransplantationaretheonlyeffectivetreatments ,butmostHCCpa tientsarenoteligiblebecauseofdiagnosisatalaterstageorunderliverinsufficiencyinthesettingofcir rhosis[2 5] .Thedevelopmentofnoveltreatmentstrategiesisneeded .TheAFPisanHCC associatedoncofetalantigen .ThemajorityofhumanHCCsoverexpresstheoncofetalantigenAFP .ThisMr 700 0 0 glycoprotein ,producedathighlevelsbyth…     

人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子驱动的增强绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达载体，研究其调控EGFP在肿瘤细胞中的靶向表达。方法：从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上，酶切获取约1100bv的启动子片段，克隆至无启动子的EGFP质粒载体pEGFP-1的多克隆位点中，构建pEGFP-hTERTp真核表达载体。用含有巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒pEGFP—N1作为阳性对照，pEGFP-1作为阴性对照，脂质体转染法分别转染人肺癌细胞95D，NCI—H446，A2，A549，LTEP—a-2，YTMLC和人正常细胞MRC-5，荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果；双酶切和单酶切均显示载体pEGFP—hTERTp构建成功。细胞转染结果显示：在转染了pEGFP-hTERTp质粒的肺癌细胞中EGFP都有不同程度的表达，而在MRC-5中无EGFP表达；转染pEGFP-N1的肺癌细胞和正常细胞中均可清晰地观察到EGFP强荧光表达。结论：hTERT启动子能调控EGFP在肺癌细胞中靶向性转录表达。CMV启动子调控的EGFP在肺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。     

pcDNA3.1(+)gpc-5真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建pcDNA3.1（＋）磷脂酞肌醇蛋白5（gpc-5）基因真核表达载体。方法：根据gpc-5基因序列设计一对引物,利用RT-PCR法扩增出gpc-5基因的编码区（CDS）,连接在PGM-T载体上,并进行pcDNA3.1（＋）gpc-5真核表达载体的构建、酶切鉴定以及测序。结果：gpc-5基因的体外扩增目的片段为2 083 bp。所构建的重组体pcDNA3.1（＋）gpc-5经双酶切鉴定,与预期片段大小一致,测序结果与NCB I收录gpc-5基因的CDS序列一致。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）gpc-5,为研究gpc-5基因在原发性肺癌的发生发展中的作用奠定了基础。     

单纯疱疹病毒I型DNA疫苗的构建(英文)

目的　构建表达单纯疱疹病毒 1型糖蛋白D的DNA疫苗。方法　采用聚合酶链式反应 (PCR) ,从HSV 1基因组中扩增出 gD基因 ,插入中间载体pGEM T ,然后克隆入真核表达载体pcDNA3 .1 ,构建重组质粒 pLy D .经部分测序和限制性内切酶分析证实。将pLy D转染Cos 7细胞 ,并肌肉接种ICR小鼠。用免疫组化和ELISA方法分别检测gD蛋白表达及小鼠血清中的特异性抗体。结果　转染的Cos 7细胞中有 gD蛋白的表达 ;经三次肌肉免疫接种的小鼠血清中有特异性HSV 1抗体产生。结论　本研究构建的重组质粒 pLy D能够在哺乳动物细胞中表达目的蛋白 ,免疫接种后可以诱导动物产生免疫反应