miR-125a-5p基因敲除C57BL/6J小鼠的构建

目的：构建miR-125a-5p基因敲除小鼠并进行基因鉴定,并探讨基因敲除小鼠体内miR-125a-5p对靶基因Foxp3的调控。方法：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以C57BL/6J小鼠为背景,对miR-125a-5p基因位点进行基因敲除,培育纯合miR-125a-5p基因敲除小鼠。采用裂解法提取鼠尾组织基因组DNA,进行PCR反应检测亲代纯合miR-125a-5p基因敲除小鼠基因型,并选用雌、雄均为纯合子的基因敲除鼠作为亲代种鼠进行配种繁殖。通过全自动蛋白表达分析系统检测小鼠脾脏组织Foxp3的蛋白表达。结果：成功构建miR-125a-5p基因敲除小鼠,琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物为240 bp或0 bp单条带的为纯合型基因敲除（KO）小鼠,鉴定获得668 bp或428 bp单条带的为野生型（WT）小鼠,与预期的目的基因片段分子量大小一致,成功鉴定了miR-125a-5p基因敲除小鼠的基因型。选用雌、雄均为纯合子的基因敲除鼠进行配种繁育,获得了一批miR-125a-5p敲除纯合子基因型小鼠。与WT小鼠相比,miR-125a-5p基因敲除小鼠的脾脏组织中Foxp3表达降低（...     

利用基因打靶技术构建血管内皮特异性Stk24/25双基因敲除小鼠

目的:构建Stk24/Stk25双基因敲除小鼠模型,并对其基因型及敲除效率进行测定。方法:使用基因打靶技术构建基因敲除小鼠,利用PCR及凝胶电泳技术对亲代及子代小鼠进行基因型鉴定;并利用ＲT-qPCＲ测定目的基因在小脑血管内皮细胞中mＲNA转录水平的表达情况。结果:通过PCR技术成功检测出小鼠子代基因型Cdh5cre+/Stk24fl/fl/Stk25fl/fl纯合子小鼠,经鉴定血管内皮基因敲除Stk24、Stk25后表达量分别下降了27%（t=2.874,P=0.0207）和30%（t=17.21,P<0.001）。结论:采用基因打靶技术成功构建了Stk24/Stk25双基因敲除小鼠。     

血液系统条件性DNMT 3B 基因敲除小鼠的构建及鉴定

目的 构建可在血液系统中条件性敲除DNMT 3B 基因小鼠并进行鉴定,为研究DNMT 3B 基因的生物学功能及其在血液肿瘤疾病的作用机制提供动物模型。方法 将引进的DNMT3Bflox/flox 小鼠与Mx1-Cre+ 小鼠进行杂交繁殖,得到基因型DNMT3Bflox/+Mx1-Cre+ 及DNMT3Bflox/+Mx1-Cre- 两种子代,再用这两种子代杂交产生子代小鼠,通过PCR 法鉴定子代小鼠的基因型;获得基因型为DNMT3Bflox/flox Mx1-Cre+ 的小鼠,通过腹腔注射pI-pC 共5 次诱导DNMT3B 敲除,然后用半定量PCR 方法鉴定DNMT 3B 基因敲除情况。结果 基因型鉴定确认在13 只子鼠中有2 只为DNMT3Bflox/flox Mx1-Cre+,经pI-pC 腹腔注射后,DNMT 3B 基因通过Cre/loxP 系统被成功敲除。结论 该方法成功构建可以在血液系统条件性敲除DNMT 3B 基因的小鼠,并进行敲除后鉴定。     

乳腺上皮细胞特异性敲除Scrib基因杂合子小鼠的制作与鉴定

目的：利用Cre-LoxP重组酶系统构建乳腺上皮细胞特异性敲除Scrib基因杂合子小鼠,并进行鉴定,为进一步在动物整体水平研究Scrib基因在乳腺癌中的作用提供研究平台。方法：将Scrib条件敲除杂合子小鼠（Scrib /fl小鼠）进行繁殖并鉴定,然后将鉴定结果为阳性的子代Scrib /fl小鼠与乳腺上皮细胞特异性表达Cre重组酶的MMTV-Cre纯合子小鼠进行杂交,鉴定其子代小鼠的基因型。结果：成功繁育Scrib条件敲除小鼠和MMTV-Cre小鼠,并通过鉴定得到Scrib /fl小鼠,与MMTV-Cre小鼠杂交并繁殖,获得基因型为Scrib /fl;MMTV-Cre /-小鼠5只。结论：本研究利用Cre-LoxP重组酶系统成功构建了乳腺上皮细胞特异性敲除Scrib基因杂合子小鼠,为进一步研究极性蛋白Scrib表达下调在乳腺癌发生中的作用提供了良好的动物模型。     

IL-31 RA基因敲除小鼠纯合子模型的建立

目的：建立IL-31RA基因敲除小鼠纯合子模型,为IL-31RA基因相关研究提供动物模型。方法：IL-31RA基因敲除小鼠严格按照SPF级要求的动物饲养标准进行饲养繁殖,采用聚合酶链式反应（ PCR）法鉴定子代小鼠的基因型,RT-PCR法鉴定小鼠IL-31RA mRNA的表达,Western blot鉴定IL-31RA蛋白的表达,HE染色观察小鼠重要脏器的形态学变化。结果：PCR法成功检测出子代小鼠的3种基因型,纯合子基因敲除小鼠未检测出IL-31RA mRNA和IL-31RA蛋白的表达,IL-31RA基因敲除小鼠的重要脏器的形态学特征与野生型小鼠比较无明显变化;基因敲除小鼠可成功饲养繁殖,亦可获得较多的基因敲除纯合子小鼠。结论：成功构建了IL-31RA基因敲除小鼠纯合子模型。     

LSS基因敲除小鼠的饲养、繁殖及基因型鉴定

探讨羊毛固醇合成酶(LSS)基因敲除鼠的繁育和基因型分析.将引进杂合子小鼠进行饲养并繁育,提取其基因组DNA,利用PCR反应扩增目的 基因片段,鉴定出小鼠的基因型;Westem blot分析并比较LSS基因敲除杂合子小鼠和野生型小鼠的肝脏、皮肤组织中LSS蛋白的表达情况.成功的繁育出LSS基因敲除小鼠,使用PCR鉴定其子代小鼠包括野生型(LSS+/+,Wt)、杂合子(LSS+/-),未出现纯合敲除小鼠;Western blot结果表明:相较于野生型小鼠,LSS基因敲除杂合子小鼠在肝组织和皮肤组织中表达LSS蛋白量少;杂合子敲除鼠的生存能力比野生型小鼠弱.获得LSS基因敲除小鼠,PCR鉴定小鼠基因型具有简单、稳定的优点.     

S100A16基因敲除小鼠模型的构建与鉴定

目的：S100A16在肥胖以及多种恶性肿瘤发生发展中发挥了重要作用,本研究拟构建S100A16基因敲除小鼠模型。方法：利用基因表达调控系统(即Cre/lox P系统)构建全身敲除小鼠。采用聚合酶链式反应(PCR)鉴定小鼠的基因型,采用实时定量PCR(QRT-PCR)、Western blot方法验证其转录及翻译水平的表达。结果：成功建立了S100A16全身敲除小鼠模型,基因敲除杂合子小鼠成功饲养繁殖,目前为止未出现纯合子小鼠。S100A16敲除小鼠主要代谢器官,如脂肪、肌肉、肝脏中S100A16蛋白表达量显著下降。结论：S100A16 基因敲除小鼠模型的构建为研究肥胖及胰岛素抵抗中的作用及机制提供了动物模型。     

βB2晶体蛋白基因敲除小鼠模型的建立

目的:建立βB2晶体蛋白基因敲除小鼠模型.方法:采用美国iGTL实验室的技术构建打靶载体,建立基因敲除小鼠模型.采用PCR对小鼠基因型进行鉴定,Western印迹法对晶体蛋白的表达进行鉴定.结果:PCR成功检测出3种基因型;纯合子基因敲除的小鼠未检测到βB2晶体蛋白的表达.结论:成功构建了βB2晶体蛋白基因敲除的小鼠模型.     

Marcksl1基因敲除小鼠的建立及造血表型初步分析

目的建立Marcksl1基因敲除小鼠,初步探究该基因缺失对造血系统发育的影响。方法利用CRISPR/Cas9技术构建Marcksl1基因敲除小鼠,通过PCR技术以及Sanger测序方法鉴定小鼠基因型。通过将敲除小鼠与野生型小鼠杂交,分析敲除小鼠的传代情况。通过杂合子小鼠相互杂交,分析发育不同阶段纯合子、杂合子和野生型小鼠的占比。分离小鼠胎肝,利用血常规以及流式细胞术分析该基因缺失对造血系统的影响。结果PCR结合Sanger测序结果表明Marcksl1基因敲除小鼠构建成功。对不同阶段胚胎小鼠基因型鉴定和数量统计,发现小鼠Marcksl1基因敲除造成的胚胎死亡发生于胚胎发育后期。通过血常规与流式细胞分析,结果表明Marcksl1基因缺失在E15.5 d时不影响白细胞,红细胞以及血小板数量,但胎肝中造血干细胞比例显著增多。结论本研究成功建立Marcksl1基因敲除小鼠,并发现该基因缺失影响造血干细胞占比。本研究为进一步了解该基因在胚胎发育和造血系统中的功能提供动物模型。     

Myostatin基因敲除对哺乳期幼鼠骨骼肌生长的影响

目的 构建稳定的肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因敲除小鼠模型,观察敲除MSTN基因对哺乳期幼鼠骨骼肌生长的影响,并初步探讨其相关机制.方法 采用Cre-LoxP系统建立MSTN基因敲除的小鼠模型,通过PCR法鉴定子代小鼠基因型;比较MSTN基因敲除后小鼠体质量及腿部骨骼肌质量的变化;免疫荧光法检测野生型小鼠与MSTN基因敲除小鼠腿部骨骼肌纤维横截面积;qPCR法检测MST基因敲除小鼠Atrogin-1和MuRF-1 mRNA的表达.结果 PCR结果显示:子代小鼠的基因型符合MSTN-loxP+/+MCK-Cre+/-;与野生型小鼠(WT)相比,MSTN敲除小鼠(KO)体质量及骨骼肌质量显著增加,在出生第7、21天差异均具有统计学意义(P＜0.05),腿部骨骼肌纤维显著增粗,差异具有统计学意义(P＜0.01);而MSTN基因敲除后小鼠Atrogin-1和MuRF-1的mRNA表达较野生型小鼠显著降低,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 利用Cre-loxP系统成功建立稳定的MSTN基因敲除的小鼠模型,该小鼠腿部骨骼肌纤维增粗,其质量以及小鼠体质量显著增加,其机制可能与泛素连接酶Atrogin-1和MuRF-1的表达下调有关.     

利用TALEN技术高效制备TXNIP基因敲除小鼠模型

目的 利用显微注射技术注射敲除Txnip基因的TALEN mRNA获得TXNIP敲除小鼠。方法 在线设计Txnip敲除位点, 构建TALEN载体并在细胞水平验证剪切活性, 体外转录TALENs成mRNA并通过显微注射技术注射到C57BL/6J小鼠受精卵, 对F0代小鼠进行DNA水平鉴定获得TXNIP敲除小鼠。结果 在Txnip第一外显子上设计了TALEN识别剪切位点, 并在细胞水平验证具有剪切活性, 注射mRNA到受精卵获得了4只敲除小鼠, 其中2只Txnip发生移码突变, 成功制备了TXNIP敲除小鼠。结论 通过注射TALENs mRNA可以高效制备TXNIP敲除小鼠。     

应用TALEN技术敲除gata4基因建立斑马鱼先天性心脏病模型

目的人工构建TALEN靶向敲除载体敲除gata4基因,建立斑马鱼先天性心脏病动物模型。方法采用单元组装法构建靶向敲除gata4基因的载体,将其体外转录成TALEN mRNAs,通过显微注射的方式注入单细胞期受精卵中,胚胎检测TALEN的敲除效率,再通过剪尾、酶切、测序筛选发生基因突变的斑马鱼及突变的类型。结果酶切、测序结果证实成功构建出正确的gata4靶向敲除载体,注入斑马鱼受精卵中,发生基因敲除的效率为35.18%,通过剪尾、PCR、酶切检测成功地筛选出了发生基因突变的斑马鱼,测序结果显示出不同种类的gata4基因突变。结论成功构建gata4基因敲除的斑马鱼动物模型,为进一步研究人类gata4基因突变引起先天性心脏病的发病机制提供了良好的动物模型。     

多巴胺D1、D3受体敲除及双基因敲除对小鼠体重的影响

目的：研究多巴胺受体介导的神经及生理活动。方法引进多巴胺D1和D3受体敲除小鼠,繁育出多巴胺D1D3受体双敲除小鼠。选择D1受体敲除、D3受体敲除、D1D3双基因敲除与WT四种基因型雄鼠各7只,对其30d、50d、70d小鼠24h内的进食量、饮水量及体重进行测量,探讨多巴胺D1受体、D3受体敲除小鼠及D1D3受体双基因敲除小鼠与野生型进食、饮水、体重增长的比较。结果多巴胺D1、D3受体基因对小鼠21d和35d的体重增长有一个较为显著的影响,直到90d时,各基因型小鼠体重间无统计学差异。结论多巴胺可能通过调节HPA轴的活性,从而调控仔鼠的觅食与饱腹感,最终影响仔鼠初生重及泌乳期体重。同时,多巴胺D1、D3受体基因的敲除可能通过干扰泌乳等母性行为而影响小鼠的体重。研究结果为利用基因敲除小鼠研究多巴胺D1、D3受体的功能及它们之间的相互作用奠定坚实的基础。     

精子特异性Sleeping Beauty转座酶转基因小鼠模型的建立

目的建立精子特异性表达Sleeping Beauty(SB)转座酶转基因小鼠模型,为研究SB转座子在小鼠中的应用提供工具。方法克隆精子特异性启动子用以驱动SB转座酶基因的表达,建立精子特异性表达SB转座酶的载体,利用显微注射方法建立以C57BL/6J为背景的精子特异性表达SB转座酶的转基因小鼠。PCR鉴定首建鼠的基因型,western blot(WB)和免疫组织化学(IHC)检测SB转座酶基因在小鼠生殖腺睾丸中的表达情况,筛选睾丸中高表达SB转座酶的转基因小鼠。结果显微注射方式获得了5只首建小鼠,其中3只能稳定传代,利用WB和IHC成功的筛选出一株在精子中高表达SB转座酶的转基因小鼠。结论成功建立了精子特异性高表达SB转座酶转基因小鼠模型,为将SB转座子作为一种基因工程工具应用于小鼠基因修饰模型的建立提供非常重要的工具资源。     

利用CRISPR/Cas9敲除大鼠胰岛素受体底物1（Irs1）基因

目的为研究胰岛素受体底物1(Irs1)基因与代谢病之间的关系,我们利用CRISPR/Cas9系统敲除大鼠Irs1基因,为研究代谢病提供基因敲除大鼠。方法针对Irs1第一外显子,设计CRISPR/Cas9作用靶点,构建sgRNA表达质粒。利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9。将Cas9 mRNA和sgRNA混合物注射入SD大鼠的受精卵中,实现靶基因敲除。用T7EN1实验初步检测靶基因的修饰情况,再经过测序分析确定突变。结果获得了5个在Irs1基因突变的首建鼠,突变效率为83%。结论得到了稳定遗传的Irs1基因敲除大鼠。     

Fkbp51基因敲除小鼠肝脏与大脑海马区RNA表达谱系的分析比较

目的通过分析野生型小鼠(WT)与Fkbp51基因敲除(KO)小鼠肝脏、海马RNA表达谱系之间的差异,研究Fkbp51基因在代谢通路和神经通路中的作用。方法利用第二代测序技术对Fkbp51KO与WT小鼠的肝脏与海马mRNA进行表达谱测序,将测序结果用BRB-Array Tools进行分析,筛选出小鼠肝脏与海马的差异基因,然后分别利用在线工具DAVID对差异基因进行GO本体分析,STRING数据库对其进行蛋白质的相互作用网络分析,并利用Genecard对基因进行注释。结果 (1)Fkbp51的缺失,在肝脏中造成类固醇生物合成及代谢、脂类物质代谢以及氧化还原反应等相关基因表达水平的变化;(2)在海马中造成机械刺激探测、学习或记忆、突触传递的调节、PPAR信号通路、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)等相关基因表达水平的变化;(3)在肝脏与海马中,Fkbp51的缺失同时造成了11个基因的共差异表达,这11个基因的蛋白网络互作图显示:HMGCS2与INSIG1及相关蛋白形成网络,而USP2与PER、CRY、DBP等相关蛋白形成另一个网络。这两个网络既参与代谢也参与神经调节。结论Fkbp51在代谢与神经中的作用既是相互独立又是相互联系的。     

Fkbp51基因敲除对小鼠肝脏转录组基因可变剪接的影响

目的通过分析Fkbp51基因敲除(knock out,KO)与野生型(wild type,WT)小鼠肝脏表达谱,研究Fkbp51基因敲除对肝脏组织基因可变剪接的影响。方法利用二代测序对Fkbp51 KO与WT小鼠肝脏进行表达谱测序,用Top Hat对RNA测序结果进行可变剪接分析,筛选出KO与WT小鼠肝组织中差异的内含子保留(intron retetion,RI)和外显子跳跃(exon skipping,SE)。通过在线工具DAVID对这些差异可变剪接体进行基因功能(gene ontology,GO)和代谢通路(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,同时用NCBI基因数据库对这些基因进行注释。结果 (1)Fkbp51缺失可导致小鼠肝脏mRNA可变剪接发生变化;(2)Fkbp51基因敲除造成小鼠肝脏mRNA可变剪接表达量的变化;(3)通过GO与KEGG分析,我们发现这些发生差异可变剪切的基因主要与脂肪相关衍生物的代谢、免疫、胆汁酸分泌等通路相关。(4)与差异内含子保留相关的基因主要与肌动蛋白细胞骨架调控,氨基酸及其衍生物代谢相关。结论 Fkbp51基因敲除能够改变基因组中mRNA的可变剪切,进而影响小鼠肝脏的代谢功能。     

系统性念珠菌感染小鼠模型的制备

目的 建立稳定的系统性念珠菌感染小鼠模型,规范其操作方法。方法 采用环磷酰胺对小鼠进行免疫抑制后,选择白色念珠菌（C.albicans）和非白念珠菌（C.parapsilosis）分别接种ICR小鼠,从免疫抑制、菌株制备、接种剂量和接种途径等方面对建模过程进行质量控制,通过生存分析、组织载菌量和病理学检查对模型进行评价。结果 我们建立的系统性念珠菌感染小鼠模型显示肾脏为靶器官,多器官弥散性真菌感染的典型病理组织学改变。结论 通过对建模过程各环节进行规范,可得到稳定的系统性念珠菌感染小鼠模型,该模型可应用于系统性念珠菌感染的致病机理,免疫防御及抗真菌药物筛选等研究领域。     

Rtn4-A/B基因敲除小鼠模型的制备

目的通过制备Rtn4-A/B基因敲除小鼠,探索Rtn4-B基因的生物学功能。方法用细菌人工染色体(BAC)载体构建Rtn4-A/B基因打靶载体并使其线性化,通过电转化法将其转入129SvEv品系雄性小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)。将正确同源重组的ES细胞注射入C57BL/6J小鼠囊胚腔,繁育出嵌合体小鼠后,进一步繁殖以获得杂合子小鼠。抽提小鼠尾尖组织DNA,采用PCR法鉴定小鼠的基因型。结果基因打靶后,得到14个发生双臂正确同源重组ES细胞克隆。利用阳性ES细胞克隆进行囊胚内显微注射,得到5只嵌合率大于50%的雄鼠,最终繁育得到4只Rtn4-A+/-B+/-杂合子小鼠。结论利用ES细胞基因打靶、同源重组等方法,成功获得Rtn4-A/B基因敲除杂合子小鼠。     

Fkbp51基因敲除小鼠心脏与肝脏RNA表达谱系的分析比较

目的通过分析野生型小鼠(WT)和Fkbp51基因敲除(KO)小鼠心脏与肝RNA表达谱系之间的差异,研究Fkbp51基因在心脏和肝组织代谢通路中的作用。方法利用第二代高通量基因测序技术,对Fkbp51 KO和WT小鼠的心脏和肝进行mRNA表达谱测序,将心脏测序的数据结果用DEGseq进行差异分析,肝脏组织测序结果用BRB-Array Tools进行分析,分别筛选出小鼠心脏和肝的差异基因,利用在线工具DAVID对差异基因进行GO本体分析和KEGG通路分析,利用Bioinfo GP数据库的Venn工具分析两种组织的共差异基因,利用STRING数据库对蛋白质的互作网络进行分析。结果 (1)Fkbp51的缺失导致心脏中血管平滑肌收缩、趋化因子信号、视黄醇信号和MAPK信号等相关通路的mRNA表达发生改变;(2)Fkbp51的缺失导致肝组织中胆固醇合成及代谢、脂类代谢以及氧化还原等相关基因和通路的变化;(3)在心脏和肝组织中,Fkbp51缺失造成了4个共差异基因,其中Rnaset2b、Hmga1和Fkbp51下调,而Cyp2b10在心脏组织中下调,在肝组织中上调。这些蛋白均可与HSP90蛋白相互作用,参与心脏和肝组织中的代谢。结论 Fkbp51在心脏和肝中参与不同的代谢及基因表达调控通路,其作用既是相互独立又是相互联系的。