THP1单核细胞分化过程中MMP9表达量的变化

目的 研究单核细胞在向巨噬细胞、泡沫细胞分化过程中基质金属蛋白酶-9(MMP 9)基因和蛋白表达的变化.方法 体外诱导人单核细胞系(THP 1)细胞株分化为巨噬细胞和泡沫细胞,采用荧光定量聚合酶链式反应和Western blotting分别检测单核细胞向巨噬细胞、泡沫细胞分化过程中MMP 9基因和蛋白表达的变化.结果 THP 1单核细胞向巨噬细胞、泡沫细胞分化过程中MMP 9 mRNA表达量分别增加了2.03倍和3.36倍(P<0.05,P<0.01);蛋白表达分别增加了5.86倍和3.68倍(P<0.01,P<0.05).巨噬细胞和泡沫细胞中的MMP 9 mRNA水平无明显差异(P>0.05),但泡沫细胞中蛋白表达量较巨噬细胞有显著减少(P<0.05).结论 经体外诱导分化成的巨噬细胞和泡沫细胞中MMP 9 mRNA、蛋白水平与单核细胞比较呈显著增加,但单核细胞分化为泡沫细胞后其蛋白表达量呈显著下降.     

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子在巨噬和泡沫细胞中的表达

目的观察细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)在单核向巨噬和泡沫细胞分化过程中的表达变化。方法体外诱导THP-1单核细胞分化为巨噬和泡沫细胞,应用Real-time RT-PCR和Western blot测定EMMPRIN基因和蛋白表达。结果单核细胞分化为巨噬细胞后EMMPRIN mRNA和蛋白表达均显著增加,当进一步分化为泡沫细胞时,EMMPRIN的表达与巨噬细胞比较无显著性差异。结论单核细胞向巨噬细胞的分化诱导EMMPRIN表达,而进一步向泡沫细胞分化对其表达无影响。     

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子在巨噬和泡沫细胞中的表达

目的观察细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)在单核向巨噬和泡沫细胞分化过程中的表达变化.方法体外诱导THP-1单核细胞分化为巨噬和泡沫细胞,应用Real-time RT-PCR和Western blot测定EMMPRIN基因和蛋白表达.结果单核细胞分化为巨噬细胞后EMMPRIN mRNA和蛋白表达均显著增加,当进一步分化为泡沫细胞时,EMMPRIN的表达与巨噬细胞比较无显著性差异.结论单核细胞向巨噬细胞的分化诱导EMMPRIN表达,而进一步向泡沫细胞分化对其表达无影响.     

ACAT-1在单核细胞向泡沫细胞分化过程中的表达变化

目的研究单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中脂酰CoA胆固醇酯酰转移酶-1(ACAT-1)表达及活性的变化。方法复苏、培养人单核细胞株THP-1细胞,与乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA)、PMA+氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共孵育1～4 d,RT-PCR方法检测单核细胞分化过程中ACAT-1 mRNA表达,Westernblotting检测ACAT-1蛋白表达的变化。结果(1)单核细胞复苏后加入PMA诱导48 h后,分化为巨噬细胞。经PMA+ox-LDL诱导24 h后分化为泡沫细胞。(2)与无血清培养单核细胞对照组比较,在PMA诱导单核细胞株THP-1向巨噬细胞分化过程中,ACAT-1 mRNA、蛋白表达及酶活性水平明显增高(P<0.05),呈时间依赖效应。(3)巨噬细胞向泡沫细胞分化过程中,ACAT-1 mRNA、蛋白表达及酶活性水平增高,呈时间依赖效应。但和无血清培养巨噬细胞比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论单核细胞株THP-1经PMA,PMA/ox-LDL诱导后,可分化为巨噬细胞、泡沫细胞。ACAT-1的表达及活性增高在单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中起着重要作用。     

IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1 mRNA表达的影响

目的:研究IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1 mRNA表达的影响.方法:(1)复苏并培养人单核细胞株THP-1细胞并诱导为巨噬细胞和泡沫细胞.(2)RT-PCR法检测A-CAT-1 mRNA在单核细胞、巨噬细胞、泡沫细胞以及泡沫细胞加IL-1和泡沫细胞加IL-1/IL-1单克隆抗体中的表达.结果:(1)单核细胞株THP-1细胞被诱导为巨噬细胞和泡沫细胞.(2)与单核细胞比,巨噬细胞、泡沫细胞以及泡沫细胞加IL-1的ACAT-1 mRNA表达均明显增高,尤以泡沫细胞加IL-1中增高明显;与泡沫细胞加IL-1比,泡沫细胞加IL-1/IL-1单克隆抗体的ACAT-1 mRNA表达下降.结论:(1)IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1 mRNA的表达有上调作用,IL-1单克隆抗体可以拮抗这种效应.(2)IL-1可上调ACAT-1 mRNA表达水平,可能是巨噬细胞脂质过负荷后A-CAT-1上调的始动因子之一.     

糖基化终产物对THP-1巨噬细胞酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1表达的影响

目的 观察糖基化终产物(advanced glyeosylation end-products,AGEs)对THP-1巨噬细胞酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶.1(aeyl coenzyme A:cholesterol acyhransferase-1,ACAT-1)表达的影响.方法 将糖基化-牛血清白蛋白(AGE-modified bovine serum albumin,AGE-BSA)与佛波酯(PMA)诱导分化72h的THP-1巨噬细胞共同孵育,运用RT-PCR和Western blot分别检测巨噬细胞ACAT-1 mRNA和蛋白的表达水平.结果 PMA诱导72 h后,THP-1细胞停止增殖,由单核细胞分化成为巨噬细胞.用50、100、200和400 mg/L AGE-BSA处理巨噬细胞后,细胞ACAT-1 mRNA相对表达量逐渐增加;ACAT-1蛋白表达的平均积分光密度值也逐渐增加,二者较对照牛血清白蛋白组明显增加(P＜0.05).用200 mg/LAGE-BSA作用巨噬细胞0、12、24、36 h和48 h后,细胞ACAT-1 mRNA相对表达量逐渐升高;ACAT-1蛋白表达的平均积分光密度值也逐渐升高,较0 h明显增加(P＜0.05).结论 AGEs可上调THP-1巨噬细胞ACAT-1 mRNA和蛋白的表达,呈浓度和时间依赖性,这可能与糖尿病动脉粥样硬化有关.     

LTB4在THP-1源性巨噬细胞中通过MAPK途径上调EMMPRIN的表达

目的 探讨白三烯B4在MAPK信号通路中对细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)表达的影响.方法 将人类单核细胞系THP-1分为6组,用PMA诱导2～6组的THP-1成巨噬细胞,3～6组加入白三烯B4,第4组加入PD98059(ERK1/2抑制剂),第5组加入SB203580(P38抑制剂),第6组加入SP600125(JNK抑制剂),观察EMMPRIN和MMP-9的mR-NA以及EMMPRIN的蛋白变化.结果 LTB4使单核细胞EMMPRIN的mRNA表达增加(P＜0.05)、MMP-9的mRNA表达增加(P＜0.01),及EMMPRIN的蛋白表达明显增加(P＜0.01),加入PD98059后,EMMPRIN的mRNA表达明显下降(P＜0.01),MMP-9的mRNA表达明显下降(P＜0.01),EMMPRIN蛋白表达明显下降(P＜0.01),加入SB203580后,EMMPRIN的mRNA明显下降(P＜0.01),MMP-9的mRNA明显下降(P＜0.01),EMMPRIN蛋白表达明显下降(P＜0.01),加入SP600125后,EMMPRIN的mRNA明显下降(P＜0.05),MMP-9的mRNA明显下降(P＜0.01),EMMPRIN蛋白表达明显下降(P＜0.01).结论 白三烯B4通过激活MAPK信号通路增加THP-1源性巨噬细胞EMMPRIN的表达,可能是其增加巨噬细胞MMPs产生的机制.     

Visfatin诱导THP-1源性泡沫细胞形成的机制研究

目的观察内脂素(visfatin)对人单核细胞株(THP-1)源性巨噬细胞胆固醇代谢相关基因ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)和酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)表达的影响,探讨visfatin诱导THP-1源性泡沫细胞形成的机制。方法 THP-1单核细胞诱导分化为巨噬细胞,随机分组,给予不同浓度和不同作用时间的visfatin进行干预,分别运用油红O染色观察细胞质脂滴变化,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和蛋白免疫印迹(Western blot)法检测各组细胞ABCA1及ACAT1 mRNA和蛋白表达,酶荧光学法检测细胞内总胆固醇(TC)和游离胆固醇(FC)含量,TC与FC之差为胆固醇酯(CE)含量。结果与对照组比较,visfatin干预组细胞质脂滴明显增多,细胞内FC和CE含量增加(均P<0.05),CE与TC的比值明显增加(>50%),ABCA1 mRNA和蛋白表达水平降低(均P<0.05),ACAT1 mRNA和蛋白表达水平升高(均P<0.05)。相关分析显示,visfatin呈浓度和时间依赖性下调ABCA1 mRNA和蛋白的表达,上调ACAT1 mRNA和蛋白的表达。结论 visfatin下调巨噬细胞ABCA1的表达,上调ACAT1的表达,使细胞内FC流出减少,CE合成增加,从而诱导THP-1源性泡沫细胞的形成,这可能为visfatin致动脉粥样硬化发病机制的研究提供一个新的理论依据。     

血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1对THP-1单核巨噬细胞源泡沫细胞MMP-9表达的影响及辛伐他汀的干预作用

目的 探讨血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1（LOX-1）对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的THP-1单核/巨噬细胞源泡沫细胞(THP-1 monocyte derived macrophages)基质金属蛋白酶-9（MMP-9）基因表达的影响及辛伐他汀的干预作用。 方法 利用不同浓度的ox-LDL（10、20、50、100?mg/L）诱导THP-1单核/巨噬细胞源泡沫细胞，然后分别用LOX-1受体阻断剂多聚肌苷酸（ Poly I）及辛伐他汀（simvastatin）进行干预，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测LOX-1、MMP-9mRNA的表达水平。 结果 THP-1单核/巨噬细胞经ox-LDL诱导后LOX-1、MMP 9mRNA表达显著增加，与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05），并与ox-LDL在10～50?mg/L浓度范围内呈现剂量-效应关系（P<0．05）。100?mg/L　ox LDL与细胞共同培养时LOX-1、MMP-9mRNA表达下降可能与高浓度ox LDL对细胞的毒性作用有关。预先用Poly I封闭细胞表面部分LOX-1，再加入50mg/L　ox-LDL培养, 与未加阻断剂组比较， LOX-1、MMP 9mRNA表达均减少，差异具有统计学意义（P<0.05）。100μmol/L辛伐他汀加入50mg/L ox LDL共同进行细胞培养， LOX-1、MMP-9mRNA表达与未干预组比较显著下调，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 ox-LDL上调THP-1单核/巨噬细胞LOX-1、MMP-9mRNA表达。LOX-1作为ox-LDL的特异性受体，可介导ox-LDL致巨噬细胞源泡沫细胞MMP-9mRNA表达增加，使动脉粥样硬化斑块中细胞外基质的降解增强，斑块趋于不稳定。辛伐他汀可以通过下调细胞LOX-1 mRNA的表达减少MMP-9 mRNA的分泌，这或许是他汀类药物发挥非调脂抗炎作用稳定斑块的机制之一。     

糖基化终产物抑制THP-1巨噬细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达

目的:观察糖基化终产物(AGEs)对THP-1巨噬细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达的影响,探讨AGEs在糖尿病动脉粥样硬化中可能的作用.方法:用佛波酯(PMA)诱导THP-1单核细胞72h使其分化为巨噬细胞,并将糖基化-牛血清白蛋白(AGE-BSA)与巨噬细胞共同孵育,运用RT-PCR和免疫细胞化学法分别检测巨噬细胞PPARγ mRNA和蛋白的表达水平.结果:PMA诱导72h后,THP-1细胞停止增殖,由单核细胞分化成为巨噬细胞.50、100、200和400μg/mlAGE-BSA处理24h后,巨噬细胞PPARγ mRNA相对表达量分别是1.235±0.044、0.752±0.055、0.494±0.026、0.277±0.025;PPARγ蛋白的平均积分光密度值分别为36.460±0.625、24.561±0.636、19.326±0.803、12.715±0.752,二者较100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)组均明显降低(P<0.05).200μg/ml AGE-BSA作用12、24、36和48h后,巨噬细胞PPARγ mRNA相对表达量分别是1.564±0.060、1.260±0.043、0.467±0.033、0.360±0.012;PPARγ蛋白的平均积分光密度值分别为32.502±0.739、22.234±0.835、16.568±0.683、11.537±0.547,二者较0h组也明显降低(P<0.05 o结论:AGEs可下调THP-1巨噬细胞PPARγmRNA和蛋白的表达水平,且呈浓度和时间依赖性.     

PMA促进人单核细胞分化及ACAT1基因表达

目的研究人单核细胞系在佛波酯（PMA）作用下分化为巨噬细胞的过程中酰基CoA：胆固醇酰基转移酶1（ACAT1）活性的改变及其机制。方法体外培养人THP-1单核细胞系，PMA作用使其分化为巨噬细胞。以放射性同位素标记底物法检测ACAT1活性．用Western blot法和RT—PCR法分别检测ACAT1蛋白和mRNA。结果PMA使THP-1单核细胞的形态和生长状态巨噬细胞化．在此过程中ACAT1 mRNA和蛋白明显增加（P〈0．01），酶活性升高（P〈0．05）。结论PMA可促进单核细胞分化为巨噬细胞，上调ACAT1基因的表达，促进酶活性提高。     

不对称二甲基精氨酸上调THP-1来源的巨噬细胞和泡沫细胞内胆固醇酞基转移酶-1的表达

目的 观察不对称二甲基精氨酸(ADMA)对单核细胞THP-1来源的巨噬细胞和泡沫细胞中胆固醇酞基转移酶-1(ACAT-1)的表达及胆固醇含量的影响.方法 分别采用RT-PCR和Westem blot技术检测ACAT-1mRNA和蛋白表达水平.采用酶偶联比色法检测细胞内胆固醇含量.结果 不同浓度的ADMA (0,3.75,7.5,15,or30 μmol/L)对THP-1来源的巨噬细胞和泡沫细胞作用不同时间(6 12,24h)后,巨噬细胞和泡沫细胞内ACAT-1mRNA和蛋白的表达明显上调,细胞内总胆固醇的含量明显升高.结论 ADMA在巨噬细胞形成泡沫细胞过程中可能发挥了重要作用.抑制巨噬细胞和泡沫细胞内ACAT-1可能成为治疗动脉粥样硬化的潜在靶点.

Abstract：

Abstract:Objective To investigate the effects of asymmetric dimethylarginine(ADMA)on ACAT-I expression and cholesterol content in THP-1-derived macrophages and foam cells. Methods THP-1 cells were induced to differentiate into macrophages and further into foam ceIls.The macrophages and foam cells were exposed to different concentrations(0,3.75,7.5,15,and 30umol/K)of ADMA for varying time lengths(6,12,and 24 h),and the changes in ACAT-1 mRNA and protein levels in the cells were measured with RT-PCR and Western blotting.The cellular cholesterol content Was measured with enzyme-linked colorimetry assay.Results In THP-1-derived macrophages and foam cells,the expression levels of ACAT-1 mRNA and protein and cellular cholesterol content increased significantly in response to ADMA treatment in a time- and concentration-dependent manner. Conclusion ADMA may play all important role in inducing foam cell formation from macrophages. ACAT-1 inhibition targeting the macrophages and foam cells may serve as a potential therapeutic target IN the treatment of atherosclerosis.     

内脏脂肪素对巨噬细胞MMP-9的作用及其机制探讨

目的 研究内脏脂肪素（visfatin）对巨噬细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的作用及其机制。方法体外诱导THP-1单核细胞转化为巨噬细胞。为明确visfatin对MMP-9的作用,细胞分为两组：①巨噬细胞+visfatin 12 h组;②巨噬细胞+visfatin24 h组,两组的visfatin的质量浓度均为：0（对照组）、50、100、200、400 ng/mL。采用RT-PCR和Western blotting测定MMP-9基因和蛋白表达,明胶酶谱法检测MMP-9的活性。为明确visfatin对MMP-9的作用机制,细胞分为五组：①巨噬细胞未加刺激组（对照组）;②巨噬细胞+ MAPK p38、ERK1/2、JNK信号通路抑制剂预处理1 h后加visfatin（200 ng/mL）24 h组;③巨噬细胞+过氧化物酶体增殖剂活化受体（PPARγ）天然及人工配体/ RXR配体预处理1 h后加visfatin（200 ng/mL）24 h组;④巨噬细胞+visfatin（200 ng/mL）24 h组（Vis200组）;⑤巨噬细胞+visfatin（200 ng/mL）刺激不同时间组（5、10、15、30、60 min）。Western blotting检测MMP-9蛋白和PPARγ蛋白表达及visfatin刺激下巨噬细胞p38、ERK1/2、JNK MAPK磷酸化水平。结果 Visfatin能促进MMP-9基因及蛋白表达（P<0.05,P<0.01）,同时增强了MMP-9的活性（P<0.01）。p38 MAPK、ERK1/2 MAPK通路抑制剂及RXR配体抑制visfatin对MMP-9表达具有上调作用;visfatin能促进p38 MAPK和ERK1/2 MAPK的磷酸化,但不影响PPARγ蛋白的表达。结论 Visfatin增加了巨噬细胞炎症因子的表达,该作用与p38 MAPK和ERK1/2MAPK信号通路有关;RXR可能参与了该过程。     

穗花杉双黄酮激活PPAR-α/γ抑制THP-1源性巨噬细胞向M1型极化

目的 探讨穗花杉双黄酮调节体外诱导的M1型巨噬细胞极化的相关机制。方法 设实验组、溶媒对照组和无药对照组,实验组：不同浓度的（5、10 μmol/L）穗花杉双黄酮干预用联合脂多糖及重组人干扰素-γ诱导的M1型巨噬细胞;溶媒对照组：溶媒3‰DMSO;无药对照组：不加穗花杉双黄酮处理。显微镜下观察细胞形态学;通过ELISA检测干预后细胞上清液L-6、IL-10、TNF-α、TGF-β各自的表达水平;通过CCK-8法检测计算出穗花杉双黄酮对细胞的安全浓度;通过分子对接建模确定穗花杉双黄酮的靶蛋白,利用RT-qPCR、Western blot检测L-6、IL-10、TNF-α、TGF-β、PPAR-α/γ、Arg-1、Fizz1基因和蛋白表达。结果 穗花杉双黄酮干预后可以阻止被诱导引起的THP-1细胞向M1极化;穗花杉双黄酮可下调M1极化时高表达的IL-6、TNF-α的mRNA,上调M2型主要标志细胞因子IL-8和TGF-β的mRNA表达（P<0.05）,同时上调M1极化状态下的细胞内Arg1和Fizz1蛋白的表达（P<0.05）。随着穗花杉双黄酮浓度的增加和作用时间的延长,其抑制细胞的增殖效果增强（P<0.05）,且高浓度具有杀伤作用。穗花杉双黄酮可与PPAR-α/γ关键靶点蛋白活性位点非共价结合并激活该蛋白。结论 穗花杉双黄酮可通激活PPAR-α/γ,恢复Arg-1、Fizz1基因表达,抑制巨噬细胞向M1型分化。     

A771726对经PMA活化的THP-1细胞MMP-2及MMP-9表达的影响

目的 观察来氟米特活性代谢产物A771726对经PMA活化的THP-1细胞MMP-2及MMP-9表达的影响。方法 THP-1细胞悬浮生长于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中。细胞密度达5×105·ml-1时用于实验。THP-1细胞经PMA刺激24h（诱导THP-1细胞分化成巨噬细胞）后,细胞进行无血清化处理12h,继而加入不同剂量的A771726（5ug/mL、15 ug/mL 、45ug/mL）,干预24h。实时荧光定量PCR检测细胞MMP-2、MMP-9 mRNA的表达,明胶酶谱法检测细胞培养上清液中MMP-2、MMP-9的活性。结果 细胞经不同浓度的A771726（5ug/mL、15 ug/mL 、45ug/mL）处理后,MMP-2、MMP-9 mRNA表达量均有下降(P＜0.01) 。中、高剂量的A771726（15 ug/mL 、45ug/mL）可降低PMA活化的THP-1细胞培养上清液中MMP-2、MMP-9活性(P＜0.01)。结论 来氟米特活性代谢产物A771726可以降低经PMA活化的THP-1细胞MMP-2及MMP-9的表达。     

氧化低密度脂蛋白对巨噬细胞Toll样受体-4的表达效应

目的研究低密度脂蛋白(LDL)氧化对人单核细胞源巨噬细胞Toll样受体-4(TLR-4)表达的影响及其机制。方法用RPM I 1640培养基体外培养人THP-1单核细胞系,加入佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)培养48 h使其分化为巨噬细胞,加入氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)或LDL,用免疫细胞化学、蛋白质免疫印迹和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,观察脂蛋白氧化前、后对巨噬细胞表达TLR-4蛋白及TLR-4 mRNA的影响。结果Ox-LDL可提高TLR-4蛋白及TLR-4 mRNA的表达(P<0.01);而LDL对TLR-4蛋白及其mRNA的表达无影响(P<0.05)。结论LDL的氧化可能促进THP-1源巨噬细胞TLR-4转录水平的上调,导致蛋白质的合成增加;Ox-LDL可能是动脉粥样硬化中炎症的始发原因之一。     

IL-12在牙龈卟啉单胞菌脂多糖促泡沫细胞形成过程中的作用

目的观察白细胞介素-12（IL-12）预刺激在牙龈卟啉单胞菌脂多糖（P．gingivalis LPS）促泡沫细胞形成过程中对细胞因子的影响。方法用氧化低密度脂蛋白（oxLDL）将人THP-1单核细胞来源的巨噬细胞诱导48h形成泡沫细胞。在巨噬细胞和泡沫细胞培养液中分别加入IL-12作用2h后,巨噬细胞培养液中加入oxLDL和P．gingivalisLPS,泡沫细胞培养液中加入P．gingivalis LPS。使用ELISA法检测培养液上清中IL-1β和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平,实时定量PCR检测细胞内IL-1β、IL-10、IL-12和IL-18mRNA的转录水平。结果在泡沫细胞形成过程中,IL-12预刺激可以降低培养液上清内TNF-α水平。降低细胞内IL-10和IL-12mRNA转录水平;泡沫细胞受P．gingivalisLPS刺激过程中,IL-12预刺激可以增加培养液上清IL—1β水平。减少细胞内IL-18mRNA的转录水平,增加IL-10mRNA的转录水平。结论IL-12预刺激影响P．gingivalisLPS促泡沫细胞形成过程中炎症细胞因子的转录和分泌。