改良盐析法提取全血基因组DNA的影响因素研究

目的 观察红细胞裂解时间、DNA纯化方式以及DNA干燥时间对改良盐析法提取全血基因组DNA的影响.方法 改良盐析法提取全血基因组DNA时,分别采用不同的红细胞裂解时间、DNA纯化方式以及DNA干燥时间.使用流式细胞术检测红细胞裂解后的细胞总数及死细胞比例,紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物.结果 红细胞裂解时间从10 min延长至120 min,死细胞比例随时间延长而增加,但细胞总数、DNA产量与纯度无明显变化;采用异丙醇沉淀法纯化DNA得到的DNA产量与纯度均显著高于使用DNA分离柱纯化的DNA; DNA干燥时间从120 min缩短至30 min,既不影响DNA的产量与纯度,也不影响后续PCR扩增实验.结论 改良盐析法提取全血基因组DNA时,红细胞裂解时间可延长至120 min,DNA干燥时间可缩短至30 min,异丙醇沉淀法优于DNA分离柱纯化的DNA.     

白假丝酵母菌DNA提取方法的研究

目的建立一种提取白假丝酵母菌DNA的有效方法。方法采用蜗牛酶消化破壁形成原生质体,饱和酚/氯仿抽提法提取基因组DNA,用琼脂糖凝胶电泳及PCR反应等进行鉴定。结果提取物经琼脂糖凝胶电泳检测到DNA主带,基本无DNA碎带,提取的DNA浓度为(1.18±0.36)μg/μl,纯度好(OD260/OD280>1.7),不用RNase酶处理,无需任何纯化即可用于PCR扩增。结论本研究中提取DNA的方法简便易行,提取物可适用于各种分子生物学研究。     

三种提取人腰椎间盘纤维环总RNA效率方法比较

目的：通过比较利用不同方法抽提人腰椎间盘纤维环RNA的效果来评定抽提人腰椎间盘纤维环总RNA的有效的方法和步骤。方法：对60例腰椎间盘突出症患者在腰椎间盘摘除手术时切取摘除的椎间盘组织,60份标本分别用异硫氰酸胍法、Trizol法和膜结合柱分离法提取组织中的RNA,用紫外可见分光仪测定所得RNA的浓度和OD260/OD280的比值并分别记录,另外记录提取RNA所用的时间和OD比值大于1.60的阳性率以及平均每份标本所需的费用。结果：利用异硫氰酸胍法,平均耗时160 min,RNA平均浓度为95.44μg/μl,平均OD比值为1.62,阳性率58.3%;利用Trizol法提取总RNA,平均耗时105 min,RNA平均浓度为531.40μg/μl,平均OD比值1.40,阳性率18.5%;利用膜结合柱分离法提取标本总RNA,平均耗时41 min,RNA平均浓度为690.34μg/μl,平均OD比值为1.83,阳性率100%。结论：膜结合柱分离法是提取人腰椎间盘高质量总RNA的有效方法。     

四种微量全血DNA提取方法的比较

目的比较加热去蛋白法、碘化钠法、TT溶血法、氯化胺法四种方法提取人微量全血基因组DNA的纯度及总量的差异.方法收集静脉全血0.5ml,共356人份,分别采用上述四种方法提取基因组DNA,用紫外分光光度仪及琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和总量,计算采用x±s,结果经统计学t检验处理.结果四种方法提取的基因组DNA纯度用OD260/OD280表示分别为:加热法1.569±0.158;碘化钠法1.517±0.093;TT溶血法1.789±0.161:氯化胺法1.815±0.051.四种方法提取的基因组DNA总量分别为:加热法(9.34±3.59)μg;碘化钠法(7.82±4.23)μg;TT溶血法(20.98±3.56)μg;氯化胺法(22.07±4.53)μg;加热法与碘化钠法比较,TT溶血法与氯化胺法比较,P＞0.05,无显著性差异;TT溶血法、氯化胺法分别与加热法、碘化钠法比较,P＜0.05,有显著性差异.结论从提取的基因组DNA纯度和总量来比较,氯化胺法与TT溶血法是四种提取人微量全血基因组DNA方法中较好的两种.     

笃斯越桔果实总DNA提取方法的比较研究

目的探讨越桔果汁总DNA的最佳提取方法。方法分别采用SDS法、高盐低pH值法、CTAB法、异硫氰酸胍法提取越桔果汁的基因组DNA,并对其进行核酸含量测定和电泳及RAPD-PCR检测。结果SDS法、高盐低pH值法、CTAB法、异硫氰酸胍法提取越桔果汁的基因组DNA其OD260/OD280分别为1.944、1.738、1.661、1.813,其浓度分别为2.363μg/μl、0.548μg/μl、0.735μg/μl、1.455μg/μl;电泳检测显示异硫氰酸胍法提取DNA条带最清晰,扩增产物最多。结论用异硫氰酸胍法提取越桔果汁总DNA优于其它方法。     

金银花药材脱氧核糖核酸(DNA)提取方法的研究

目的:研究金银花药材总脱氧核糖核酸(DNA)的提取方法。方法:对经典的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法进行了改良,采用改良的CTAB法提取金银花药材的总DNA,通过紫外吸收、琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度。结果:用改良的CTAB法提取的总DNA的OD260/OD280比值在1.76-1.85之间,干药材提取率为89.8-325.4μg/g。结论:用改良CTAB法提取的基因组DNA纯度高,符合分子生物学的要求。     

全血基因组DNA的快速纯化

目的 探讨全血基因组DNA的快速纯化方法。方法 微量全血通过红细胞裂解后,得到白细胞,再通过白细胞裂解,高盐离子去除蛋白,异丙醇沉淀即可得到高纯完整的全血基因组DNA。结果 该方法简单快速,得到的产品产率高(6.94μg/300μl全血),纯高度(A_(260)/A_(280)=1.82,A_(260)/A_(230)=2.08),完整性好(单一条带)。结论 该方法快速、高效,不仅缩短了实验时间,而且还提高了产品质量,可完全满足实验室快速分析的要求。     

人类精液 DNA 提取方法的探讨及影响因素分析▲

目的建立一种最优化的提取高质量人类精液基因组DNA的方法,为辅助生殖技术男性不育分子生物学科学研究提供技术支持.方法提取人类精液基因组DNA,优化设计实验步骤,研究初始样品类型、初始样品量、二硫苏糖醇(DTT)剂量、蛋白酶K(PK)消化时间、混匀震荡等因素对DNA的提取效果的影响,应用核酸定量和琼脂糖凝胶电泳分析比较各组提取效果的差异.结果应用自然分层后的精液沉淀提取DNA较原始精清可获得较高浓度的DNA.初始样品量为100~150μl时可获得较好的提取效果,随着样本量的增加,DNA提取效果逐渐下降.在样本中加入DTT可以明显提高DNA产量,DTT的加入利于DNA裂解及提取,且增加了DNA的稳定性. PK适宜消化时间为5~8 h;时间过短(<2 h),DNA裂解不全提取效果较差,时间过长(>12 h)则会造成DNA降解.在PK消化时,摇床震荡可以提高DNA产量.结论应用自然分层后的精液沉淀提取DNA,当初始样品量为100~150μl时,在样本中加入1M DTT 20μl,PK消化时间为5~8 h,并在消化时摇床震荡,可以获得高质量的基因组DNA.     

一种快速高效提取全血基因组DNA的实验方法

目的 建立一种快速的从少量全血中高效提取基因组DNA的实验方法 .方法 首先低渗处理红细胞,收集白细胞,然后裂解白细胞释放核蛋白,在去污剂及乙酸钾的作用下使核酸与蛋白分离,最后沉淀、纯化DNA.扩增管家基因(β-globin)观察提取效果.结果 该法收集的DNA纯度(OD360/OD280)为(1.82±0.4);每毫升外用血可得DNA19.0～37.0μg,片段大小10～13kb;β-giobin基因扩增电泳带清晰.结论 该法提取DNA简便、高效和经济,易于各级分子生物学实验室使用.     

人非抗凝血块中基因组DNA提取不同方法的比较

目的:比较三种不同方法提取人非抗凝血块基因组DNA的效果差异。方法:分别采用酚/氯仿法,天根试剂盒,Invitrigen purelinkTM试剂盒提取冻存时间较长的非抗凝血块基因组DNA,测定浓度、OD260/280值,琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA浓度和纯度,测定PCR产物灰度值。结果:三种方法都可以提取出基因组DNA,测定DNA浓度分别为:(35.56±15.27)ng/μL,(45.13±16.54)ng/μL,(57.93±14.5)ng/μL,组间存在统计学差异(P<0.01),A260/A280值分别为:1.46±0.19,1.49±0.16,1.519±0.23,三组间比较差异无统计学意义(P>0.05);三种方法提取的基因组DNA都能通过PCR扩增出目的条带,PCR产物电泳灰度值结果分别为:75.421±3.435,149.32±6.875和229.52±19.55,组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:三种不同方法都能提取出冻存时间较长的非抗凝血块基因组DNA,但Invitrigen purelinkTM试剂盒法效果最好。     

比较全血DNA提取法适用单核苷酸多态性分析

目的 比较两种提取冰冻全血基因组DNA的方法，即分离白细胞法和裂解红细胞法所获得基因组DNA的质量。方法 分别测定所获DNA的效率和纯度，同时，笔者用PCR／SNP敏感性分子开关技术。对两种方法获得的模板DNA进行单核苷酸多态性（single—nucleotide polymorphism，SNP）分析。结果 结果显示分离白细胞法DNA产量与纯度均高，裂解红细胞法获得的DNA产量、纯度相对较低；PCR／SNP敏感性分子开关检测表明：分离白细胞法和裂解红细胞法制备的DNA模板，均可在体外进行有效的PCR扩增。但分离白细胞法获得的目的DNA带特异性凸显，而裂解红细胞法获得的目的带特异性相对较差。结论 预先分离纯化白细胞是从冰冻全血中获得较高纯度DNA和有效提高DNA产量的重要操作步骤。     

A simple method for purification of genomic DNA from whole blood using Fe3O4/Au composite particles as a carrier

Objective： To establish a method of genomic DNA extraction from whole blood using Fe3O4/Au composite particles as a carrier. Methods： Two crucial conditions （sodium chloride concentration and amount of the magnetic particles） were optimized and 8 different human whole blood samples were used to purify genomic DNA under the optimal condition. Then agarose gel electrophoresis and polymerase cbain reaction （PCR） were performed. Results： The optimal binding condition was 1.5 mol/L NaC1/10% PEG, and the optimal amount of Fe3O4/Au composite particles was 600μg. The yields of the genomic DNA from 100μl of different whole blood samples were 2-5 μg, and the ratio of A260/A280 was in the range of 1.70-1.90. The size of genomic DNA was about 23 kb and the PCR was valid. Conclusion： The purification system using Fe3O4/Au composite microparticles has advantages in high yield, high purity, ease of operating, time saving and avoiding centrifugation. The purified sample was found to function satisfactorily in PCR amplification.     

三种分离人外周血单核细胞方法的比较

目的:用3种方法从人外周血分离单核细胞,比较细胞纯度、得率、实验成本及所需时间,选择最适宜的分离方法。方法:用密度梯度离心法获得外周血的单个核细胞,分别用贴壁法、免疫磁珠法和流式细胞术法进一步分离单核细胞。经CD14抗体标记,用流式细胞术检测细胞纯度,计算细胞得率、实验成本及所需时间。结果:用贴壁法、免疫磁珠法和流式细胞术法分离单核细胞,细胞纯度分别为18.8%、80%和73.4%;细胞得率为5%、11%和7.5%;每获得2×10⁷个单核细胞,实验成本约500元、1 500元和2 100元,实验耗时约6 h、6 h和10 h。结论:免疫磁珠法是最适宜的分离人外周血单核细胞的方法,具有细胞纯度与得率较高,实验成本较低,耗时较短的优点。     

全血标本保存条件对人总RNA提取效率的影响

目的探讨全血标本保存条件对RNA提取效率和RNA完整性的影响。方法从179例保存在不同温度、不同时间的全血标本中提取总RNA,测定其浓度和纯度、分析其完整性。另选20例标本研究冻融次数对RNA提取效率的影响。179例中的73例总RNA在-80℃下保存1周前、后分别测定浓度和纯度,观察两者差异。结果新鲜血来源的总RNA浓度最高,平均306.51ng/μl;冻融2次全血仍可获得足量的RNA,浓度181.98ng/μl,RNA完整性有所下降;-80℃保存1周的RNA,浓度和纯度都略有下降。结论利用Trizol法可从小体积全血标本中获取足量有效的总RNA;不同保存条件全血中所获取的总RNA浓度存在差异;总RNA-80℃短期保存也会略有降解。     

用样本工作站批量提取全血中DNA方法的建立

目的 建立一种用斯达尔样本工作站提取全血中DNA的方法,并评价DNA的纯度和产量.方法 使用斯达尔样本工作站提取全血DNA;DNA的纯度和含量用紫外分光光度法测定,并与手工提取方法进行比较.结果 斯达尔样本工作站与手工提取的DNA相比,在纯度与得率方面无差异,但更快速、简单.结论 本方法可以快速、高效地从大批量全血中提取较高质量的DNA,所得DNA适用于HLA的分型实验.     

用于慢病毒包装的高纯度质粒 DNA 的大量制备和应用

目的：建立简便易行、成本低廉和安全可靠的高纯度质粒大量制备方法,探讨其在分子生物学研究中的应用。方法：培养含目的质粒的菌株,运用改良后的碱裂解法大量提取质粒DNA并进行纯化,微量核酸仪测定质粒DNA的产量及纯度;采用琼脂糖凝胶电泳、限制性核酸内切酶酶切、转染哺乳动物细胞和慢病毒包装,鉴定质粒DNA的质量及转染效率。结果：本质粒提取方法获得质粒DNA产量为2．5mg／L菌液,OD260/OD280=1．91;以超螺旋质粒DNA为主;限制性核酸内切酶可完全酶切;哺乳动物细胞转染效率在85％以上;可用于慢病毒包装。结论：本方法抽提质粒DNA操作简单、经济实用,可替代质粒大量提取试剂盒获得高产优质的质粒DNA,充分满足了分子生物学实验的要求。     

白假丝酵母菌分离和鉴定方法的探讨

目的:建立一种白假丝酵母菌培养和鉴定的方法。方法:选用经改良沙氏培养基培养白假丝酵母菌,观察假菌丝、厚膜孢子,芽管形成,并结合糖发酵和其他生化试验给以初步鉴定,新法提取DNA作最后鉴定。结果:形态学观察和生化反应证实菌种为Candida albicans1型。DNA提取表明菌种与标准株DNA带型完全相同,提取DNA浓度(1.06±0.29)μg/μl,纯度好(OD260/OD280>1.7)。结论:本法制备的培养基适合白假丝酵母菌的生长和鉴定。     

不同的液化方法对痰液DNA提取的影响

为探讨不同固定液化方法对痰液中ＤＮＡ提取的影响，应用３种不同的痰液液化固定方法即：Ｓａｃｃｏｍａｎ ｎｏ法；ＤＴＴ法；Ｓａｃｏｍａｎｎｏ法和ＤＴＴ法联合应用。对经３种方法处理的痰液分别提取ＤＮＡ，应用分光光度仪测量其波长为２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处光密度值（ＯＤ值），以ＯＤ２６０／ＤＤ２８０作为衡量ＤＮＡ纯度的指标。结果表明用Ｓａｃｌｏ ｍａｎｎｏ法和ＤＴＴ活联合应用方法固定和液化的痰液中ＤＮＡ提取效果最佳，这为痰液作为呼吸系统疾病分子诊断样本提供依据。     

探讨血红蛋白对PCR检测乙型肝炎的影响

目的 :探讨血红蛋白对弱阳性乙型肝炎 (HBV) PCR定量检测结果造成的影响。方法 :采用煮沸法处理血清 ,分别设置阴性对照和阳性对照 (含量 3.0× 10 4 copies/ m L HBV DNA)。取浓度分别为 0 .1μg/ L、0 .5 μg/ L、1.0μg/ L、2 .5 μg/ L、5 .0 μg/ L、2 5 .0 μg/ L、5 0 .0 μg/ L、10 0 .0 μg/ L、5 0 0 .0 μg/ L 的血红蛋白 10 μL 加入管中 ,补充血清 (含3.0× 10 4 copies/ m L HBV DNA)至总体积 4 0 μL。用煮沸法提取 ,荧光定量 PCR检测 HBV DNA。结果 :血清标本中加入血红蛋白浓度 <5 .0 μg/ L 的 HBV DNA PCR结果全为阳性 ,经配对 χ2检验与阳性对照差异无显著性 (P>0 .0 5 )。加入血红蛋白浓度≥ 5 .0μg/ L时出现假阴性 ,经配对χ2 检验与阳性对照的差异有显著性 (P<0 .0 5 )。从各浓度组的变异系数 CV观察 ,血红蛋白浓度越高出现假阴性的机率就越大。结论 :在 HBV DNA PCR检测时 ,应纯化核酸避免血红蛋白对结果造成的影响