幽门螺杆菌临床菌株hpaA基因的克隆和表达及鉴定

目的：克隆幽门螺杆菌（Hp）hpaA基因，构建hpaA基因表达载体，鉴定其表达的融合蛋白免疫性。方法：采用高保真PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株Y06中扩增hpaA基因，T-A克隆后测定核苷酸序列，构建pET32a的hpaA表达载体，在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达，采用Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。结果：所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为94.25％-97.32％，氨基酸序列同源性高达95.38％-98.46％。pET32a-hpaA-BL21DE3系统的HpaA融合蛋白表达量高达细菌总蛋白的40％左右。HpaA融合蛋白能与Hp全菌抗体发生结合反应，免疫家兔能获得高效价抗体。结论：本研究成功地构建了Hp hpaA高效表达系统，所表达的HpaA融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性，可作为Hp疫苗的抗原。     

幽门螺杆菌临床菌株尿素酶B亚单位原核表达系统的构建及其重组蛋白免疫性的鉴定

目的：克隆幽门螺杆菌（Hp）ureB基因并构建其原核表达系统。方法：采用高保真PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株Y06中扩增ureB基因，T-A克隆后测定核苷酸序列，构建pET32a的ureB表达载体，在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达，采用Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。结果：所克隆的ureB基因与报道的相应核苷酸序列同源性为96.88％-97.82％，氨基酸序列同源性高达99.65％-99.82％。pET32a-ureB-BL21DE3系统的UreB融合蛋白表达量高达细菌总蛋白的40％左右。UreB融合蛋白能与Hp全菌抗体发生结合反应，免疫家兔能获得高效价抗体。结论：本研究成功地构建了Hp ureB高效表达系统，所表达的UreB融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性，可作为Hp瘤苗的抗原。     

幽门螺杆菌临床菌株flaB基因的克隆和表达及鉴定

目的：克隆幽门螺杆菌（Hp）鞭毛素B基因（flaB），构建其原核表达系统，鉴定融合蛋白免疫性。方法：采用高保真PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株Y06中扩增flaB基因，T-A克隆后测定核苷酸序列，构建pET32a的flaB表达载体，在E.coli BL21DE3宿主中用不同浓度的IPTG诱导表达，采用Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。ELISA检测125例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中FlaB抗体和41株Hp临床菌株FlaB表达。结果：所克隆的flaB基因与报道的相应核苷酸序列同源性为96.31％-97.73％，氨基酸序列同源性高达99.41％-100.00％。pET32a-flaB-BL21DE3系统的FlaB融合蛋白表达量为细菌总蛋白的40％左右。FlaB融合蛋白能与Hp全菌抗体发生结合反应，免疫家兔能获得高效价抗体。结论：本研究成功地构建了Hp flaB高效原核表达系统，所表达的FlaB融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性；Hp临床菌株FlaB表达率高，且能刺激机体产生抗体。FlaB可作为Hp疫苗及诊断试剂盒的抗原。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛相关外膜蛋白pgmA基因的克隆和表达

目的:克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)pgmA基因,构建pgmA基因表达载体,鉴定其表达产物的免疫性.方法:采用高保真PCR分别从牙龈卟啉菌ATCC 33277和47A-1菌株中扩增pgmA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET32a的pgmA表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,采用兔抗融合蛋白血清的Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性,采用ELISA 检测65株临床分离牙龈卟啉单胞菌与PgmA融合蛋白抗血清的反应情况.结果:所克隆的牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277与47A-1菌株pgmA基因的核苷酸序列同源性为100%,与报道的相应核苷酸序列同源性为98.98%,氨基酸序列同源性高达99.18%.pET32a-pgmA-BL21DE3系统的PgmA融合蛋白表达量为细菌总蛋白的50%左右.PgmA融合蛋白免疫家兔能获得相应抗体并与PgmA蛋白发生结合反应.ELISA结果证实92.3%的牙龈卟啉菌临床菌株(60/65)能与PgmA融合蛋白抗血清发生结合反应.结论:本研究成功地构建了Pg pgmA高效表达系统,所表达的PgmA融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Pg检测试剂盒和Pg疫苗的候选抗原.     

幽门螺杆菌CagA基因的原核表达及抗原性测定

目的：合成胃癌相关幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的 CagA基因片段,建立原核表达系统,鉴定重组表达产物的抗原性。方法：选取前期研究确定的与胃癌相关的H.pylori CagA基因片段,优化设计并合成CagA基因,将合成的CagA基因从pUC57-CagA质粒中切出,用表达载体pET32a携带该基因转化宿主菌BL21(DE3),通过氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pET32a-CagA;以IPTG诱导含pET32a-CagA的宿主菌表达融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析CagA蛋白表达情况,用Western印迹鉴定融合蛋白的抗原性。结果：设计并人工合成了CagA基因片段,序列测定结果显示,合成的CagA基因序列与设计的序列（AF289435）基本一致;成功构建pET32a-CagA原核表达质粒,对应蛋白序列与AAG09884同源性为100%;含pET32a-CagA的BL21(DE3)宿主菌经IPTG诱导后能表达CagA融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明,融合蛋白相对分子质量大小与预期一致(45 kD);Western印迹检测结果显示该融合蛋白可与抗H.pylori全菌抗体结合反应。结论：本实验构建的原核表达系统表达的CagA融合蛋白具有良好的抗原性,为临床胃癌相关H.pylori菌株的筛选和针对性治疗奠定了基础。     

弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区在大肠杆菌中的表达

目的：克隆并表达弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段，为下一步表达蛋白纯化奠定基础方法：将弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段克隆入高效融合表达载体pET32α，转化大肠杆菌B121(DE3)，37℃、IPTG诱导表达，SDS—PAGE分析表达产物结果：成功构建重组质粒pET32α—SAG1，经诱导后表达出含外源基因的融合蛋白，SDS—PAGE分析表达产物分子质量约44kDa，结论：弓形虫SAG1成熟蛋白编码区在原核表达系统pET32α/BL21(DE3)中获得成功表达，为下一步表达蛋白纯化提供试验依据。     

人趋化因子巨噬细胞炎性蛋白3α的克隆与原核表达

目的 克隆人趋化因子MIP-3alpha基因，表达并初步纯化MIP-3alpha融合蛋白。方法 从人扁桃体中提取总RNA，再进行RT-PCR，扩增MIP-3alpha成熟蛋白基因，并在5’和3’端分别添加NcoI和EcoRI酶切位点，通过与之对应的存在于pET32a（＋）质粒上的酶切位点重组于pET32a（＋）载体上，转化E．coli BL21trxB（DE3），筛选阳性克隆，酶切鉴定，DNA测序检测插入序列的正确性，缺失突变MIP-3 alpha序列前端多余碱基，获得MIP-3 alpha天然蛋白表达载体pET32a（＋）／MIP-3 alpha，SDS-PAGE分析其表达，Western Blot验证融合蛋白。大量表达并初步纯化MIP-3 alpha融合蛋白。结果 成功克隆了MIP-3 alpha基因，表达并初步纯化得到MIP-3 alpha融合蛋白。结论 在大肠杆菌中成功构建的MIP-3 alpha硫氧还蛋白融合表达栽体，以可溶性蛋白的方式表达MIP-3 alpha硫氧还蛋白。     

人生物素基因的原核表达及纯化

目的构建生物素原核表达载体，获取同源性、可溶性、高纯度的重组生物素融合蛋白，为生物素的深入研究及肿瘤的早期诊断奠定基础。方法从胃癌细胞中提取RNA，经RT-PCR扩增，克隆出生物素基因；用BamHⅠ和HindⅢ对生物素DNA和载体pET32进行双酶切，构建pET32．生物素重组质粒；将重组质粒转化BL21感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性、PCR和重组质粒双酶切筛选重组子转化菌落，经DNA测序及BLAST比对，确认生物素基因序列正确性以及插入pET32质粒的位点和方向；用IPTG诱导表达，Western-Blotting鉴定。用Ni2＋金属螯合层析柱纯化重组融合蛋白。结果通过RT-PCR。经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增的生物素DNA片段与预期大小一致。经双酶切及DNA测序鉴定，生物素DNA定向插入了pET32质粒。用重组质粒转化大肠杆菌BL21、诱导表达和纯化目的蛋白。经Western．Blotting鉴定。所诱导的蛋白为重组生物素融合蛋白。结论成功构建了生物素基因原核表达载体，表达和纯化了生物素融合蛋白。     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的：构建人CIDE-3基因的原核表达载体，并在E．coli BL21（DE3）中表达．方法：提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA，经RT—PCR扩增人CIDE-3基因片段，并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中，构建重组质粒pET28a（＋）-CIDE-3.经限制性内切酶Bam H I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后，转化E．coli BL21（DE3），经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白．     

幽门螺杆菌cagA蛋白的克隆表达与鉴定

目的　构建表达幽门螺杆菌 (Hp)毒素相关基因A蛋白 (cagA)的重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 ,为检出幽门螺杆菌致病株和运用于临床检测Hp感染奠定基础。 方法　PCR扩增出编码毒素相关基因蛋白DNA片段后构建出重组质粒 pET -cagA ,并经质粒酶切筛选、DNA测序、IPTG诱导DE3 表达融合蛋白和Western blot予以证实。表达的融合cagA蛋白经过纯化和凝血酶酶切验证cagA蛋白抗原性。 结果　克隆的cagA核苷酸序列与GeneBank(AB116 74 4 )公布的序列相比较 ,同源性达 99.34% ,推定氨基酸序列同源性为 99.0 1%。SDS -PAGE和Western blot检测到带有His tag的约 4 0kD融合蛋白中表达。融合蛋白酶切后能与抗cagA人抗血清发生阳性反应。 结论　重组cagA的原核表达质粒构建正确 ,蛋白表达成功 ,具有反应原性     

结核分枝杆菌H37Rv株Rv1494和Rv1495 假想蛋白基因的克隆表达

目的 为探索参与调控结核分枝杆菌(MTB)持续性感染的相关分子,对MTB H37Rv株编码Rv1494、Rv1495假想蛋白基因进行克隆、表达及Western blotting鉴定.方法 采用Bioedit、Dnaman软件及Pfam数据库对MTB H37Rv株Rv1494、Rv1495基因编码蛋白质的氨基酸组分、蛋白模块以及其与大肠杆菌E.coli的mazEF蛋白家族的同源性进行分析.以H37Rv株基因组为模板,分别对Rv1494、Rv1495基因进行克隆,构建pET32a( )原核表达质粒,转化BL21宿主菌.重组蛋白经SDS-PAGE电泳分离纯化和Western blotting鉴定.结果 生物信息学分析提示,Rv1494基因、Rv1495基因编码的蛋白质分别与大肠杆菌E.coli染色体编码的mazEF家族中的抗毒素和毒素具有一定程度的同源性,分别为26%和29.75%;经测序表明原核表达重组质粒构建成功.负载重组质粒的BL21菌经IPTG诱导后可表达出分子大小与预期值相一致的融合蛋白,表达量均可达到菌体总蛋白的60%.重组蛋白经Western blotting检测出特异性阳性信号.结论 首次对MTB H37Rv株编码Rv1494、Rv1495假想蛋白基因进行克隆表达,为进一步探讨该基因在参与调控MTB持续性感染过程中的功能奠定基础.     

肺炎链球菌自溶素基因的克隆、表达及蛋白纯化

 目的 克隆肺炎链球菌自溶素（LytA）基因并在大肠埃希菌中表达及蛋白纯化。方法 用PCR方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将其插入原核表达载体pET32a（+）,构建pET32a(+) - LytA重组质粒,经IPTG诱导使该基因在大肠埃希菌BL21 (DE3)中表达,亲和层析法纯化目的蛋白,将获得的蛋白用Western blot鉴定门结果扩增出的DNA序列与GenBank中的LytA基因序列一致,成功构建了pET32a(+) - LytA重组质粒并在大肠埃希菌中高效表达,所表达的蛋白经Western blot证实为肺炎链球菌自溶素融合蛋白。结论 成功克隆了肺炎链球菌自溶素基因,并将其在大肠埃希菌中表达、纯化,为新型肺炎链球菌疫苗的研制奠定了基础。     

人肌纤生成调节因子1融合蛋白在大肠杆菌的表达和抗体制备

目的研究人肌纤生成调节因子1(MR-1)的表达,获得MR-1蛋白,制备MR-1抗体,为MR-1生物功能研究提供基础.方法利用大肠杆菌质粒pGEX-5X-1、pET30a( )及pET24a( ),分别构建MR-1及其两端与不同标签序列融合的表达载体.在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中比较N端和/或C端融合标签序列对该基因表达的影响.通过凝胶蛋白电泳及电洗脱制备目的蛋白,免疫家兔.酶联免疫吸咐试验(ELISA)和Western b1ot检测所制备抗体的滴度和免疫原性.结果利用GST或T7-tag序列在其N端融合,使MR-1在大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL得到表达.利用所表达获得的MR-1-T融合蛋白,制备了针对此蛋白的多克隆抗体.ELISA检测所制备抗体滴度达到1:105,Western hlot显示所制备的多克隆抗体可用于检测天然细胞中的MR-1蛋白.结论MR-1蛋白需在N端与GST或T7-tag序列融合方可实现表达.利用在大肠杆菌表达纯化的蛋白所制备的抗体可用于MR-1生物学功能的研究.     

M istic融合蛋白促进ω-3脂肪酸去饱和酶 Fat-1在大肠埃希菌中高效表达

目的：构建真核膜蛋白ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1基因在大肠埃希菌中的高效表达质粒。方法利用分子克隆技术构建携带Fat‐1基因的重组原核表达质粒pET32a‐Fat‐1和插入膜蛋白表达分子伴侣Mistic基因的pET32a‐Mistic‐Fat‐1;将两种重组质粒转化大肠埃希菌株BL21（DE3）,IPTG诱导表达Fat‐1蛋白和M110‐Fat‐1蛋白,通过十二烷基‐聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS‐PAGE）灰度分析其表达量,蛋白免疫印迹法（Western blot）进一步鉴定蛋白表达。结果经酶切鉴定和测序证实成功构建了pET32a‐Fat‐1和pET32a‐Mistic‐Fat‐1原核表达载体;SDS‐PAGE和Western blot证实ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1在原核表达系统中没有明显诱导表达,而M 110‐Fat‐1融合蛋白在大肠埃希菌中获得了高效表达,占全细胞蛋白总量的15％。结论ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1基因与Mistic基因融合表达,实现了在原核宿主中高效表达真核膜整合蛋白ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1。     

HSP-沙眼衣原体MOMP T细胞表位基因的重组、原核表达和蛋白质纯化

目的：构建热休克蛋白65（HSP65）与沙眼衣原体（C.trachomatis,Ct）主要外膜蛋白（MOMP）T细胞表位（简称ctm1）融合蛋白（简称H-ctm1）的原核表达载体,并将其表达及纯化。方法：用PCR技术获得HSP65基因和ctm1基因,并分别将其克隆入pMD18-T载体,采用酶切与连接的方法从pMD18-T载体上获得HSP65基因片段,并将其克隆入pET28a表达质粒,再用相同的方法将ctm1基因连接于HSP65基因片段的下游,从而完成H-ctm1的基因重组。用IPTG诱导转化H-ctm1表达载体的大肠杆菌,以镍金属螯合亲和层析法纯化融合蛋白质。结果：构建了HSP65与ctm1的表达载体pET28a-H-ctm1,DNA序列测定结果表明构建正确。以镍金属螯合亲和层析获得纯度为98%的融合蛋白质。结论：用分子克隆技术正确构建HSP65与Ct MOMP T细胞表位融合蛋白的表达载体,并成功表达与纯化出具有生物活性的融合蛋白。     

幽门螺杆菌尿素膜通道基因的克隆和表达

目的 克隆幽门螺杆菌(Hp)尿素膜通道基因(ureI)和构建能表达UreI蛋白的原核表达工程菌,并初步研究产物的表达特性和免疫特性.方法 用PCR方法从Hp基因组中克隆ureI基因,构建原核表达重组质粒pET32a/ureI,双酶切和测序鉴定正确后,重组质粒转染大肠杆菌BL21 (DE3),构建高效表达UreI的工程菌BL21 /UreI.不同温度条件下用1.0 mmol/LIPTG诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Gel-Pro Analyzer 4分析重组蛋白的表达,并用Western blotting对其免疫原性进行分析.结果 克隆到约650 bp的基因片段,测序结果与GENBANK中对应菌株的ureI序列100%同源,与其他Hp的序列同源性不低于98.5%.工程菌BL21 /UreI含完整的ureI基因.在37℃、1.0 mmo1/LIPTG诱导14 h后,重组蛋白表达量可达菌体总蛋白的20.2%.分析表明重组蛋白主要以包涵体形式表达,经免疫印迹证实该重组蛋白有一定的免疫反应性和特异性.结论 成功构建了Hp ureI基因的原核表达载体,该载体可高表达有免疫特性的重组蛋白,为进一步研究Hp在胃的定植机制和抗Hp新药奠定了基础.