埃及伊蚊黄蛋白c基因的克隆、表达及其体外抗凝血作用

目的 克隆表达埃及伊蚊黄蛋白c (Aael-yellow-c)基因，并探讨r Aael-yellow-c蛋白体外抗凝血作用。方法 RT-PCR扩增Aael-yellow-c成熟肽基因，纯化后的片段与pEASY-E1载体连接，转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞，取菌液进行PCR、双酶切和测序鉴定。0.1 mol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达后，镍柱亲和层析纯化重组蛋白，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析重组蛋白表达情况。比浊法观察不同浓度r Aael-yellow-c蛋白对二磷酸腺苷诱导的血小板聚集活性影响。手工法检测不同浓度r Aael-yellow-c蛋白对人血浆凝血酶原时间（PT）、部分凝血活酶时间（APTT）及凝血酶时间（TT）的影响。采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，组间差异比较采用t检验。结果Aael-yellow-c基因CDS区为1 287 bp，含27个氨基酸组成的信号肽，成熟肽序列长1 200 bp，编码399个氨基酸。RT-PCR扩增获得Aael-yellow-c...     

检测DENV-2活病毒含量RTCA标准曲线法的建立

目的利用实时无标记细胞分析系统(real-time cellular analysis,RTCA)建立半数细胞指数时间(CIT50)与病毒滴度(TCID50)相关性的标准曲线,评估RTCA技术在监测2型登革病毒(DENV-2)感染BHK细胞后引发细胞病变效应(CPE)中的可行性和应用价值。方法检测不同培养条件下BHK细胞的CI值变化,筛选合适的初始细胞接种密度及血清浓度;应用RTCA分析已知不同TCID50滴度DENV-2感染BHK细胞的CIT50值,构建CIT50-TCID50标准曲线,计算回归方程;收集DENV-2感染C6/36细胞后第1~4d的培养上清(D1,D2,D3,D4),利用RTCA法和TCID50法分别检测上清中DENV-2滴度,分析CIT50-TCID50标准曲线法的灵敏度和可行性。结果 BHK细胞以初始接种密度为2×104个/孔,血清浓度为2%的培养条件为最佳;不同滴度DENV-2感染后BHK细胞的生长曲线均左移,CIT50与TCID50间呈线性负相关,线性方程为y=-7.007x+75.546(R2=0.9854);不同时间感染C6/36细胞培养上清中病毒含量(logTCID50/mL):RTCA标准曲线法为4.90±0.05(D2)、6.18±0.20(D3)、6.04±0.10(D4);传统TCID50法为0(D1)、6.25±0.49(D3)、5.87±0.35(D4)。结论利用RTCA技术建立的CIT50-TCID50标准曲线法,可用于已知DENV-2在BHK细胞的定量检测,结果较TCID50法更客观,且该法操作便捷且灵敏度高,为评估DENV-2感染性活病毒颗粒的毒力提供了新的技术手段。     

结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞的生长抑制作用

目的探索结核分枝杆菌RelE毒素蛋白是否对肺癌A-549细胞有生长抑制作用。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌RelE、RelB、RelBE基因,分别构建真核质粒PcDNA3.1-RelE、PcDNA3.1-RelB和PcDNA3.1-RelBE。经酶切分析和DNA测序证实重组质粒构建成功后,采用脂质体转染方法分别转入肺癌A-549细胞,经RT-PCR鉴定后,建立稳定表达相关蛋白的细胞株。通过细胞生长曲线、活细胞蛋白含量测定、MTT细胞增殖实验、HE染色观察细胞凋亡、流式细胞术检测瞬时转染细胞的凋亡率等,观察结核分枝杆菌RelE毒素蛋白是否对肺癌A-549细胞具有生长抑制和促凋亡的作用。结果结核分枝杆菌RelE毒素蛋白组的肺癌A-549细胞增殖速度低于其他各组,对营养缺乏更为敏感,相同范围视野下凋亡细胞多于其他各组,瞬时转染细胞的凋亡率也高于其他组(P<0.05)。结论结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞具有生长抑制和促凋亡的作用。     

两株登革2型病毒感染BALB/c小鼠后发病情况的观察

登革病毒 (denguevirus ,DEN)属于虫媒病毒 ,其致病机制一直是研究的热点 ,更多的学者注意到登革出血热 登革休克综合征 (denguehemorrhagicfe ver dengueshocksyndrome ,DHF DSS)可能是由病毒毒力变异 ,不同毒株感染的流行所致〔1〕。目前 ,许多相关研究多通过体外试验完成 ,难以准确反映体内情况。本研究采用DEN2NGC株和从患DHF的病人血清中分离得到的一株DEN2 〔2〕,经腹部皮下多点注射分别感染BALB c小鼠 ,观察登革 2型病毒不同毒株感染BALB c小鼠后的发病情况 ,为探索DEN感染的致病机制提供线索。材料和方法毒株与细胞 :…     

两株登革2型病毒感染BALB/C小鼠特异性抗体产生动态的比较

目的：两株登革2型病毒(Dengue Type 2 virus，DV2)初次和再次感染BALB／C小鼠建立动物感染模型，对其产生特异性抗体进行动态观察，探讨感染DV2NGG株和DV2临床分离株(B株)引起的体液免疫应答的差异。方法：两株Dv2毒株摸拟自然感染途径，经皮下多点注射建立BALB／C小鼠感染动物模型；采用间接ELISA法检测感染动物血浆中抗DV2特异性IgM类抗体、IgC类抗体，并同时分离病毒观察病毒血症期的变化。结果：不同DV2毒株初次、再次感染BALB／C小鼠后诱导特异性Ig产生的类别存在差异，且DV2B株再次感染动物后表现为病毒血症期相对延长。结论：两株DV2诱导性抗体产生的动态与病毒血症期不同。     

结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞成瘤性的抑制作用

目的探索结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对动物体内的肺癌A-549细胞的成瘤性的影响,以及因此产生的对动物免疫功能的作用。方法构建BALB/C小鼠的免疫抑制模型,通过接种稳定表达结核分枝杆菌RelE毒素蛋白、RelB抗毒素蛋白和RelBE毒素-抗毒素蛋白的肺癌A-549细胞株,含空质粒PcDNA3.1（＋）的A-549细胞株,以及正常的肺癌A-549细胞,构建BALB/C小鼠荷瘤模型,观察各组小鼠的肿瘤生长情况,并测定各组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性以及血清IFN-γ和IL-2的浓度。结果接种了表达RelE毒素蛋白的A-549细胞的小鼠组,肿瘤生长较其它实验组慢,肿瘤结节的瘤体体积和数量都较其它实验组有明显差异（P〈0.05）。对各组小鼠免疫功能变化的研究发现,各实验组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性以及血清IFN-γ和IL-2的浓度的差异没有统计学意义（P〉0.05）。结论结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞的成瘤性有抑制作用。     

登革病毒致病相关因素与体液免疫机制研究进展

登革病毒(Dengue virus,DEN)属黄病毒科、黄病毒属的一个血清学亚群,包括四个不同血清型(DEN1～DEN4)。是能引起人类发生从自限性的类似流感样综合征的登革热(dengue fever,DF)到严重威胁生命的登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)及登革休克综合征(Dengue shock syndrome,DSS)的病原体。近年来登革病毒感染在     

临床分离2型登革病毒突变株E蛋白N端158氨基酸基序免疫原性初探

目的:Ⅱ型登革病毒临床分离突变株(B株)E基因区部分序列的原核表达载体构建,蛋白表达、复性和纯化,及其免疫原性的初探。方法:将B株E基因1～476bp序列克隆入原核表达载体pET28a(+),经酶切、测序鉴定正确后转入表达菌,IPTG诱导后将包涵体变性,复性,纯化后的蛋白免疫C57BL/6和BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并通过Western blot和ELISA进行抗体鉴定。结果:成功构建了pET28a(+)-B-E原核表达载体,在表达菌中以包涵体形式稳定高表达,分子量为20kD。利用蛋白的His标签进行Western blot鉴定确定该蛋白为重组B-E蛋白,得到的可溶蛋白纯度大于90%。B-E蛋白免疫BALB/c和C57BL/6小鼠均可以得到有效的多克隆抗体。结论:B-E蛋白对BALB/c和C57BL/6小鼠具有免疫原性,其中ELISA鉴定免疫C57BL/6小鼠抗体的滴度为1∶12800,Western blot鉴定免疫BALB/c小鼠抗体滴度为1∶500。     

DEN-2 NGC株感染BALB/c小鼠TH1/TH2类细胞因子产生的差异

目的通过观察2型登革病毒(DEN2)NGC株初次感染和再次感染BALB/c小鼠后小鼠血浆中TH1和TH2类细胞因子的产生及其动态变化,研究DEN2感染的免疫机制。方法用不同量的DEN2NGC株经皮下多点注射,建立BALB/c小鼠感染模型,间接ELISA法测定感染后不同时间小鼠血浆IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的含量。结果(1)在初、再次感染阶段,DEN2NGC株各感染组产生IL-4、IFN-γ、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10与正常对照组有显著差异(P<0·05)。①在初次感染阶段,NGC株各感染组血浆IL-2、IL-5、IL-6于第4、6、8天出现;在再次感染阶段,各感染组产生IL-2、IL-5、IL-6均于第1天迅速升高;IL-2水平于第4天达高峰(104448·46±13314·1pg/ml),维持5~7天后迅速下降;IL-5于48小时达到高峰(135·125±46·75pg/ml);各组小鼠IL-6产生的动态相似,在再次感染后第1天,达高峰(555·823±44·639pg/ml)后逐渐下降。②初次感染早期,IL-4水平明显升高,而IFN-γ处于较低水平;再次感染后第1天,IL-4水平达最高峰(4294·668±349·038pg/ml),IFN-γ则于第4天和第11天达较高水平,两者的产生彼消此长,且产生动态与感染病毒量有关。(2)在初、再次感染阶段,用不同量DEN2NGC株感染组产生细胞因子水平有差异。结论DEN2NGC株初次和再次感染BALB/c小鼠后,TH1和TH2应答均可发挥一定作用,二者相互影响,TH细胞及其产生的CK在DEN感染的发病机制中起重要作用。     

赖型钩端螺旋体溶血素HlyX基因的克隆、表达及其细胞毒效应

目的：克隆、表达HlyX基因并研究其细胞毒性效应。 方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因，双酶切构建重组质粒，转化E.coliJM109，诱导表达HlyX；将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，Western blotting鉴定其免疫原性；将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞，通过检测ECV304细胞乳酸脱氢酶（LDH）和一氧化氮（NO）的释放量研究目的蛋白的细胞毒性效应。 结果:扩增出1 179 bp的目的基因HlyX，重组质粒经双酶切、PCR鉴定，测序结果表明重组质粒构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白约64 kD，主要以包涵体的形式表达，经免疫动物得到多克隆抗体，ELISA检测效价达1∶〖KG-*2〗64 000； Western blotting鉴定在目的蛋白的位置处有特异性阳性条带。经过HlyX融合蛋白作用的ECV304细胞LDH和NO释放量明显高于对照组（P<0.01）。 结论:HlyX能在大肠杆菌中表达，表达的目的蛋白对细胞有毒性效应。