人趋化因子ELC的克隆与表达

目的克隆人趋化因子ELC基因,表达并初步纯化ELC融合蛋白.方法从扁桃体中提取总RNA,再进行RT-PCR,扩增ELC成熟蛋白基因,并在5′和3′分别添加NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点,通过这两个酶切位点重组于pET32a( )载体上,转化E.coli DH5α,筛选阳性克隆,酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性,缺失突变获得ELC天然蛋白表达载体pET32a( )/ELC,SDS-PAGE分析其表达,Western blot验证融合蛋白.大量表达并初步纯化ELC融合蛋白.结果成功克隆了ELC基因,表达并初步纯化得到ELC融合蛋白.结论构建的ELC硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白的方式表达ELC硫氧还蛋白.     

人趋化因子SLC原核表达载体的构建与表达

目的构建趋化因子SLC(secondary lymphoid-tissue chemokine)的硫氧还蛋白融合表达载体并表达融合蛋白.方法从人扁桃体中提取总RNA,再进行RT-PCR,扩增SLC成熟蛋白基因,并在5'和3'分别添加Nco Ⅰ和EcoRⅠ酶切位点,通过这两个酶切位点重组于pET32a( )载体上,转化E.coli DH5α,筛选阳性克隆,酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性,经突变删除因Nco Ⅰ位点引入而在肠激酶位点和目的基因间多余的3个氨基酸,DNA再测序检测突变结果,SDS-PAGE分析其表达,并通过金属离子亲和层析、除盐、弱阳离子交换层析,得到纯化的融合蛋白,Western blot验证纯化的融合蛋白.结果成功构建了SLC天然蛋白的硫氧还蛋白融合表达载体,表达并纯化出融合蛋白,Western blot证明该融合蛋白能与羊抗人SLC一抗结合.结论构建的天然SLC硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白的方式稳定表达SLC硫氧还蛋白,并对融合蛋白进行了初步纯化.     

白细胞介素31在E.coli中的表达及活性鉴定

目的构建人IL-31原核表达载体，在大肠杆菌中表达，研究人IL-31对人表皮角化细胞分泌趋化因子MIP-3β的活性影响。方法大量培养pET28a（＋）-hIL-31工程菌株，提取质粒，BamHI、HindⅢ双酶切，并将其连接到原核表达载体pET32a（＋），通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达。用RT-PCR检测该目的蛋白对人表皮角化细胞HaCaT表达趋化因子MIP-3β的影响。结果原核表达质粒pET32a（＋）-hIL-31构建正确，经双酶切、PCR和序列测定鉴定，序列正确，IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中大量表达，纯化后的目的蛋白可刺激人表皮角化细胞表达MIP-3β。结论原核表达质粒pET32a（＋）-hIL-31构建正确，纯化后的蛋白具有生物学活性，可刺激人表皮角化细胞表达趋化因子MIP-3β，为研究人IL-31的作用及其作用机制和制备单克隆抗体奠定了基础。     

肺炎链球菌自溶素基因的克隆、表达及蛋白纯化

 目的 克隆肺炎链球菌自溶素（LytA）基因并在大肠埃希菌中表达及蛋白纯化。方法 用PCR方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将其插入原核表达载体pET32a（+）,构建pET32a(+) - LytA重组质粒,经IPTG诱导使该基因在大肠埃希菌BL21 (DE3)中表达,亲和层析法纯化目的蛋白,将获得的蛋白用Western blot鉴定门结果扩增出的DNA序列与GenBank中的LytA基因序列一致,成功构建了pET32a(+) - LytA重组质粒并在大肠埃希菌中高效表达,所表达的蛋白经Western blot证实为肺炎链球菌自溶素融合蛋白。结论 成功克隆了肺炎链球菌自溶素基因,并将其在大肠埃希菌中表达、纯化,为新型肺炎链球菌疫苗的研制奠定了基础。     

小鼠PDL1胞外区的克隆、表达及生物学效应研究

目的：克隆小鼠PDL1膜外区（简称mPDL-1 IgV）基因,构建原核表达载体,检测其表达和生物学活性。方法：提取小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆mPDL-1 IgV基因,并将其克隆到原核表达载体pET28a（＋）中,构建原核表达质粒pET28a（＋）／mPDL-1 IgV,转化大肠杆菌DH5α,进行PCR和双酶切鉴定,并测序。筛选阳性菌落,提取质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,同时纯化mPDL-1 IgV蛋白,进行生物学活性检测。结果：从小鼠脾细胞总RNA中成功获得mPDL-1 IgVcDNA克隆,重组质粒pET28a（＋）／mPDL-1 IgV构建正确。转化pET28a（＋）／mPDL-1 IgV的E．coli BL21（DE3）成功诱导性表达重组小鼠PDL-1胞外区蛋白,并纯化mPDL-1 IgV蛋白,对其进行了复性和浓缩,复性后的蛋白显示出良好的生物学活性。结论：成功地克隆、表达和纯化了小鼠PDL1胞外区蛋白,为进一步研究其功能提供了条件。     

结核分支杆菌ESAT-6基因蛋白的表达

目的构建致病性结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶（Early secretary antigenic target，ESAT-6）基因的pET原核表达载体，诱导表达并初步鉴定该蛋白。方法设计特异性引物，用PCR方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组中扩增ESAT-6基因，产物通过双酶切克隆入pET-32a（＋）质粒，经PCR、酶切、测序等方法鉴定后，转入大肠杆菌B121菌体中IPTG诱导表达，并经镍柱纯化、Western．blotting鉴定。结果所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致；表达融合蛋白相对分子质量约2．5Xlo＇，并能与特异性单抗结合，具有一定免疫学活性。结论成功表达纯化并鉴定构建了ESAT-6融合蛋白。     

人趋化因子SLC在大肠杆菌中的表达与初步纯化

目的确立人趋化因子SLC在大肠杆菌中的表达条件和初步纯化条件。方法将pET32a（＋）/SLC分别转化大肠杆菌AD494（DE3）、BL21trxB（DE3）、BL21trxB（DE3）plusS．选择最佳宿主菌，优化诱导表达的条件，将大量表达的目的蛋白经金属离子亲和层析、除盐、肠激酶酶切、阳离子交换进行初步纯化。结果pET32a（＋），SLC最佳宿主菌为BI。21trxB（DE3）．优化的表达条件为37C、1mmol／LIPTG诱导3h，SDS-PAGE分析可见，表达蛋白的大小约为30kd，占菌体总蛋白的50%以上．可溶性蛋白约占50％。用SLC多克隆抗体进行Westernblm分析显示，在30kd处出现单一阳性条带，而对照的pET32a（＋）／BL21trxB（DE3）诱导菌则无此反应。SLC经一系列纯化步骤得到初步纯化。结论初步建立pET32a（＋）／SLC在宿主菌BL21trxB（DE3）中表达和纯化的方法。     

霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的 构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）的融合表达载体。并在原核细胞中表达，为霍乱弧菌肠毒素A亚基（CTA）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法 以霍乱弧菌DNA为模板．PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因，与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组，构建重组质粒．转化大肠杆菌BL21（DE3），并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后，以IPTG诱导表达Trx—CTA融合蛋白，用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明，我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因，成功构建了重组质粒pET—ctxA，经SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论 霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

小鼠OX40原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a（＋），重组pET32a—OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21（DE3）进行融合蛋白的小量诱导表达。结果出现新增蛋白条带，融合蛋白主要存在于包涵体中；Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合。结论构建了小鼠OX40基因的原核表达载体，获得OX40胞外段融合蛋白。     

杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶重组蛋白的纯化及其多克隆抗体制备

目的：纯化杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）重组蛋白,制备多克隆抗体。方法：PCR扩增得到两端分别添加NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点的GPI基因,双酶切后插入原核表达载体pET28a（＋）,得到重组载体pET28a-GPI,经鉴定正确后,用该重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达后用镍离子柱纯化目的蛋白并免疫新西兰白兔,间接ELISA和Westernblot法检测抗体的效价和特异性。结果：杜氏盐藻GPI基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达,占总蛋白的41.6%。以高纯度的目标蛋白作为抗原免疫新西兰白兔,得到抗GPI的抗血清。间接ELISA检测抗血清效价达到1：512000,Westernblot检测证实抗血清能与目的蛋白特异性结合。结论：成功纯化了杜氏盐藻GPI重组蛋白并制备了特异性的GPI多克隆抗体。