幽门螺杆菌临床菌株尿素酶B亚单位原核表达系统的构建及其重组蛋白免疫性的鉴定

目的：克隆幽门螺杆菌（Hp）ureB基因并构建其原核表达系统。方法：采用高保真PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株Y06中扩增ureB基因，T-A克隆后测定核苷酸序列，构建pET32a的ureB表达载体，在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达，采用Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。结果：所克隆的ureB基因与报道的相应核苷酸序列同源性为96.88％-97.82％，氨基酸序列同源性高达99.65％-99.82％。pET32a-ureB-BL21DE3系统的UreB融合蛋白表达量高达细菌总蛋白的40％左右。UreB融合蛋白能与Hp全菌抗体发生结合反应，免疫家兔能获得高效价抗体。结论：本研究成功地构建了Hp ureB高效表达系统，所表达的UreB融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性，可作为Hp瘤苗的抗原。     

幽门螺杆菌临床菌株flaB基因的克隆和表达及鉴定

目的：克隆幽门螺杆菌（Hp）鞭毛素B基因（flaB），构建其原核表达系统，鉴定融合蛋白免疫性。方法：采用高保真PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株Y06中扩增flaB基因，T-A克隆后测定核苷酸序列，构建pET32a的flaB表达载体，在E.coli BL21DE3宿主中用不同浓度的IPTG诱导表达，采用Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。ELISA检测125例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中FlaB抗体和41株Hp临床菌株FlaB表达。结果：所克隆的flaB基因与报道的相应核苷酸序列同源性为96.31％-97.73％，氨基酸序列同源性高达99.41％-100.00％。pET32a-flaB-BL21DE3系统的FlaB融合蛋白表达量为细菌总蛋白的40％左右。FlaB融合蛋白能与Hp全菌抗体发生结合反应，免疫家兔能获得高效价抗体。结论：本研究成功地构建了Hp flaB高效原核表达系统，所表达的FlaB融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性；Hp临床菌株FlaB表达率高，且能刺激机体产生抗体。FlaB可作为Hp疫苗及诊断试剂盒的抗原。     

大肠杆菌LTB与霍乱弧菌CTB基因的克隆和表达及鉴定

目的：克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）及霍乱弧菌肠毒素B亚单位（CTB）基因，构建其表达载体。方法：采用高保真PCR分别从E.coli44815株与V.cholerae东74株基因组DNA中扩增LTB与CTB基因，T-A克隆后测定核苷酸序列。分别构建pET32a的LTB及CTB表达载体，在E.coliBL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE及GM1-ELISA鉴定表达产物。结果：所克隆的LTB和CTB基因与报道的相应核苷酸序列同源性分别为99.12％-99.71％和98.54％-99.42％，氨基酸序列同源性分别高达97.58％-99.19％和96.77％-99.19％。pET32a-LTB-BL21DE3和pET32a-CTB-BL21DE3系统表达的融合蛋白产量分别占细菌总蛋白的30％和10％左右。GM1-ELISA结果证实LTB及CTB融合蛋白均能与牛GM1结合。结论：本研究成功地构建了LTB与CTB表达系统，所表达的LTB与CTB融合蛋白具有粘膜免疫佐剂活性。     

幽门螺杆菌NCTC11639基因hpaA的克隆表达及鉴定

目的获取幽门螺杆菌（Hp）hpaA基因的序列。预测其编码蛋白hpaA作为候选疫苗的可行性。在大肠杆菌表达系统中表达hpaA。方法提取Hp标准株NCTC11639的基因组DNA。使用PCR扩增hpaA基因。克隆入pGEM—T载体中测序。并进行同源性分析。将hpaA克隆入表达载体pGEX-4T-1中，诱导表达。SDS-PAGE电泳鉴定。结果同源性分析表明hpaA具有很高的保守性，成功构建出可以高效、分泌型表达hpaA的原核表达系统。结论hpaA具有高保守性，在Hp各菌株中普遍存在，是有良好应用前景的Hp候选疫苗。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛相关外膜蛋白pgmA基因的克隆和表达

目的:克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)pgmA基因,构建pgmA基因表达载体,鉴定其表达产物的免疫性.方法:采用高保真PCR分别从牙龈卟啉菌ATCC 33277和47A-1菌株中扩增pgmA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET32a的pgmA表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,采用兔抗融合蛋白血清的Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性,采用ELISA 检测65株临床分离牙龈卟啉单胞菌与PgmA融合蛋白抗血清的反应情况.结果:所克隆的牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277与47A-1菌株pgmA基因的核苷酸序列同源性为100%,与报道的相应核苷酸序列同源性为98.98%,氨基酸序列同源性高达99.18%.pET32a-pgmA-BL21DE3系统的PgmA融合蛋白表达量为细菌总蛋白的50%左右.PgmA融合蛋白免疫家兔能获得相应抗体并与PgmA蛋白发生结合反应.ELISA结果证实92.3%的牙龈卟啉菌临床菌株(60/65)能与PgmA融合蛋白抗血清发生结合反应.结论:本研究成功地构建了Pg pgmA高效表达系统,所表达的PgmA融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Pg检测试剂盒和Pg疫苗的候选抗原.     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆及序列分析

目的：获取含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A编码基因并构建其重组载体，进行核苷酸序列分析，为在E．coli BL21中表达，疫苗的开发奠定基础。方法：利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中，扩增热休克蛋白A编码基因片段。将目的基因与pET32a( )同时经kpnI、BamHI双酶切、纯化、连接后。转化含有目的基因的重组载体，进行序列分析。结果：经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hp热休克蛋白A编码基因，与GenBank的报道相比较，有1．4％的bp发生变异，1．6％的氨基酸残基改变。其同源性高达98％。结论：成功地克隆了Hp热休克蛋白A编码基因，为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

幽门螺杆菌cagA蛋白的克隆表达与鉴定

目的　构建表达幽门螺杆菌 (Hp)毒素相关基因A蛋白 (cagA)的重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 ,为检出幽门螺杆菌致病株和运用于临床检测Hp感染奠定基础。 方法　PCR扩增出编码毒素相关基因蛋白DNA片段后构建出重组质粒 pET -cagA ,并经质粒酶切筛选、DNA测序、IPTG诱导DE3 表达融合蛋白和Western blot予以证实。表达的融合cagA蛋白经过纯化和凝血酶酶切验证cagA蛋白抗原性。 结果　克隆的cagA核苷酸序列与GeneBank(AB116 74 4 )公布的序列相比较 ,同源性达 99.34% ,推定氨基酸序列同源性为 99.0 1%。SDS -PAGE和Western blot检测到带有His tag的约 4 0kD融合蛋白中表达。融合蛋白酶切后能与抗cagA人抗血清发生阳性反应。 结论　重组cagA的原核表达质粒构建正确 ,蛋白表达成功 ,具有反应原性     

幽门螺杆菌hpaA真核表达质粒的构建及鉴定

目的　克隆幽门螺杆菌hpaA基因,并构建其真核表达质粒。方法　以HpNCTC11637基因组DNA为模板, PCR扩增hpaA基因,亚克隆至pMD18 T载体中,目的基因经酶切纯化后插入pTCAE,转化E.coliDH5α,酶切并测序鉴定正 确的重组质粒命名为pT hpaA。电穿孔法将pT hpaA转染CHO细胞,Westernblot检测HpaA蛋白的表达。结果　克隆重组 得到pT hpaA,将pT hpaA电穿孔法转染CHO后,培养上清经Westernblot检测,在相对分子量为30000条带处出现特异性抗 原抗体反应。结论　成功构建了幽门螺杆菌hpaA真核表达质粒,体外CHO细胞转染和Westernblot实验证实了HpaA蛋 白的表达,为进一步的免疫实验奠定了基础。     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的表达及免疫原性

目的克隆幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(NAP)基因并制备其原核表达系统,研究其表达蛋白的免疫原性,为Hp疫苗研制提供理论依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增Hp-NAP基因,测序并作同源性分析后,亚克隆入原核表达载体pET-22b,转化表达菌BL21-CodonPlus(r)(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,Western blot鉴定其免疫原性。结果PCR扩增一408 bp产物,与基因库中相关序列具有高度同源性(>98%)。重组质粒pET-22b-nap转化BL21-CodonPlus(r)(DE3)后表达一相对分子质量约19 000的融合蛋白,能与Hp全菌抗体产生结合反应,Western blot显示特异的单一条带。结论成功构建Hp-NAP原核表达系统,所表达NAP融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆及表达

目的 通过基因工程技术获得具有良好免疫原性的重组N-乙酰神经氨酰乳糖结合原纤维样血凝素（HpaA）。 方法 利用PCR技术从幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）总DNA中钓取hpaA结构基因,克隆及序列分析后在大肠杆菌中进行高效表达,表达产物经纯化后用酶联免疫吸附法（ELISA）检测其抗原性。结果 序列分析证实hpaA结构基因长度为783 bp,编码261个氨基酸,SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约为29 000,可溶性表达占全菌的20%以上,经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析后获得纯度为90%的重组蛋白。ELISA法显示该蛋白可被Hp全菌抗血清识别。结论 基因重组粘附素HpaA具有良好的抗原性,可望作为一种有效的蛋白疫苗用于Hp感染的防治。     

幽门螺杆菌UreB-NAP-HpaA三价DNA疫苗的构建及免疫原性初步研究

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)尿素酶亚单位B(UreB)、中性粒细胞激活蛋白(NAP)及黏附素A(HpaA)三价重组DNA疫苗并研究其抗原性,为Hp疫苗的开发奠定基础.方法:PCR扩增UreB、NAP、HpaA全长序列,分别克隆入pMD 18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UNH,然后将其亚克隆入真核表达载体pIRES,以此转染COS-7细胞,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.结果:PCR分别获得约1 707、432和750 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约2 901 bp目的基因.重组质粒pIRES-UNH转染COS-7细胞后表达相对分子质量约107 000的蛋白质,Western印迹显示该重组蛋白可为UreB、NAP、HpaA抗血清特异识别,具有良好的抗原性.结论:成功构建了具有良好免疫原性的UreB-NAP-HpaA三价重组DNA疫苗,为进一步探讨其免疫保护性及Hp疫苗的研制奠定了基础.     

幽门螺杆菌双基因多表位重组原核表达工程菌的构建及其表达特性的研究

目的构建含幽门螺杆菌尿素酶保守基因序列ureI和ureB的双基因（简称IB）多表位原核表达质粒以及原核表达T程菌,并研究其微生物学特性。方法通过生物信息学方法从ureI和ureB基凶中筛选T细胞和B细胞优势表位基因序列,人工合成所选择的表位基因序列并构建原核重组表达质粒pET28a（＋）／IB。经限制性内切酶（EcoR I,XhoI）鉴定及DNA测序鉴定后,将重组质粒导人大肠杆菌BL21（DE3）。该工程菌经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测重组蛋白（riB）的表达情况,用Westernblot检测riB的免疫反应性。结果构建的双基因多表位基因序列与所设计的一致;工程菌经IPTG诱导后做SDS-PAGE电泳显示,在28kD左右有一条明显蛋白条带,Westernblot结果显示在28kD左右出现特异反应条带。结论成功构建含ureI和ureB双基因序列的原核表达质粒pET28a（＋）／IB及工程菌,该工程菌表达的重组蛋白riB能被抗幽门螺杆菌悉尼株（H．pylori SSl）的特异抗体所识别,表明该新重组蛋白与幽门螺杆菌有高度相关性。     

幽门螺杆菌CagA基因的原核表达及抗原性测定

目的：合成胃癌相关幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的 CagA基因片段,建立原核表达系统,鉴定重组表达产物的抗原性。方法：选取前期研究确定的与胃癌相关的H.pylori CagA基因片段,优化设计并合成CagA基因,将合成的CagA基因从pUC57-CagA质粒中切出,用表达载体pET32a携带该基因转化宿主菌BL21(DE3),通过氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pET32a-CagA;以IPTG诱导含pET32a-CagA的宿主菌表达融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析CagA蛋白表达情况,用Western印迹鉴定融合蛋白的抗原性。结果：设计并人工合成了CagA基因片段,序列测定结果显示,合成的CagA基因序列与设计的序列（AF289435）基本一致;成功构建pET32a-CagA原核表达质粒,对应蛋白序列与AAG09884同源性为100%;含pET32a-CagA的BL21(DE3)宿主菌经IPTG诱导后能表达CagA融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明,融合蛋白相对分子质量大小与预期一致(45 kD);Western印迹检测结果显示该融合蛋白可与抗H.pylori全菌抗体结合反应。结论：本实验构建的原核表达系统表达的CagA融合蛋白具有良好的抗原性,为临床胃癌相关H.pylori菌株的筛选和针对性治疗奠定了基础。     

人肌纤生成调节因子1融合蛋白在大肠杆菌的表达和抗体制备

目的研究人肌纤生成调节因子1(MR-1)的表达,获得MR-1蛋白,制备MR-1抗体,为MR-1生物功能研究提供基础.方法利用大肠杆菌质粒pGEX-5X-1、pET30a( )及pET24a( ),分别构建MR-1及其两端与不同标签序列融合的表达载体.在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中比较N端和/或C端融合标签序列对该基因表达的影响.通过凝胶蛋白电泳及电洗脱制备目的蛋白,免疫家兔.酶联免疫吸咐试验(ELISA)和Western b1ot检测所制备抗体的滴度和免疫原性.结果利用GST或T7-tag序列在其N端融合,使MR-1在大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL得到表达.利用所表达获得的MR-1-T融合蛋白,制备了针对此蛋白的多克隆抗体.ELISA检测所制备抗体滴度达到1:105,Western hlot显示所制备的多克隆抗体可用于检测天然细胞中的MR-1蛋白.结论MR-1蛋白需在N端与GST或T7-tag序列融合方可实现表达.利用在大肠杆菌表达纯化的蛋白所制备的抗体可用于MR-1生物学功能的研究.     

幽门螺杆菌BIB原核表达工程菌的构建及微生物学特性分析

目的构建融合了幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白（Ure I）、尿素酶B亚单位（UreB）的表位基因及霍乱毒素B亚单位（CTB）的原核表达质粒pET28a（＋）／ct B／ure I-B（简称BIB）及其原核表达工程菌,并研究其生物学特性。方法参考基因库中ure l、ure B、ct B的基因序列,合成不舍信号肽的ct B基因及ure I、ure B优势表位基因,串联融合,形成多靶点重组ct B／ure I-B基因（简称BIB基因）,并构建pET28a（＋）／BIB原核表达质粒,经限制性内切酶Nco I、Xho I酶切以及DNA测序鉴定正确后,将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中,构建含BIB基因的原核表达工程菌。经乳糖诱导后,SDS-PAOE电泳检测重组蛋白（rBIB）,Western blot及肌注BALB／c小鼠实验检测rBIB的免疫反应性和免疫原型。结果构建的原核表达质粒pET28a（＋）／BIB,经双酶切和测序分析显示,构建的BIB基因与设计序列100％一致。乳糖诱导后,SDS-PAGE电泳显示在33kD左右出现一条明显蛋白条带,Western blot检测在33kD左右出现特异反应条带,肌注免疫BALB／c小鼠产生了较高的抗体水平。结论成功构建了pET28a（＋）／BIB原核表达质粒及BIB原核表达工程菌,该工程菌可表达重组蛋白rBIB,且该重组蛋白具有良好的免疫反应性及免疫原性。     

幽门螺杆菌多表位重组原核表达工程菌的构建及表达特性研究

目的 构建含有幽门螺杆菌尿素酶（UreI、UreB）及粘附素（HpaA）的多表位原核表达质粒pET28a(+)/ureI-ureB-hpaA〔pET28a(+)/IBA〕及相应的原核表达工程菌,研究其表达特性。 方法 通过生物信息学方法从ureI 、ureB和 hpaA基因中筛选T细胞和B细胞优势表位基因序列,人工合成并构建原核重组表达质粒pET28a(+)/IBA。经限制性内切酶（Nde Ⅰ,Xho Ⅰ）酶切鉴定及DNA测序鉴定后导入大肠杆菌BL21 (DE3) 。该工程菌经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测重组蛋白（rIBA）的表达情况,以抗幽门螺杆菌悉尼株（SS1株）特异卵黄抗体采用Western blot检测rIBA的抗原性。 结果 构建的多表位原核表达质粒pET28a(+)/IBA双酶切和测序鉴定与设计序列100%一致。工程菌经 IPTG 诱导后SDS-PAGE电泳显示在相对分子质量40×10 ³左右有一条明显蛋白条带,Western blot显示有相应位置特异反应条带。 结论 成功构建幽门螺杆菌多表位重组原核表达质粒pET28a(+)/IBA及相应原核表达工程菌,该工程菌表达的rIBA具有抗原性,表明该重组蛋白与幽门螺杆菌有高度相关性。