藤黄微球菌Rpf结构域及其突变体蛋白的生物学活性测定

目的:对藤黄微球菌Rpf结构域及其突变体E54K,E54A蛋白的生物学活性进行评价。方法:将纯化的Rpf结构域及其突变蛋白加入到休眠的耻垢分枝杆菌中测定各自的生物活性。结果:证实Rpf结构域蛋白对耻垢分枝杆菌有一定的促生长作用,而突变体E54A,特别是E54K没有此作用。结论:明确了Rpf结构域及其两种突变体蛋白,对耻垢休眠菌复苏的作用,为上述蛋白在结核病预防和快速诊断中的应用奠定基础。     

藤黄微球菌Rpf基因的克隆表达及纯化鉴定

目的:克隆藤黄微球菌Rpf基因,序列测定正确后进行融合表达纯化.方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法,从藤黄微球菌基因组中扩增出藤黄微球菌Rpf基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC-19克隆载体中,测序正确后再亚克隆到融合表达载体pPro-EXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rpf蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化.结果:获得藤黄微球菌Rpf基因,得到融合6个组氨酸残基的藤黄微球菌Rpf蛋白,可溶性分析发现融合蛋白主要在包涵体中存在,最后在变性条件下,用Ni2 -NTA 亲和色谱柱纯化目的融合蛋白,纯化获得的融合蛋白纯度大于90%,Western-Blot证实获得的蛋白为所需要的目的蛋白.结论:构建了藤黄微球菌Rpf基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白,为以后的深入研究奠定了基础.     

迁移侵袭抑制蛋白 MIIP 基因 K167E 位点突变体的构建和表达

目的构建人迁移侵袭抑制蛋白（MIIP）蛋白K167E突变体的原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP（K167E）并进行表达和纯化,为MIIP的后续功能研究提供有效工具。方法以pGEX-4T-1-MIIP重组质粒为模板,PCR扩增得到人MIIP基因（K167E）突变体的eDNA全长,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌B121细胞中诱导表达,纯化获得GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结果酶切鉴定和测序结果显示,pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体构建成功。经诱导表达及纯化后,成功获得的GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结论成功构建了pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体,并获得了GST—MIIP（K167E）融合蛋白。     

rhTL1A基因原核表达载体的构建、表达与纯化

目的：构建人肿瘤坏死因子样分子1A（TL1A）原核表达质粒并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白。方法：人HUVECs总RNA经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增TL1A基因,克隆到pTA2载体,酶切和测序鉴定正确后构建重组原核表达质粒pQE-TL1A,并转化大肠杆菌M15［pREP4］。IPTG诱导目的蛋白表达并进行Western blotting鉴定;镍离子亲和层析柱(Ni²⁺-NTA)纯化靶蛋白。结果：目的基因经酶切其结果与预期相符,测序结果显示目的基因与GenBank登录的序列(登录号AF520785)完全一致;工程化大肠杆菌M15［pREP4］经IPTG诱导表达相对分子质量约22 000的目的蛋白;Western blotting鉴定结果显示,重组蛋白能够与抗His单克隆抗体特异性结合。结论：成功地构建了重组原核表达质粒pQE-Tl1A,并纯化获得高纯度重组TL1A蛋白。     

重组人bFGF蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

【目的】构建人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因的原核表达载体,并对其进行诱导表达和蛋白质纯化,以获得大量重组人bFGF蛋白。【方法】人工合成bFGF基因,进行测序分析,将该基因克隆入原核表达载体pET22b中,转化感受态细胞大肠杆菌RPX,经IPTG诱导表达重组bFGF蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blotting检测分析。【结果】成功构建了人重组bFGF表达质粒pET22b-rhbFGF,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,分子量约在18×103Da处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的28%,纯化后的蛋白质灰度扫描检测,纯度为95%。【结论】成功构建了重组人bFGF原核表达载体,并成功纯化了该基因的原核表达产物,为下一步人bFGF的产业化打下了基础。     

蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2基因的克隆、表达及活性鉴定

【目的】获取人蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2（PTP4A2）基因并高效表达纯化,对于产物的体外活性进行测定。【方法】用RT-PCR技术,从肝癌细胞系HepG2的总RNA中,获得编码PTP4A2基因功能片段的DNA。测序后,通过酶切亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达载体,并导入大肠杆菌E.coliBL21中,IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白。对重组融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化,western印记进行鉴定,质谱检测蛋白分子量。通过其对底物磷酸多肽的去磷酸化反应,鉴定其活性。【结果】获得编码肝癌细胞PTP4A2（全长氨基酸）的基因序列,测序结果与已发表的基因序列相一致。重组GST融合蛋白经western分析,在相对分子质量Mr=45000处,有特异的蛋白条带。重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白,质谱检测其分子量为45470.6。底物多肽去磷酸化反应表明纯化产物具有较强活性。【结论】成功克隆人PTP4A2基因,并在E.coliBL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST融合蛋白,质谱检测分子量与预期结果一致,纯化产物具有蛋白磷酸酯酶活性。     

结核分支杆菌HSP70原核表达载体的构建和表达及蛋白纯化

目的：构建结核分支杆菌HSP70原核表达载体并诱导其表达和纯化及鉴定目的蛋白。方法：利用PCR技术从牛型结核分支杆菌基因组中扩增出Mtb HSP70 DNA序列，构建重组质粒pGEM-Mtb HSP70，经酶切、PCR和测序鉴定后，将Mtb HSP70基因亚克隆到原核表达质粒PQE30，构建重组表达质粒PQE30-Mtb HSP70，在大肠杆菌M15中诱导表达。用镍凝胶亲和层析的方法纯化目的蛋白，Western blotting杂交鉴定纯化蛋白。结果：经测序证实，获得的目的基因与GenBank中公布的结核杆菌Mtb HSP70基因序列一致。构建的原核表达载体PQE30-Mtb HSP70在大肠杆菌M15中经1 mmol•L^-1 IPTG诱导后表达出相对分子质量约为70 400的蛋白，镍柱纯化后经抗组氨酸单克隆抗体进行Western blotting,在相对分子质量约70 400处可见特异性着色带。结论：成功构建原核表达载体PQE30-Mtb HSP70，并成功诱导Mtb HSP70蛋白的 表达，通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的Mtb HSP70蛋白。     

蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2基因的克隆、表达及活性鉴定

 【目的】获取人蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2（PTP4A2）基因并高效表达纯化,对于产物的体外活性进行测定。【方法】用RT-PCR技术,从肝癌细胞系HepG2的总RNA中,获得编码PTP4A2基因功能片段的DNA。测序后,通过酶切亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达载体,并导入大肠杆菌E.coliBL21中,IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白。对重组融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化,western印记进行鉴定,质谱检测蛋白分子量。通过其对底物磷酸多肽的去磷酸化反应,鉴定其活性。【结果】获得编码肝癌细胞PTP4A2（全长氨基酸）的基因序列,测序结果与已发表的基因序列相一致。重组GST融合蛋白经western分析,在相对分子质量Mr=45000处,有特异的蛋白条带。重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白,质谱检测其分子量为45470.6。底物多肽去磷酸化反应表明纯化产物具有较强活性。【结论】成功克隆人PTP4A2基因,并在E.coliBL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST融合蛋白,质谱检测分子量与预期结果一致,纯化产物具有蛋白磷酸酯酶活性。     

人细胞周期蛋白D1及细胞周期蛋白激酶CDK4的原核表达及鉴定

【目的】构建表达人细胞周期蛋白Dl及细胞周期蛋白激酶CDK4融合蛋白的重组体。【方法】用RT-PCR从HL-60细胞中扩增细胞周期蛋白D1及CDK4基因片段，克隆到pGEM-T easy载体上。测序鉴定后切下相应的片段，连接到表达载体pET-22b( )上，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DL3)，使之高效表达融合蛋白细胞周期蛋白D1及CDK4。SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定表达蛋白。【结果】 用PCR扩增得到了正确的目的基因片段并构建成pET-cyclinD1和pET-CDK4两个原核表达载体。将其转化大肠杆菌，Western blot检测证实了转化的大肠杆菌能表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白。【结论】 本研究成功构建了细胞周期蛋白D1及CDK4原核表达载体，后两在细胞内能正确表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白．     

高可溶性Aβ融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的在大肠杆菌中表达阿尔茨海默病(AD)相关肽段Aβ与具有强助溶作用的麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白,从而经济有效地获得具有天然免疫原性的Aβ肽段,为深入研究AD的发病机理和治疗药物提供重要的物质基础。方法用PCR法扩增Aβ的基因片段,并将其插入到含有麦芽糖结合蛋白的融合表达载体pMAL-c2中,经测序后再将重组质粒转化入大肠杆菌TB1中进行诱导表达。经多聚麦芽糖亲和色谱的纯化获得MBP-Aβ融合蛋白。再用SDS-PAGE及Western blotting鉴定Aβ及其融合蛋白的表达和免疫原性。结果测序结果证实插入的DNA片段与Aβ序列一致。SDS-PAGE电泳显示Aβ融合蛋白被高效表达。Western blotting结果表明Aβ及其融合蛋白可被其特异性抗体识别。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性的Aβ融合蛋白并经纯化和酶解后获得了Aβ纯肽段,为AD病机理的研究及其病理模型的建立提供了物质基础。     

人La蛋白突变体表达质粒的构建及诱导表达纯化

目的:构建人La蛋白(human La protein,hLa)突变体表达质粒,并在大肠杆菌中表达野生型La蛋白及各突变体.方法:利用定点突变技术,对野生型人La蛋白的原核表达质粒pET28b-hLa进行定向缺失突变,将得到的3个突变体Mu1(A366)、Del1(A235～276)、Del2(A119～150)分别克隆至pET28b中,获得野生型人La蛋白突变体的表达质粒,并在BL21(DE3)和Rosetta2两种不同宿主菌中和不同浓度的IPTG诱导条件下进行蛋白表达水平的比较.结果:所获得的人La蛋白突变体的基因编码序列经测序符合序列设计的要求,表达产物经SDS-PAGE分析可见,在相对分子质量47 000处出现一明显条带,与预期的相对分子质量一致.结论:三个位点的序列改变并没有明显影响hLa蛋白的表达,在补充密码子的宿主菌Rosetta2中的表达量优于宿主菌BL21(DE3).     

嗜肺军团菌热休克蛋白60基因在大肠杆菌中的表达

目的 探讨大肠杆菌中表达嗜肺军团菌的热休克蛋白60（HSP60）的表达。方法 利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增嗜肺军团菌HSP60基因，将其定向插入载体pUC18构建重组原核表达质粒，重组质粒转化到大肠杆菌JM109后IPTG诱导表达。并对其表达产物进行SDS-PAGE和Westem-blotting分析。结果 重组质粒在大肠杆菌中成功表达，可被抗军团菌抗血清识别。结论 HSP60基因可在大肠杆菌中表达。并有免疫原性。     

成纤维细胞生长因子-21[Arg59]突变体基因的克隆及融合蛋白的表达与纯化

目的：对野生型成纤维细胞生长因子-21（FGF21）进行突变改造及表达与纯化,为后续蛋白质体外偶联(Pull-down)实验及建立人源肝癌裸鼠模型奠定基础。方法：采用PCR定点突变方法,将FGF21 cDNA第59位赖氨酸密码子突变为精氨酸密码子,所得的突变体片段与SUMO分子伴侣相连后插入表达载体pET20b,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导表达。对表达产物进行Ni-NTA柱亲和层析、酶切和除盐等纯化分析。结果：PCR扩增出约546 bp的特异性片段,测序分析表明已成功引入突变;所构建的pET20b-SUMO-FGF21［Arg59］ 重组阳性克隆经PCR与双酶切鉴定及测序分析,与预期结果一致;SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约31 500,且为可溶性;Western blotting分析证实：纯化后产物是成熟的FGF21［Arg59］ 突变体蛋白。结论：成功构建FGF21［Arg59］ 突变体基因,并经表达纯化得到成熟的FGF21［Arg59］ 突变体蛋白。     

ULBP3胞外段分子伴侣10融合蛋白的构建与表达

[目的] 研究ULBP3基因的功能,构建、表达ULBP3胞外段分子伴侣10重组融合蛋白。[方法] 将ULBP3胞外段cDNA连接在重组原核表达质粒pET28a-chaperonin 10中chaperonin 10基因的下游,构建chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Western blot鉴定。[结果] 酶切鉴定证实,chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体构建正确,该原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经筛选获得的阳性重组菌稳定表达chaperonin10-ULBP3重组融合蛋白。[结论] 成功表达了ULBP3胞外段重组融合蛋白,可进一步用于ULBP3功能实验研究。     

重组人可溶性白细胞介素4受体蛋白抑制大鼠哮喘

目的探讨重组可溶性白细胞介素-4受体（IL-4R）对大鼠哮喘模型的影响。方法根据Gen Bank公布的Homo sapiens（human）IL-4R基因序列（XM₀05255309）,合成srh IL-4R基因片段,将合成基因片段插入p ET-28a（+）构建重组表达载体p ET-28a（+）-srh IL-4R,酶切鉴定后,将载体转入表达菌株BL21（DE3）进行诱导表达重组蛋白srh IL-4R,并用SDS-PAGE和Western-blotting方法分析重组蛋白。提取重组蛋白干预哮喘模型大鼠,取肺组织进行病理切片观察。结果重组载体p ET-28a（+）-srh IL-4R酶切获得长度为500bp⁷50bp的目的片段,表达载体p ET-28a（+）-srh IL-4R转入表达菌BL21（DE3）后经IPTG诱导表达出的重组蛋白经SDS-PAGE和Westernblotting方法可见重组蛋白分子量约为25k Da;重组人可溶性IL-4R蛋白干预哮喘大鼠可见肺组织炎细胞数量较模型组明显减少。结论 srh IL-4R防治哮喘具有一定作用。     

猪2型圆环病毒原核表达产物的免疫原性测定

目的检测猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组原核表达产物的免疫原性。方法根据PCV2JXL株序列(GenBank登录号AY491310),设计合成引物,利用多聚酶链式反应(PCR)从含有PCV2接种猪肾细胞PK15中扩增了Cap蛋白的氨基端片段(737-421nt),克隆入上游带有谷光苷肽-S-转移酶的原核表达载体pGEX-6p-1中,获得重组质粒pGEX-PCV737-421。PCV2Cap蛋白羧基端(426-37nt)和Rep蛋白已在过去的研究中分别融合表达。利用IPTG对3种重组大肠杆菌BL21进行诱导,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)以及对PCV2阳性猪多抗血清的蛋白免疫印迹试验,在此基础上,将3种SDS-PAGE分离粗纯的重组表达产物碾碎后分别免疫BALB/c小鼠,用获得的抗鼠血清与PCV2病毒感染PK15细胞做间接免疫荧光抗体试验(IFA)。结果PCV2Cap蛋白的氨基端片段能在大肠杆菌中表达,且Cap蛋白羧基端和Rep蛋白的原核表达产物都能在免疫印迹试验中被PCV2阳性猪血清检测出特异性条带,重组蛋白免疫鼠血清可在IFA试验中观察到特异性的荧光分布,即检测到培养细胞中的病毒抗原。结论PCV2全基因组都可以用原核系统高效表达,且表达产物具有免疫原性。     

NP9蛋白的原核表达及纯化

目的构建表达人NP9融合蛋白的重组体并进行融合蛋白的原核表达及NP9蛋白的分离和纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）得到NP9基因的编码区序列，克隆到原核表达载体pGEX-6P-3上构建重组NP9原核表达质粒。转化大肠杆菌后通过SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定融合蛋白表达。使用GSTFF层析柱分离纯化NP9蛋白。结果得到序列正确的NP9基因及重组原核表达质粒pGEX-6P-3-Np9，SDS-PAGE电泳和Western blotting证实重组质粒能够在大肠杆菌内受IPTG诱导表达，层析分离得到分子量为大约14kDa单一的NP9蛋白。结论成功构建了表达NP9融合蛋白的原核表达载体，该栽体能在细菌内表达出GST—NP9融合蛋白．有效分离得到NP9蛋白．     

Bcr-Abl酪氨酸蛋白激酶域及其突变体的构建和表达

目的:制备Bcr-Abl激酶域及其突变体-His的重组蛋白. 方法:用PCR方法从含有Bcr-Abl全长的质粒pGD210中扩增出Bcr-Abl激酶域片段,再通过重组PCR技术获得激酶域的几个主要突变体(T315I,Y253F,E255K,E255V),测序正确后将其克隆到原核表达载体pET-32a中,构建表达激酶域片段和His标签融合表达的载体,IPTG诱导表达,得到的融合蛋白用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖进行亲和层析纯化. 结果:成功得到了Bcr-Abl激酶域及其突变体序列,经序列分析证实后将重组质粒转入BL-21进行表达. 结论: 通过重组PCR技术获得了野生型激酶域及其突变体蛋白. 融合蛋白表达在包涵体,占菌体总蛋白的70%以上. 经Ni-NTA镍珠纯化后,纯度在95%以上.     

构建人乳头瘤病毒关键基因的原核重组载体

目的构建HPV16 E6／E7关键基因的原核载体pET-32（＋）-E6／E7并将其转到大肠杆菌BL-21（DE3）中诱导表达，最后获得E6／E7基因表达产物。方法用PCR方法从含有HPV16全基因序列的质粒中扩增E6／E7基因，将E6／E7基因连接到pET-32a（＋）质粒上，并转到大肠杆菌BL21（DE3）中。最后检测E6／E7基因。结果获得重组后的载体pET-32（＋）-E6／E7。结论成功构建表达了含有E6E7的原核重组载体，并在大肠杆菌中表达。