重组人可溶性白细胞介素-4受体蛋白抑制大鼠哮喘研究

目的探讨重组可溶性白细胞介素-4受体(IL-4R)对大鼠哮喘模型的影响。方法根据Gen Bank公布的Homo sapiens(human)IL-4R基因序列(XM_005255309),合成srh IL-4R基因片段,将合成基因片段插入p ET-28a(+)构建重组表达载体p ET-28a(+)-srh IL-4R,酶切鉴定后,将载体转入表达菌株BL21(DE3)进行诱导表达重组蛋白srh IL-4R,并用SDS-PAGE和Western-blotting方法分析重组蛋白。提取重组蛋白干预哮喘模型大鼠,取肺组织进行病理切片观察。结果重组载体p ET-28a(+)-srh IL-4R酶切获得长度为500bp~750bp的目的片段,表达载体p ET-28a(+)-srh IL-4R转入表达菌BL21(DE3)后经IPTG诱导表达出的重组蛋白经SDS-PAGE和Westernblotting方法可见重组蛋白分子量约为25k Da;重组人可溶性IL-4R蛋白干预哮喘大鼠可见肺组织炎细胞数量较模型组明显减少。结论 srh IL-4R防治哮喘具有一定作用。     

乙脑病毒 E蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定

目的:构建乙脑病毒(JEV)E蛋白重组载体并在原核细胞BL21(DE3)中表达. 方法:采用RT-PCR扩增片段,定向克隆入pET28a( )中;重组载体pET28a-6His-E转化BL21(DE3),通过酶切、SDS-PAGE和Western Blotting检测其载体构建和蛋白表达;表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化. 结果:构建得到原核融合重组载体pET28a-6His-E;诱导后表达得到6His-E融合蛋白,纯化得到表达产物并进行了初步的鉴定. 结论:表达并纯化得到JEV E蛋白原核表达产物.     

人胰岛素样生长因子前体基因的重组、表达及其蛋白纯化

目的：构建含有人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor-1，hIGF-1）前体编码全长cDNA的重组载体，使其在E-coli BL21（DE3）中表达，并对此表达菌株所表达的重组蛋白进行纯化，同时探讨其抗原性及应用价值。方法：采用PCR法，扩增编码hIGF-1前体cDNA的片段，通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到pET32a（＋）／hIGF-1重组载体，然后将其转化入BL21（DE3）中，经IPrG诱导后表达的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化，并用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果：重组质粒pET32a（＋）／hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。BL21（DE3）表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后显示．其表达量占细菌总蛋白量的25％左右．该重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后其纯度高达90％以上。Western blot结果显示非常清晰的免疫印迹条带，表明此重组蛋白具有免疫学特异性。结论：pET32a（＋）／hIGF-1重组载体构建成功，并能够高效表达。     

刚地弓形虫肌动蛋白profilin的原核表达和纯化

目的：探讨刚地弓形虫肌动蛋白profilin （TgPRF）的原核表达体系和纯化条件,为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究提供依据。方法：以弓形虫RH株速殖子的cDNA为模板,采用一对特定的引物扩增TgPRF基因的编码区。PCR产物双酶切后克隆入pET28a （+）载体中。重组的pET28a （+）-TgPRF质粒转化E.coli DH5α感受态细胞。双酶切鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）表达菌,经IPTG诱导表达4 h,SDS-PAGE法检测TgPRF蛋白的表达,Western blotting法检测重组蛋白His-prolilin的表达。结果：PCR扩增产物长度为492 bp。经双酶切和测序,重组质粒pET28a-TgPRF连接产物构建成功。SDS-PAGE检测,目的蛋白在超声菌液的上清中表达。经Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化,获得纯化的TgPRF蛋白（纯度>90%）。Western blotting检测,重组TgPRF蛋白能被Anti-His抗体识别。结论：成功构建重组质粒pET28a-TgPRF,并实现可溶性原核表达。     

人脑胶质瘤特异抗原肽白介素-13 α 2受体重组表达质粒的构建

目的：构建白介素-13α2受体（IL-13Rα2）重组表达质粒,为检测IL-13Rα2抗原肽的表达奠定实验基础。方法：利用RT-PCR法从U251胶质瘤细胞株中获得IL-13Rα2目的基因,并与克隆质粒pMD19SimpleT载体连接转入DH5α菌克隆,用XhoI和HindIII将目的基因从克隆质粒上切下并与同样双酶切后的表达质粒pET-28a连接,转入BL21（DE3）菌,提取重组质粒进行酶切及测序鉴定。结果：目的基因IL-13Rα2与表达质粒pET-28a连接,成功构建pET-28a-IL-13Rα2重组质粒。结论：IL-13Rα2目的基因能经RT-PCR法获得,并能成功与表达质粒连接,构建pET-28a-IL-13Rα2重组质粒,为今后检测IL-13Rα2抗原肽的表达以及利用其来免疫治疗胶质瘤提供了良好的实验基础及理论依据。     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的：构建人CIDE-3基因的原核表达载体，并在E．coli BL21（DE3）中表达．方法：提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA，经RT—PCR扩增人CIDE-3基因片段，并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中，构建重组质粒pET28a（＋）-CIDE-3.经限制性内切酶Bam H I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后，转化E．coli BL21（DE3），经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白．     

犬α干扰素基因的密码子优化及高效表达

根据密码子优化原则,利用重组PCR方法扩增犬α干扰素基因,将测序正确的基因分别克隆于三种原核表达载体pET22b（＋）、pET24b（＋）和pET28b（＋）中。再将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表明,目的蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为25 kDa;其中,pET22b（＋）载体的表达量较高,约占总蛋白的50%-60%。     

8R-MUC1核心肽融合蛋白的原核表达及纯化

目的：构建蛋白质转导结构域8个精氨酸聚合体（8R）与MUC1核心肽融合蛋白的原核表达载体,并表达、纯化出具有生物学活性的8R-MUC1核心肽融合蛋白。 方法：以PCR法从HSP65-MUC1-pET28a质粒中钓取MUC1核心肽2个重复序列片段,连入pMD18-T载体,然后用酶切、连接的方法从T载体上获得MUC1核心肽6重复序列片段(MUCPT),将其克隆入含8R的pET26b⁺原核表达载体中构建8R与MUCPT融合蛋白（8R-MUCPT）表达载体。用IPTG诱导转化8R-MUCPT表达载体的大肠杆菌BL21(DE3),并以镍螯合层析法纯化8R-MUCPT融合蛋白。 结果：构建了8R与MUC1核心肽6个重复序列片段的融合蛋白原核表达载体8R-MUCPT-pET26b⁺,并在BL21(DE3)中表达了8R-MUCPT融合蛋白,经镍螯合层析获得纯度为95.5%的8R-MUC1核心肽融合蛋白。 结论：构建了8R-MUC1核心肽融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化出具有生物学活性的融合蛋白。     

猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的克隆与高效可溶性原核表达

目的克隆猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因,并进行高效可溶性原核表达。方法利用PT-PCR从猪囊尾蚴中获得cC1编码基因,T-A克隆后,将cC1插入原核表达载体pET28a中,经酶切、测序鉴定后将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达并优化表达条件,表达的融合蛋白Ni+-亲和层析柱纯化后经快速液相蛋白层析分离系统检测其纯度。采用SDS-PAGE和Western-blotting对目的蛋白进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出的片段长度为1056bp,构建的重组表达质粒经PCR、酶切验证,和预期的结果一致,测序鉴定与Genbank中cC1基因相比于423位存在1个同义突变。转化有重组质粒的E. coli BL21(DE3)经过0.05mmol/LIPTG 37℃诱导6h高效表达了占菌体蛋白总量60%的可为囊虫病患者血清识别的相对分子质量约为40000的可溶性融合蛋白,经Ni+-亲和层析柱纯化后纯度达94%。结论成功克隆并高效可溶性原核表达了猪囊尾蚴期特异性抗原cC1,为其进一步研究和应用奠定了基础。     

IL-32原核表达载体的构建及表达

目的 构建人IL-32原核表达载体,并进行初步诱导表达.方法 PCR扩增IL-32基因并将其与原核表达质粒pET32a(+)连接,重组pET32a- IL-32经PCR、酶切及测序鉴定后转入表达菌株BL21(DE3)进行融合蛋白的少量诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目的蛋白表达及水平.结果 含有重组质粒的表达菌株经IPTG诱导后获得高效表达,融合蛋白主要存在于包涵体中,重组蛋白表达水平占总蛋白的27.5%;Western Blotting分析表明该蛋白可与特异性抗体发生结合.结论 构建了人IL-32基因的原核表达载体,获得IL-32融合蛋白.     

小鼠IL-13Rα2胞外区基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆并在原核表达载体pET-28a中表达小鼠IL-13受体α2(sIL-13Rα2)胞外区基因。方法利用小鼠3T3细胞总RNA,逆转录为cDNA,设计引物,常规PCR法扩增出小鼠sIL-13Rα2基因,将PCR产物克隆入pMD18-T载体,经双酶切及测序鉴定后,再亚克隆入pET-28a,构建重组质粒pET-28a/sIL-13Rα2,并转化到大肠杆菌BL21感受态细胞。IPTG诱导表达后表达产物经Western blot鉴定。结果PCR扩增产物与预期大小相符合,重组质粒经双酶切鉴定及基因序列测定表明构建正确;sIL-13Rα2蛋白表达以包涵体形式存在,可与山羊抗小鼠sIL-13Rα2单克隆抗体发生特异性反应,相对分子质量约为36 ku。结论成功原核表达sIL-13Rα2基因,为进一步探讨sIL-13Rα2在血吸虫病肝纤维化过程中的调节作用奠定了基础。     

hPSF蛋白的原核表达质粒的构建及分析鉴定

目的:构建hPSF蛋白原核表达质粒,在体外观察其与GAGE6调控区结合现象。方法:从人成纤维细胞中提取总RNA,利用hPSF特异性引物通过RT-PCR方法扩增hPSF cDNA编码序列,克隆入pET-28a载体中,构建重组载体pET-28-hPSF。将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达,通过SDS-PAGE和免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果:酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;SDS-PAGE分析在相对分子质量约100kD处出现了1条蛋白条带,免疫印迹结果显示,所构建的重组载体可在大肠杆菌中高效表达hPSF蛋白。结论:成功构建了hPSF原核表达载体,并能够在大肠埃希菌中有效表达hPSF,为进一步研究hPSF的生物学作用奠定了基础。     

人IκBα基因的克隆和原核表达

目的:构建人类IκBα基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,为研究IκBα基因的功能奠定基础。方法:从cDNA文库获取目的基因,经PCR扩增目的片段IκBα;利用分子克隆技术构建原核表达质粒;转化入大肠杆菌BL21(DE3),优化诱导表达条件,进行纯化,获得目的蛋白。结果:成功构建pET-28a-IκBα重组表达质粒;经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳显示:IκBα在pET-28a-IκBα表达载体中获得表达量较高的融合蛋白,主要以上清形式存在。结论:成功表达并纯化获得了高纯度的IκBα蛋白。     

hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的: 构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。 方法: 以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。 结果: 经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L^-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。 结论: 成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。     

利用pET-29b载体进行葡激酶基因表达与其产物的亲和纯化

目的：探讨6聚组氨酸序列与葡激酶基因序列融合表达及其表达产物的纯化方法。 方法：将葡激酶的cDNA序列连入pET-29b质粒,转入E.coli BL21（DE3）进行表达。 应用镍金属离子螯合层析及凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。 结果：6聚组氨酸与葡激酶的可溶性融合蛋白在BL21（DE3）中的表达量约占菌体可溶性蛋白总量的25％;螯合层析纯化后其纯度可达90％以上;再应用Sephacryl S-200HR可使其纯度提高到98％以上;测得其比活性为5.0×10⁴ AU•mg^-1。 结论：利用pET-29b载体成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的亲和纯化。     

重组Trx-ApoO融合蛋白的构建与表达

目的:构建人载脂蛋白O (apolipoprotein O, ApoO)表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原Trx-ApoO融合蛋白.方法:以人类肝脏cDNA文库为模板,聚合酶链反应(PCR) 法扩增ApoO DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-32a (+)相应位点构建重组质粒并转化E.coli B...     

融合蛋白表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建人类regucalc in重组原核表达载体。方法用RT-PCR的方法从人类肝癌细胞系HepG2中扩增出regucalc in基因cDNA序列,应用T克隆载体及pET-32 a(+)表达载体后,将质粒转化进入原核表达菌株进行表达。结果表达产物经SDS-PAGE电泳分析后,在45 000处有一明显表达条带,与理论结果相符。结论成功构建融合表达载体Pet-regucalc in,并在原核细胞中表达出人类regucalc in-H is融合蛋白。     

人可溶性白细胞介素—6受体基因在昆虫细胞内的克隆与表达

目的：在昆虫细胞中表达人可溶性白细胞介素－6受体（sIL-6R)基因。方法：将人sIL-6R cDNA克隆至杆状病毒转移载体pAcGP67B中,再将重 组转移载体质粒与野生病毒AcNPV DNA共转染昆虫细胞sf9;经同源重组后,以终点稀释和斑点杂交法筛选重组杆状病毒;采用空斑分析法纯化重组的病毒,然后以纯化的重组病毒感染昆虫细胞Sf9。结果：斑点杂交实验证实,纯化得到的重组病毒含有人sIL-6R基因,SDS－PAGE结果显示,表达产物sIL-6R相对分子质量为47000左右,Western blot和受体配基结合实验表明,表达产物具有与其配基特异性地结合的能力,结论,杆状病毒－昆虫细胞能分泌表达sIL-6R,表达产物具有免疫活性和生物活性。     

人巨噬细胞金属弹力酶催化域基因的克隆及表达

目的克隆人巨噬细胞金属弹力酶催化域（HMEcd）基因,构建原核表达质粒,在大肠杆菌中表达HMEcd基因融合蛋白。方法用RT-PCR方法提取人胃癌组织总RNA并扩增出HMEcd cDNA,克隆入pMD18-T载体,构建克隆载体pMD18-T-HM Ecd,双酶切鉴定及DNA测序正确后再将HMEcd cDNA亚克隆至pET-28a（＋）载体,构建原核表达载体pET-28a（＋）-HM Ecd,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果RT-PCR获得预期的HMEcd cDNA,双酶切鉴定及DNA测序证实将HM Ecd基因分别正确插入克隆载体和原核表达载体中,SDS-PAGE及Western blotting鉴定证实表达出HMEcd融合蛋白。结论成功表达出HMEcd基因融合蛋白,为进一步功能实验研究奠定基础。     

人肥胖基因的克隆与原核表达载体的构建

目的：克隆人肥胖基因瘦素蛋白（leptin）编码区cDNA序列，并构建其原核表达载体。 方法：在人体脂肪组织中提取mRNA，利用RT-PCR扩增人肥胖基因，将其插入pMD18-T载体，经双酶切、鉴定后将肥胖基因片段亚克隆入pET-28a表达载体，提取质粒。将阳性重组质粒转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导肥胖基因表达产物,以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测产物蛋白。 结果：经测序证实获得的肥胖基因序列与相关文献报道一致，其表达产物的相对分子质量约为20 000。 结论：利用pMD18-T克隆载体和pET-28a表达载体可以有效地在原核生物中表达重组人类瘦素蛋白。