人乳头状瘤病毒16型E6基因转染人外周血树突状细胞的体内抗宫颈癌研究

目的：观察人乳头状瘤病毒（HPV）16型E6基因转染人外周血来源的树突状细胞（DC）制备的疫苗，在严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠体内对人宫颈癌（CaSki）细胞的免疫治疗和免疫保护作用。方法：细胞因子扩增人外周血DC，脂质体（Lipofeetamine）转染HPV16E6制备HPV16E6-DC疫苗。进行致瘤性检测，并观察在SCID小鼠体内疫苗抗人CaSki细胞的免疫保护及对荷瘤小鼠的免疫治疗作用。结果：①ttPV16E6-DC疫苗接种于小鼠体内未见肿瘤形成，脾、肺、肝和肾等器官未出现肿瘤病变。②在免疫治疗组，用HPV16E6．DC疫苗治疗的荷瘤小鼠，肿瘤生长速度较对照组慢，瘤体积小于对照组，瘤重量较对照组明显减轻（P〈0．01）。③在免疫保护组，经HPV16E6-DC疫苗免疫的小鼠，CaSki细胞攻击后，肿瘤潜伏期较对照组明显延长（P〈0．01），瘤体积明显小于对照组，瘤重量也轻于对照组（P〈0．01）。结论：人外周血来源的HPV16E6．I）12疫苗无体内致瘤性。且能在一定程度上抑制人CaSki细胞在SCID小鼠体内的生长，抵抗肿瘤细胞的攻击，对机体具有相应的抗肿瘤免疫治疗及保护作用。     

人乳头瘤病毒16 E7 (HPV16E7)逆转录病毒载体的构建

目的 构建人乳头瘤病毒16型E7基因片段（HPV16E7）的逆转病毒载体。方法 PCR扩增HPV16cDNA全长的E7片段，并用酶切，连接等方法将HPV16E7亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN上，然后再用酶切，测序进行鉴定，通过Genbank的数据库分析软件对PV16E7进行同源性分析。结果 经酶切分析，测序证明，从HPV16cDNA克隆的300bp的HPV16E7与逆转录病毒载体发生了基因重组，HPV16E7基因片段与数据库中的原HPV16cDNA的E7有高度的同源怀。结论 构建了含HPV16E7的逆转录病毒载体，为人关节软骨细胞的基因转染打下了基础。     

人乳头状瘤病毒感染及端粒酶hTERT表达与宫颈癌关系的研究进展

人乳头状瘤病毒(HPV)感染和人子宫颈癌的发生密切相关,HPV致癌作用的主要基因为E6、E7.E6蛋白能诱导端粒酶的表达,其机制是激活了端粒酶催化亚基hTERT的转录活性.端粒酶激活是HPV感染后导致宫颈上皮瘤变和宫颈癌发生的关键性步骤.现就HPV感染及端粒酶hTERT在宫颈癌形成中的协同作用进行综述.     

人乳头瘤病毒16型E2/E6癌基因与宫颈癌关系的研究

目的探讨人乳头瘤病毒16型(HPV16)E2/E6癌基因在宫颈癌发生中的作用。方法采用以医院为基础的1∶1配比病例对照研究,应用热启动PCR法检测经病理诊断确诊的74例宫颈鳞癌新发病例,及同期就诊的74例宫颈良性肿瘤患者的高危型HPV16 E2/E6癌基因的状况。结果病例组HPV16 E2、E6阳性率(41.89%,52.70%)高于对照组(17.57%,21.62%),差别有统计学意义,OR分别为3.250(1.471-7.178)和3.875(1.824-8.233);病例组HPV16 E2缺失率较对照组略高。结论宫颈癌的发生与HPV感染,特别是高危型HPV16的感染密切相关;HPV16 E2基因缺失、E6基因高阳性率在宫颈癌的发生发展中起重要作用。     

外源性HPV16 E7癌基因表达对宫颈癌HeLa细胞Cyclin E表达的影响

目的研究重组腺病毒介导人乳头状瘤病毒（HPV）16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期蛋白E（Cyclin E）表达的影响,探讨HPV16 E7癌基因以及Cyclin E在宫颈癌发生发展中的作用。方法用含有HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞。免疫荧光染色后激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）检测感染前后Cyclin E表达的差异。结果HPV16 E7感染后Cyclin E表达较感染前明显增加。结论HPV16 E7基因的表达促进Cyclin E的表达,对宫颈肿瘤细胞有增殖促进的作用。     

HPV58型E7基因重组痘苗疫苗保护作用的实验研究

目的：制备含人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗，并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果。方法：利用PCR方法扩增HPV58 E7 DNA片段，在消除其转化活性的基础上，构建表达HPV58 E7的重组痘苗病毒疫苗并免疫小鼠，观察该疫苗对E7阳性肿瘤细胞生长的抑制作用，体外诱导、测定细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）活性。结果：经定点突变的HPV58 E7基因转化活性显著降低，用突变的E7基因构建的重组痘苗病毒免疫小鼠后，能抑制E7阳性肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期；免疫小鼠脾淋巴细胞体外可诱导产生针对E7阳性肿瘤的CTL细胞。结论：在消除转化活性的基础上，HPV58E7可用于治疗与HPV58感染有关的肿瘤。     

肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌的表达及其与HPV感染的关系

目的探讨肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中的蛋白表达以及人乳头瘤病毒(HPV)16E6、E7和HPV18E6/E7感染对其表达的影响。方法采用免疫组化SP法检测70例浸润性宫颈癌、15例原位癌、20例正常宫颈组织中KAI1蛋白的表达,采用PCR扩增-琼脂糖凝胶电泳法检测浸润性宫颈癌组织中HPV16E6、E7和HPV18E6/E7的DNA状况。结果宫颈浸润癌及原位癌组织中的KAI1蛋白表达与正常宫颈上皮中的表达相比明显下调(P<0.05),原位癌与浸润癌中的表达差异无统计学意义;HPV16E6、E7和HPV18E6/E7在浸润性宫颈癌中的阳性率分别为67.1%、54.3%和12.9%,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染与宫颈癌中的KAI1蛋白表达无相关性。结论肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中呈下调表达,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染不影响其表达。     

人乳头瘤病毒早期癌蛋白E6/E7稳定表达细胞系的构建及其对Rab12表达的影响

目的 探究人乳头瘤病毒(HPV)编码的早期癌蛋白E6/E7对小GTP酶蛋白Rab12表达的影响。 方法 利用逆转录病毒包装系统获得含pBabe-Vector质粒和pBabe-16E7质粒的高滴度病毒颗粒,感染细胞,并用嘌呤霉素筛选获得稳定表达HPV16E7的UMSCC 10A-16E7细胞系,Western blotting检测E7相关蛋白p53和E2F1的表达变化,比较UMSCC 10A-Vector细胞系和UMSCC 10A-16E7细胞系的Rab12蛋白表达水平。用同样方法在HaCaT、RPE1细胞系中进一步验证。用siRNA干扰SiHa、Caski细胞(HPV-16阳性的宫颈癌细胞)中16E6/E7及HeLa细胞(HPV-18阳性的宫颈癌细胞)中18E6/E7的表达,通过Western blotting比较siRNA干扰前后E6和E7相关蛋白(E2F1、p53和Rab12)的表达差异。 结果 利用逆转录病毒包装系统成功构建稳定表达的细胞系,过表达E6/E7的细胞系中Rab12表达升高,干扰E6/E7的细胞系中Rab12的表达降低。 结论 HPV编码的早期癌蛋白E6/E7可调控Rab12的表达。     

人乳头状瘤病毒18E6E7和TPA协同诱发人胚食管上皮恶性转化的研究

提要研究病毒和促癌物在食管癌形成的作用，用人胚食管上度培养和HPV18E6E7AAV感染。培养细胞分二组，SHEEC1组培养基中加入TPA(5ng/mL)4周。对照组SHEE未加TPA。细胞转化的形态，细胞周期,软琼脂培养和裸鼠致瘤性等指标皆证明SHEEC1已恶性转化。E6E7基因在FISH和PCR检测，两组细胞核皆呈阳性。结论：人胚食管上皮可用HPV18E6E7和TPA在体外协同诱导细胞恶性转化。人乳头状瘤病毒18E6E7和TPA协同诱发人胚食管上皮恶性转化的研究@沈忠英$汕头大学医学院肿瘤病理研究室@蔡维佳$汕头大学医学院肿瘤病理研究室@沈健$汕头大…     

人乳头状病毒16/18及E6、E7基因在宫颈癌组织中的表达

目的探讨高危型人乳头状病毒(HPV)16／18及其E6、E7基因在宫颈癌诊断中的价值。方法对104例宫颈新鲜组织(正常对照16例，轻度宫颈增生18例，中度宫颈增生20例，重度宫颈增生20例，宫颈癌30例)进行研究，荧光定量PCR用于HPV16／18的检测，PCR用于E6、E7基因的检测。结果正常对照组：HPV16／18阳性1例，E6、E7基因无阳性；轻度宫颈增生：HPV16／18阳性2例，R、E7基因无阳性；中度宫颈增生：HPV16／18阳性2例，E6、E7基因阳性1例；重度宫颈增生：HPV16／18阳性6例，R、E7基因阳性2例；浸润型宫颈癌：HPV16／18阳性16例，E6、E7基因阳性7例。结论宫颈癌组织HPV16／18和E6、E7基因阳性率明显高于其它子宫颈增生者，并随子宫颈增生程度逐渐增加。     

转染人乳头瘤病毒的宫颈癌U14移植同系小鼠后的生长特性和转移规律

目的 :探讨转染人乳头瘤病毒 (HPV)的小鼠宫颈癌U1 4移植同系小鼠后生长特性和转移规律。方法 :用电穿孔法及阳离子脂质体将HPV 1 6型的早期基因E6 ,E7分别转染小鼠宫颈癌U1 4,筛选、鉴定表达E6 ,E7的转化细胞即E6 +U1 4,E7+U1 4,然后分别经皮下和腹腔移植于同系小鼠 ,观察其生长特性和转移规律。结果 :皮下移植野生型U1 4,E6 +U1 4及E7+U1 4后 ,出瘤时间分别为 5～ 7d ,1 1～ 1 4d及 8～ 1 0d (P <0 .0 5 ) ;平均生存期分别为 2 9d ,43 .3d及 3 5d ;淋巴转移率分别为 90 % ,3 0 %及 40 % ;肺转移率分别为 6 0 % ,1 0 %及 2 0 %。腹腔内移植后 ,荷瘤小鼠平均寿命分别为 1 4.2d ,2 0 .6d及 1 8.3d ;未发现淋巴和肺转移。结论 :转染HPV的小鼠宫颈癌U1 4移植同系小鼠后 ,显示出与移植野生型不同的生长特性和转移规律。该模型为研究以HPVE6 ,E7为靶的免疫或其他方法治疗宫颈癌提供了有价值的动物模型。     

转染人乳头瘤病毒的宫颈癌U14移植同系小鼠后的生长特征和转移规律

OBJECTIVE: To investigate the growth behavior and metastatic pattern of murine cervix cancer U14 transfected with human papillomavirus(HPV) in inbred 615-strain mouse. METHODS: We transfected HPV 16 E6 and E7 genes into mouse cervix carcinoma cell strain NO. 14(U14) by electroporation and liposome, respectively. The transfectants were selected by G418, and several high-expressed HPV16 E6 and E7 clonal cell lines (E6+ U14, E7+ U14) were detected by PCR and by immunohistochemistry. We transplanted those cells into inbred 615-strain mice both subcutaneously and intraperitoneally to observe the growth behavior and metastasis of them. RESULTS: The durations of tumor appearance were 5-7 d, 11-14 d, and 8-10 d after having been transplanted subcutaneously with wild type U14, E6+ U14, and E7+ U14, respectively(P < 0.05). The mean survival times of mice were 29 d, 43 d, and 35 d, respectively. Metastasis could be found both in lymph nodes (90%, 30%, and 40%, respectively) and lungs (60%, 10%, and 20%, respectively). After intraperitoneal inoculation, the mean survival durations of mice were 14.2 d, 20.6 d and 18.3 d. We could not find metastasis both in lymph nodes and lungs. CONCLUSION: Murine cervix cancer U14 cells transfected with HPV16 E6 and E7 have different growth behavior and metastatic patterns after transplanted in inbred mice, which provide useful models for studying their immunotherapy or other strategies for cervical cancer with E6 and E7 as a target.     

人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应

目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫。51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体。用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平。结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用。结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16DNA疫苗的协同因子具有重要价值。     

沉默HPV16 E6基因对人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 采用RNA干扰抑制人宫颈癌CaSki细胞裸鼠移植瘤中人乳头瘤病毒(human papillomavirus-16,HPV16)E6基因的表达,观察对裸鼠移植瘤的抑制作用.方法 将HPV16 E6特异性的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)真核表达载体转染到人宫颈癌细胞株CaSki细胞中,经G418筛选,RT-PCR检测E6基因的表达;将细胞接种到BALB/c裸鼠背部皮下,同时将该质粒注射到人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的裸鼠中,观察肿瘤出现时间及体积变化;观察肿瘤组织的病理改变.结果 成功筛选到持续表达E6 siRNA的CaSki细胞,经RT-PCR检测该细胞中HPV16 E6基因表达降低;裸鼠成瘤实验结果显示,处理后的CaSki细胞成瘤能力明显降低,抑瘤率为71.4%;注射质粒进行基因治疗后,裸鼠肿瘤生长受到抑制,肿瘤的体积与质量明显低于CaSki细胞组,差异具有显著性(P＜0.05).病理检查结果显示,经pGensil-CH2处理的肿瘤生长不佳,细胞分裂像少见,组织内有较多坏死区域.结论 沉默CaSki细胞中HPV16 E6基因的表达能明显降低宫癌细胞的成瘤作用.     

利用反义技术抑制人乳头瘤病毒18 E6/E7的表达及其对宫颈癌HeLa细胞增殖凋亡的影响

目的 构建人乳头瘤病毒（HPV）18型E6／E7反义荧光真核表达载体,研究其对宫颈癌HeLa细胞增殖凋亡的影响。方法 以PCR法扩增HPV18型E6／E7区716bp片段并反向克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C1,构建重组体pEGFP-HPV18E6E7as（EGFP-18AS）并转染人宫颈癌HeLa细胞。利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western印迹技术检测转染后E6、E7基因在mRNA和蛋白水平的变化;用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测转染后细胞的的增殖活性;用流式细胞仪检测转染后细胞的凋亡率;荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态学改变。结果 转染EGFP-18AS重组体后,HeLa细胞中E6、E7基因的mRNA表达和蛋白合成均明显下调;细胞增殖受到抑制;流式显示细胞G1期明显阻滞;同时在荧光显微镜下经Hoechst染色凋亡细胞出现染色质凝集、边集、碎裂等形态学改变。结论 重组质粒pEGFP—HPV18E6E7as能有效地抑制人宫颈癌HeLa细胞的生长和增殖,诱导其凋亡,证明了反义RNA技术的有效性,为宫颈癌的基因治疗提供了一种新的可能的途径。     

Chimeric virus-like particles of the human papillomavirus type 16 (HPV 16) as a prophylactic and therapeutic vaccine

Infection by certain human papillomaviruses (HPV), most notably HPV types 16 and 18, is the major risk factor for cervical cancer. Worldwide, this disease represents the second most frequent malignant tumor in women; thus, there is urgent need for efficient therapy and prevention. The natural history of cervical cancer and its precursors (cervical intraepithelial neoplasias), as well as animal experiments, strongly suggest that the immune system controls both the primary infection (by neutralizing antibodies directed against the major structural protein L1) and the progression of the disease (via cytotoxic T cells specific for the viral oncoproteins expressed in transformed cells, e.g., E7). By the expression of an HPV 16 L1E7 fusion protein, we have generated chimeric virus-like particles (CVLP). Immunization of mice with CVLPs induces neutralizing antibodies directed against L1 virus-like particles (devoid of the E7 portion) and E7-specific T cells as measured in vitro. Vaccinated animals are protected against tumor growth following inoculation of syngeneic HPV 16-transformed cells. In addition, we observed a therapeutic effect of vaccination on pre-existing tumors. This data allowed us to conclude that CVLPs are suitable for prevention and therapy of HPV infection. A vaccine based on HPV 16 L1E7 CVLPs is currently under development.     

Increased expression of 70 kD heat shock protein in cultured primary human keratinocytes induced by human papillomavirus 16 E6/E7 gene

Background Heat shock protein 70 （HSP70） is expressed highly in epithelial tumours associated closely with human papillomavirus 16 （HPV16） infections. However, evidence about the direct relationship between HSP70 expression and HPVs infections are still lacking. In the present study, we examined the expression of HSP70 in keratinocytes introduced with HPV16 E6/E7 oncogenes. Methods Stable transfected cells were established by transfection of the plasmids pLXSN16E6/E7 into cultured primary keratinocytes and subsequently selected by plasmid specific selection antibiotic （G418） at the required concentration. The expression of HSP70 in pLXSN16E6/E7 transfected keratinocytes was determined by Western blot. The correlation of HSP70 expression and E6/E7 transfeetion was further confirmed by doubly labelled immunofluorescent staining. Results Compared to non-transfected keratinocytes, there was a significant trend for higher levels of HSP70 in pLXSN16E6/E7 transfected keratinocytes. Doubly labelled immunofluorescent staining experiment showed that the co-localization of HPV16 E6/E7 and HSP70 in transfeeted keratinoeytes was observed and increased expression of HSP70 was strongly associated with the transfection of HPV16 E6/E7. Conclusions Our studies demonstrated increased levels of HSP70 proteins in keratinocytes stably transfected by HPV16 E6/E7 oncogenes. It suggests that the expression of HSP70 is modulated by HPV16 E6/E7 proteins, which may be involved in HPV16 E6/E7 induced immortalization.     

保妇康栓对人乳头状瘤病毒抑制作用的实验研究

目的:探讨中药制剂保妇康栓对人乳头状瘤病毒(HPV)16亚型的抑制作用。方法:以不同浓度的含保妇康栓培养基体外培养宫颈癌细胞系CaSki和宫颈永生化细胞H8,相差显微镜下观察活细胞形态学变化;采用四甲基偶氮唑蓝比色法以及流式细胞术技术检测不同浓度保妇康栓对细胞增殖的影响;应用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测人乳头状瘤病毒HPV16亚型E6E7的表达。结果:不同浓度的保妇康栓可以抑制细胞的增殖;在药物作用下,CaSki细胞G1期细胞增加(P<0.05),G2、S期细胞减少(P<0.05),CaSki细胞凋亡率高于对照组(P<0.05),而对H8细胞周期和凋亡率影响不明显;两种细胞HPV16E6E7基因片段mRNA表达均明显低于对照组(P<0.01)。结论:保妇康栓在体外抑制宫颈癌细胞系CaSki和宫颈永生化细胞H8增殖,其机制可能是通过抑制HPV16E6E7表达而抑制肿瘤细胞生长。     

人乳头状瘤病毒16型DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系的建立(英文)

目的建立人乳头状瘤病毒（HPv）16型DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系，确证HPv与喉癌的发生有无关系。方法采用脂质体介导法，将pSVHPV16DNA导入原代培养的人喉上皮细胞，继续培养、传代，取20代细胞，用PCR检测细胞是否含有病毒的特异片段，用免疫组化染色检测E6、E7蛋白的表达，用倒置显微镜、生长曲线、流式细胞仪、细胞角蛋白免疫组化染色、透射电镜及软琼脂克隆形成试验检测细胞的生物学特性。结果有3株细胞已连续培养传代超过20代，细胞含有HPV16DNA的特异片段并有E6、E7蛋白的表达，细胞呈锚着依赖性、接触抑制性单层平铺生长，生长曲线呈典型的“s”型，细胞增殖指数为48％，所有细胞均表达角蛋白，胞浆含张力原纤维，软琼脂培养克隆形成试验阴性。结论成功建立了HPV16DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系，为喉癌研究提供了新的理想模型，HPV16对人喉上皮有致癌作用，在喉癌组织标本中检测到的HPV16DNA必定在其多步癌变过程中发挥了重要作用。     

宫颈癌组织中HPV16 E6、E7蛋白水平与患者临床病理特征及预后的关系

目的 探究宫颈癌组织中16型人乳头瘤病毒E6蛋白（human papilloma virus type 16 E6 protein,HPV16 E6）、16型人乳头瘤病毒E7蛋白（human papilloma virus type 16 E6 protein,HPV16 E7）水平与患者临床病理特征及预后的关系。 方法 选取行宫颈癌根治术87例患者的肿瘤组织、癌旁组织、正常宫颈组织标本进行研究,采用免疫组织化学法检测组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达情况,并结合患者临床病理特征进行分析,采用Kaplan-Meier生存曲线比较患者3年生存情况,采用COX回归分析各项因素对患者预后的影响。 结果 免疫组化结果显示肿瘤组织中HPV16 E6、HPV16 E7阳性率高于癌旁组织和正常组织（P＜0.05）; HPV16 E6及HPV16 E7蛋白阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者（P＜0.05）;多因素分析显示HPV16 E6、HPV16 E7阳性是宫颈癌患者预后不良的独立危险因素（P＜0.05）。 结论 HPV16 E6、HPV16 E7蛋白在宫颈癌组织中阳性表达,与患者临床病理特征和预后相关,可能作为治疗宫颈癌的新靶点发挥作用。