靶向人乳头瘤病毒16型-E6的siRNA对宫颈癌肿瘤生长的影响

目的 研究靶向HPV16-E6的小分子干扰RNA抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的生长.方法 建立裸鼠宫颈癌模型,HPV16-E6 siRNA瘤体内多点注射观察肿瘤的生长情况,使用HE染色方法观察肿瘤组织细胞在pSiRNA或pCON治疗后的病理学改变;免疫组化采用SP法.结果 靶向HPV16-E6的小分子干扰RNA能显著抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的生长.结论 利用宫颈癌裸鼠移植瘤模型,证明靶向HPV16-E6的siRNA能够显著抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的生长.     

载体介导的RNAi技术抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达

目的 探讨HPV16E7特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞E7基因的抑制作用.方法 构建HPV16 E7特异性siRNA表达载体,利用脂质体转染CaSki细胞,以荧光定量RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白表达的影响.结果 3种表达载体P1、P2、P3均能抑制CaSki细胞E7基因mRNA和蛋白的表达,其中载体P1抑制作用最强,在转染后3周,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分别为92.86%和81.0%.结论 HPV16E7 siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达.     

RNA干涉抑制宫颈癌HPV16 E6基因的研究

目的采用RNA干涉（RNAi）技术干扰宫颈癌HPV16 E6基因转录，通过体外和体内实验了解其特异性抑制HPV16 E6基因的效率。方法设计合成针对HPV16 E6的小干扰RNA（siRNA），借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞，通过测定转染后不同时间点的细胞凋亡率、HPV16 E6mRNA及蛋白表达变化了解基因抑制的效率。体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型，将E6 siRNA直接注入瘤体，观察肿瘤体积的变化，肿瘤切片HPV16 E6免疫组化染色，观察肿瘤坏死和细胞的凋亡。结果HPV16 E6siRNA转染细胞后24h、48h、5d和9d时凋亡率分别为7．7％、11．8％、37．4％和12．6％。RT-PCR显示转染后24h、48h、5d和9d HPV16 E6 mRNA量减少了77％、83％、59％和41％。Western blot显示转染后的HPV16 E6蛋白表达在24h、48h、5d明显减少，9d时有所恢复；流式细胞仪HPV16 E6蛋白定量测定结果显示，转染后24h、48h、5d和9d蛋白表达抑制率分别为79．7％、80．4％、71．3％和57．4％。体内实验瘤内注射HPV16 E6 siRNA明显抑制肿瘤的生长，HPV16 E6蛋白表达明显受抑，肿瘤组织坏死和细胞凋亡增加，重复给药较单次给药效果更好。结论体内和体外实验均表明RNA干涉HPV16 E6基因的效果具有特异性和高效性。     

HPV-16 E6基因沉默对宫颈癌CaSki细胞的影响

目的: 研究特异性抑制HPV E6基因的表达对宫颈癌CaSki细胞的影响. 方法: 构建表达HPV-16 E6基因siRNA重组质粒,体外转染CaSki细胞后检测E6 mRNA表达变化及E6主要作用靶分子P53的蛋白变化;流式细胞术分析细胞周期. 结果: 特异RNAi表达质粒转染CaSki细胞后明显降低了E6 mRNA水平,且P53蛋白水平增高. 流式细胞仪测定发现细胞停滞在G0-G1期,细胞增殖受到抑制. 结论: 采用RNA干扰技术能沉默CaSki细胞中整合的HPV-16 E6基因的表达,使细胞中抑癌蛋白P53水平增高,导致肿瘤细胞生长停滞.     

带有HPV-16 E6/E7基因的树突状细胞疫苗对裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的抗肿瘤作用

目的：探索带有HPV-16 E6/E7基因的树突状细胞（dendritic cell,DC）疫苗对裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的抗肿瘤作用。方法：体外诱导培养C57BL/6小鼠骨髓的未成熟DC（immature DC,imDC）,将已经成功构建的携带人乳头状瘤病毒（human papillomavirus,HPV）-16 E6/E7基因的重组腺病毒感染imDC,Western blot检测E7蛋白的表达;构建裸鼠的人宫颈癌CaSki细胞移植瘤模型,应用DC疫苗诱导的BALB/c小鼠脾脏的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTL）处理后,观察裸鼠肿瘤体积变化,肿瘤长出第28天后处死裸鼠,小心剥下肿瘤组织,石蜡包埋,HE染色观察各组肿瘤的细胞形态,免疫组织化学技术法检测肿瘤组织中Bcl-2、Bax蛋白的表达情况。结果：成功培养出DC并制备出DC疫苗;第28天各组裸鼠肿瘤体积pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组与pAd-mock-DC-CTL-CaSki组、DC-CTL-CaSki组、CaSki组相比较,pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组裸鼠肿瘤体积最小（P<0.05）;免疫组化检测肿瘤组织中Bax蛋白的表达结果显示pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组最高,而CaSki组表达最低;免疫组化检测肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达结果显示pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组最低,而CaSki组表达最高。结论：带有HPV-16 E6/E7DC疫苗能够诱导CTL抑制裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的生长。     

表达HPV-16 E6基因siRNA真核载体的构建及体外转染效率鉴定

目的：采用RNA干扰技术选择性的沉默宫颈癌CaSki细胞株中HPV-16E6基因的表达。为观察HPV-16E6基因的小干扰片段能否在CaSki细胞特异性的抑制E6基因的表达，构建能在哺乳动物细胞中表达E6小干扰RNA的真核表达质粒，并观察其转染效率。方法：根据HPV-16E6基因序列，设计特异性的小干扰片段，并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1上，将其转染至CaSki细胞中，观察荧光表达，鉴定其转染效率：结果：通过酶切鉴定和序列测定，成功的构建二条表达小干扰RNA的质粒及其阴性对照质粒，并成功的转染到CaSki细胞株中，转染效率达到50％以上：结论：siRNA真核表达载体的构建及体外转染的成功为下一步研究奠定了良好的基础：     

特异性核酶对宫颈癌细胞系CaSki增殖与凋亡的影响

目的：研究特异性抗HPV 16E6核酶对宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响。方法：设计特异性切割HPV 16E6基因的核酶，构建抗HPV16E6核酶的真核表达质粒。以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSki细胞，命名为CaSki－R、CaSki－P细胞。点杂交检测核酶在细胞中的表达，Northern blotting检测CaSki、CaSki－R、CaSki－P3种细胞中E6基因的表达。测定3种细胞的生长曲线和软琼脂克隆形成率，并以皮下接种率法检测细胞在裸鼠体内的成瘤能力。流式细胞仪检测3种细胞的凋亡率，并测定c-myc、bcl-2、p53、fas、PCNA、C－erbB-2等基因的表达。结果：点杂交证实该核酶能在CaSki－R细胞中稳定表达，Northern blotting证实CaSki－R中表达E6较CaSki－P、CaSki明显降低，出现凋亡峰，S期、GWMS期细百分率下降；而CaSki－P细胞无此改变。CaSki－R细胞表达HPV16E6、C－myc、Bcl-2、PCNA、C－erbB-2蛋白明显减少，而p53表达明显增高；CaSki和CaSki－R细胞中Fas蛋白的表达相近。CaSki－P细胞中各基因的表达与CaSki细胞无显著差异。结论：抗HPV16E6核酶的导入能阻碍宫颈癌细胞增殖，诱导其凋亡，其原因可能在于病毒癌基因E6表达的降低，以及由此而引起的细胞内一系列基因表达的改变。     

RNA干扰抑制裸鼠皮下移植瘤中Livin基因表达的实验研究

目的:利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在裸鼠皮下移植瘤中抑制 Livin 基因表达,探讨 RNA 干扰用于胃癌治疗的可行性.方法:SGC-7901 细胞注射入裸鼠皮下,建立裸鼠皮下移植瘤的模型,设计靶向Livin基因的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),构建重组表达质粒 pTZU6+I-siRNA-Livin,并导入裸鼠皮下移植瘤中,在体内诱导RNAi,采用RT-PCR和免疫化学检测Livin基因表达,Western blot 检测 Bax 和B cl-2 改变.结果:重组质粒 pTZU6+1-siRNA-Livin 导入裸鼠皮下移植瘤后14 d 瘤体体积明显减小,Livin 的 mRNA 和蛋白表达均明显下调.结论:RNA 干扰明显抑制了靶基因 Livin 的表达及肿瘤细胞生长,可能与上调Bax的表达、下调 Bcl-2,从而诱导肿瘤细胞凋亡有关.     

敲低Fascin抑制宫颈癌细胞增殖及裸鼠的成瘤能力

目的研究敲低Fascin对宫颈癌细胞增殖及裸鼠成瘤能力的影响。方法Fascin siRNA慢病毒（干扰组）和阴性对照慢病 毒（阴性组）感染宫颈癌CaSki细胞,用qRT-PCR和Western blot方法检测Fascin mRNA以及蛋白表达水平评价干扰效果。MTT 方法测定Fascin 敲低对CaSki细胞增殖能力的影响。取对照组、阴性组、干扰组CaSki细胞接种至裸鼠皮下,建立裸鼠移植瘤模 型,测定移植瘤生长体积和质量,Western blot方法检测移植瘤组织中增殖细胞核抗原（PCNA）、survivin、细胞周期依赖性蛋白 激酶4（CDK4）、p21 蛋白水平。结果Fascin siRNA慢病毒感染后的CaSki 细胞中Fascin mRNA和蛋白水平低于没有感染的 CaSki细胞（P<0.05）。阴性对照慢病毒感染对CaSki细胞中Fascin mRNA和蛋白水平没有影响。敲低Fascin后的CaSki细胞增 殖能力明显降低（P<0.05）。干扰组CaSki接种的裸鼠移植瘤体积和质量也降低,移植瘤组织中PCNA、survivin、CDK4蛋白水平 降低,p21蛋白水平升高。阴性组CaSki细胞接种对细胞增殖、裸鼠成瘤能力及移植瘤中PCNA、survivin、CDK4、p21蛋白水平 没有影响。结论敲低Fascin 能够抑制宫颈癌细胞生长和裸鼠成瘤能力。     

RNA干扰技术抑制HPV16 E6基因表达对宫颈癌细胞株CaSki增殖的影响

目的观察HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)能否抑制宫颈癌细胞生长,并探讨其作用机理。方法化学合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,应用细胞计数的方法测定细胞生长曲线、活细胞率及细胞生长抑制率。运用实时荧光定量RT-PCR、流式细胞术检测转染后不同时间点细胞周期、HPV16 E6、p53、p21 mRNA及蛋白表达的变化。结果转染HPV16 E6 siRNA后,细胞生长明显受到抑制。流式细胞术结果显示并未将细胞阻滞在G1期。实时荧光定量RT-PCR显示,转染24h,E6 mRNA的表达比空白组降低了20.11倍(P<0.05),而p53、p21 mRNA的表达无明显变化。转染48h,E6蛋白表达明显下调,Pp53、P21蛋白表达相应地升高。结论HPV16 E6 siRNA可通过特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复P53蛋白的功能活性而发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用。     

稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

目的构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体，感染HPV16阳性宫颈癌细胞，筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆。方法采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16E6基因的pSUPER．retro RNAi逆转录病毒载体，脂质体法将逆转录病毒载体转染人包装细胞PA317，G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，收集病毒上清，感染靶细胞SiHa，G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆，RTPCR检测细胞中E6 mRNA表达，细胞增殖实验检测细胞增殖力。结果获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，病毒感染靶细胞SiHa后，筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆，RTPCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆，特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达，HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。     

沉默PeroxiredoxinⅠ基因对乳腺癌裸鼠移植瘤放射敏感性的影响

摘要：目的探讨PeroxiredoxinⅠ（PrxⅠ）沉默后对乳腺癌裸鼠移植瘤放射敏感性的影响及其作用机制。方法将稳定表
达PrxⅠshRNA的pGPU6-PrxⅠ和阴性对照pGPU6-HK细胞接种于裸鼠皮下,建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型。实验共分为
4组：pGPU6-HK组、pGPU6-PrxⅠ组、pGPU6-HK+照射（ionizing radiation,IR）组、pGPU6-PrxⅠ+IR组。用6 MV X线照
射裸鼠瘤组织,测量肿瘤体积,称取肿瘤质量,计算抑瘤率;免疫组化检测肿瘤组织中PrxⅠ和Caspase3蛋白表达;电镜观
察肿瘤细胞超微结构,Western blot 测定肿瘤组织中γ-H2AX和Rad51 蛋白表达。结果成功构建了裸鼠移植瘤模型,
pGPU6-PrxⅠ+IR组裸鼠移植瘤生长肿瘤明显迟缓,体积较小,抑瘤率为79.76%,与pGPU6-PrxⅠ（34.92%）和pGPU6-HK+
IR（56.94%）比较差异具有显著性（P<0.05）;给予pGPU6-PrxⅠ及IR处理后,肿瘤细胞凋亡和坏死增多,PrxⅠ和Rad51蛋
白表达减少,而Caspase3和γ-H2AX蛋白表达增加,以pGPU6-PrxⅠ+IR组更为显著,其Rad51蛋白下降了84.8%,γ-H2AX
蛋白表达升高5.6倍(P<0.05)。结论沉默PrxⅠ表达可提高乳腺癌移植瘤的放射敏感性,其作用机制与DNA双链断裂增
加、DNA损伤后修复能力降低有关。PrxⅠ可能是一个理想的乳腺癌放射增敏分子靶点。     

慢病毒介导lncRNA-AK058003过表达对肝癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的 探究上调SK-Hep1肝癌细胞中lncRNA-AK058003的表达对肝癌裸鼠移植瘤生长的影响。方法 采用慢病毒转染的方法将lncRNA-AK058003的重组质粒和空质粒分别转入SK-Hep1肝癌细胞株中,经新霉素筛选出lncRNA-AK058003稳定过表达的细胞株,用定量PCR的方法检测lncRNA-AK058003在SK-Hep1肝癌细胞中的过表达,并且将稳定过表达lncRNA-AK058003的SK-Hep1肝癌细胞和含有空质粒的SK-Hep1肝癌细胞分别注射入裸鼠腋下皮下,定期测量裸鼠移植瘤的长径和短径,从而计算出移植瘤的体积,饲养35天后测量移植瘤的重量。结果 构建稳定过表达lncRNA-AK058003的肝癌细胞株,裸鼠皮下荷瘤实验结果显示,过表达组裸鼠移植瘤的体积（308.4±439.4mm³）、重量（0.464±0.518g）和生长速度均低于空质粒组（1410.0±973.0mm³ ,1.363±0.856g,P < 0.05）。结论 lncRNA-AK058003对肝癌裸鼠移植瘤的增殖具有抑制作用。     

Rab25 siRNA对卵巢癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 通过RNA干涉抑制Rab25在人卵巢上皮性癌的过表达,观察Rab25 siRNA对卵巢癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法 构建针对Rab25的siRNA重组质粒,稳定转染A2780细胞,建立裸鼠移植瘤模型,测量肿瘤体积、绘制肿瘤生长曲线、计算抑瘤率、移植瘤组织病理学观察.结果 成功建立裸小鼠移植瘤模型,观察30-45d后,发现转染了Rab25 siRNA细胞体内成瘤能力显著下降,与正常对照组及转染空载体组相比,抑瘤率为50.78%、50.64%.结论 阻断细胞内Rab25的表达,可诱导细胞凋亡,缓慢癌细胞生长速度.基于Rab25基因的RNAi技术靶向诱导癌细胞凋亡可望作为卵巢癌治疗的重要辅助手段.