HPV58型E7基因重组痘苗疫苗免疫保护作用的实验研究

目的制备含人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗,并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果。方法利用PCR方法扩增HPV58E7DNA片段,在消除其转化活性的基础上,构建表达HPV58E7的重组痘苗病毒疫苗并免疫小鼠,观察该疫苗对E7阳性肿瘤细胞生长的抑制作用,体外诱导、测定细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性。结果经定点突变的HPV58E7基因转化活性显著降低,用突变的E7基因构建的重组痘苗病毒免疫小鼠后,能抑制E7阳性肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期;免疫小鼠脾淋巴细胞体外可诱导产生针对E7阳性肿瘤的CTL细胞。结论在消除转化活性的基础上,HPV58E7可用于治疗与HPV58感染有关的肿瘤。     

人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应

目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫。51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体。用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平。结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用。结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16DNA疫苗的协同因子具有重要价值。     

人乳头瘤病毒16型E7DNA疫苗的构建及其诱导特异性淋巴细胞增殖的研究

目的 :探讨人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )E7DNA疫苗诱导机体特异性细胞免疫应答的情况。方法 :采用分子克隆技术 ,构建HPV16野生型E7基因的真核表达重组体 ,将其转化大肠杆菌JM10 9进行筛选 ,通过限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析 ,证明重组质粒中目的基因插入片段及载体DNA大小、方向、插入位点均正确 ,获得HPV16E7DNA疫苗 ,将E7DNA疫苗经皮内注射免疫动物 ,MTT比色法体外检测特异性淋巴细胞增殖反应。结果 :野生型E7DNA疫苗免疫组脾淋巴细胞在体外受到E7蛋白的再次刺激后出现特异性淋巴细胞增殖反应。结论 :野生型E7DNA疫苗可诱导特异性的细胞免疫应答 ,皮内注射HPVDNA疫苗是一种简便有效的免疫接种途径     

共表达HPV16L1、L2、E67蛋白的重组非复制型痘苗病毒的构建

目的：构建共表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1、L2、E67蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法：以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术筛选共表达HPV16L1、L2、E67蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果：该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1、L2、E6、E7基因插人;经Western blot检测,重组病毒能稳定表达HPV16L1、L2、E67蛋白。结论：非复制型重组痘苗病毒NTVJE67CKL IL2可作为预防和治疗HPV16相关肿瘤及其癌前病变的候选疫苗。     

融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7的构建及其免疫学特性研究

目的 构建融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7,并评价其体外实验和动物模型上的免疫学特性,尤其是抗病毒致病基因的特异性细胞免疫反应.方法 分别构建DNA重组体pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7,pcDNA3.1-CRT180,pcDNA3.1-HPV6E7.将pcDNA3.1-HPV6E7质粒经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性细胞集落,荧光显微镜观察和RT-PCR鉴定表达HPV6E7的阳性细胞株.将质粒DNA肌注免疫C57BL/6小鼠,3次后取全血经流式细胞仪检测T细胞亚群的变化,LDH法检测小鼠的脾细胞和淋巴细胞与靶细胞B16/HPV6E7孵育后的CTL活性以及ELISA法检测共孵育上清中IL-2和IFN-γ浓度的变化.结果 各组质粒经鉴定表明构建正确.转染后细胞株稳定表达HPV6E7.DNA疫苗免疫小鼠后,pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7免疫组较pcDNA3.1-HPV6E7免疫组的外周血CD8 T细胞和TCRγδT细胞的比例显著增加,脾细胞和淋巴细胞针对靶细胞B16/HPV6E7的CTL杀伤活性更明显,分泌IL-2和IFN-γ的水平升高(P＜0.05).结论 CRT180与HPV致病基因6E7相连的重组质粒疫苗pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7能引发小鼠T细胞亚群CD8 分化并诱导出显著的特异性CTL反应.推测CRT180/HPV6E7 DNA疫苗在动物模型上可以有效激活抗HPV特异性细胞免疫,有利于病毒感染的清除.     

HPV16嵌合型疫苗的构建及其免疫效应初探

目的 构建以碳末端锌指结构突变的E7基因为基础，融合HSP70的嵌合型DNA疫苗，检测其诱导的特异性T淋巴细胞增殖活性，初步评价此疫苗对HPV相关肿瘤的治疗作用。方法 利用PCR法定点突变E7基因碳末端的锌指结构，以其为基础融合热休克蛋白70，克隆入pcDNA．3．1-质粒构建嵌合型DNA疫苗。DNA测序，确认E7基因突变位点及DNA疫苗阅读框架。用脂质体法将pcd—E7-HSP转染A549细胞，经G418筛选后，提取RNA，RT—PCR检测E7基因表达。DNA疫苗免疫C57BL6小鼠。取其脾细胞与E7蛋白在体外共同培育，MTT法检测T淋巴细胞增殖活性。结果 E7基因突变位点及阅读框架均正确，E7基因可检测到表达。疫苗免疫后C57BL/6小鼠脾细胞增殖活跃。结论：E7基因锌指结构的突变及融合HSP70能够诱导特异性的细胞免疫应答。     

表达HPV16 L1、L2E7蛋白的非复制重组痘苗病毒的构建和鉴定

目的:构建防治宫颈癌的表达人乳头瘤病毒16型、HPV16)L1、L2E7蛋白的非复制重组痘苗病毒疫苗株.方法:以痘苗病毒为载体,利用同源重组技术筛选共表达HPV16 L1、L2E7蛋白的重组痘苗病毒,用PCR和Western-blot技术进行鉴定.结果:该病毒在鸡胚成纤维细胞(CEF)中连续传代15代,经PCR检测证实病毒基因组中有HPV16 L1、L2E7目的基因插入,Western-blot检测证实病毒可以稳定表达L1、L2E7蛋白.结论:构建的病毒NTVJL1L2E7可以在真核细胞中表达HPV16 L1、L2E7蛋白,可以作为治疗和预防HPV16相关疾病的候选疫苗.     

HPV58 E2 DNA疫苗的构建及免疫原性研究

目的探讨人乳头瘤病毒58型（HPV58）早期基因E2作为DNA疫苗候选抗原的可行性。方法构建HPV58 E2真核重组表达载体pcDNA3/58E2,转染SiHa细胞,利用RT PCR检测HPV58E2 mRNA的转录。pcDNA3/58E2 DNA肌肉注射免疫BALB/C小鼠,ELISA检测小鼠血清中特异性anti HPV58E2 IgG水平。结果RT PCR结果表明,pcDNA3/58E2能够在真核细胞中有效转录HPV58E2mRNA。动物实验表明,质粒pcDNA3/58E2肌肉接种可诱导免疫小鼠产生抗E2特异性抗体。结论本研究成功构建了重组真核表达载体pcDNA3/58E2,并初步证明HPV58 E2 DNA 疫苗有良好的免疫原性。     

重组全酿酒酵母HPV16-E7疫苗的构建及免疫原性初步研究

目的 构建人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E7重组全酿酒酵母疫苗.初步评价疫苗的免疫应答效应.方法 将HPV16 E7 cDNA亚克隆入酵母表达载体pYES2/NT,重组质粒转化酿酒酵母,经诱导表达、热灭活制备全酵母HPV16-E7疫苗.疫苗免疫C57BL/6小鼠,ELISA检测其诱导的抗体和细胞因子表达水平.结果 重组全酵母疫苗能够有效地表达HPV16-E7蛋白;疫苗小鼠免疫,能够诱导出特异性抗HPV16-E7抗体,并促进Th1型细胞因子的表达.结论 研究结果 为进一步进行疫苗抗肿瘤免疫研究,提供了实验基础.     

HPV16 L1-E7蛋白疫苗诱导小鼠产生抗体及细胞免疫应答的研究

目的：探讨嵌合性病毒样颗粒HPV16 L1－E7蛋白疫苗接种于动物体内诱发体液和细胞免疫反应的能力。方法：以本室构建的HPV16 L1－E7嵌合蛋白疫苗腹腔注射免疫BALB／c小鼠，在初次免疫后，分别于第3，4，5周采血ELISA检测特异性抗体的产生。并耳皮下注射HPV16L1蛋白，检测特异性DHT反应，在末次免疫2周后，取小鼠脾细胞，用HPV 16 L1－E7蛋白刺激，检测T细胞增殖反应及血清IFN－γ水平。结果：HPV16 L1－E7蛋白疫苗免疫小鼠可有效产生HPV16 L1抗体及特异性DTH反应，加强免疫后，抗体水平升高，两者水平均高于对照组（P＜0．01），HPV16 L1－E7嵌合蛋白疫苗免疫后取小鼠脾细胞，在特异性HPV16 L1－E7蛋白抗原刺激下，特异性T淋巴细胞明显增殖，被免疫小鼠血清中出现高水平IFN－γ。结论：嵌合母亲产颗粒HPV16 L1－E7蛋白可诱导小鼠产生高滴度抗体，HPV16L1特异性TDH参与的超敏反应及细胞免疫应答的细胞因子，这为研究预防HPV感染和治疗HPV相关性肿瘤的疫苗提供了实验资料。     

带有HPV-16 E6/E7基因的树突状细胞疫苗对裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的抗肿瘤作用

目的：探索带有HPV-16 E6/E7基因的树突状细胞（dendritic cell,DC）疫苗对裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的抗肿瘤作用。方法：体外诱导培养C57BL/6小鼠骨髓的未成熟DC（immature DC,imDC）,将已经成功构建的携带人乳头状瘤病毒（human papillomavirus,HPV）-16 E6/E7基因的重组腺病毒感染imDC,Western blot检测E7蛋白的表达;构建裸鼠的人宫颈癌CaSki细胞移植瘤模型,应用DC疫苗诱导的BALB/c小鼠脾脏的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTL）处理后,观察裸鼠肿瘤体积变化,肿瘤长出第28天后处死裸鼠,小心剥下肿瘤组织,石蜡包埋,HE染色观察各组肿瘤的细胞形态,免疫组织化学技术法检测肿瘤组织中Bcl-2、Bax蛋白的表达情况。结果：成功培养出DC并制备出DC疫苗;第28天各组裸鼠肿瘤体积pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组与pAd-mock-DC-CTL-CaSki组、DC-CTL-CaSki组、CaSki组相比较,pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组裸鼠肿瘤体积最小（P<0.05）;免疫组化检测肿瘤组织中Bax蛋白的表达结果显示pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组最高,而CaSki组表达最低;免疫组化检测肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达结果显示pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组最低,而CaSki组表达最高。结论：带有HPV-16 E6/E7DC疫苗能够诱导CTL抑制裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的生长。     

HPV16 E6 DNA疫苗诱导小鼠抗宫颈癌主动免疫

目的：探讨HPV16 E6 DNA疫苗能否在体内诱导小鼠抗宫颈癌主动免疫应答。 方法：将HPV16 E6基因转染615小鼠宫颈癌U14，建立高表达E6的U14细胞株即E6+U14；制备HPV16 E6 DNA疫苗；随后分组进行体内预防和治疗E6+U14移植同系小鼠试验，设立对照组；观察各组小鼠肿瘤大小，计算抑瘤率、生存时间；计算淋巴和肺转移率；体外分别检测经HPV16 E6 DNA疫苗免疫后的小鼠T 淋巴细胞对E6+U14和U14的杀伤作用。结果：HPV16 E6 DNA疫苗预防和治疗组小鼠各时期瘤体大小均显著低于对照组（均P<0.001 ），两组抑瘤率均大于70%；平均生存时间均大于对照组（均P<0.001）；预防组淋巴转移率低于对照组（P<0.05）；HPV16 E6 DNA疫苗免疫小鼠T淋巴细胞在不同效靶比，对E6+U14的杀伤效率均明显高于对U14者（均P<0.001）。结论：HPV16 E6 DNA疫苗能诱导机体产生针对HPV16 E6阳性的宫颈癌细胞主动免疫应答及特异性细胞毒淋巴细胞，提示该疫苗可能对临床治疗宫颈癌有效。     

高危人乳头瘤病毒58型E6基因的克隆及表达

目的：获得含人乳头瘤病毒(HPV)58型E6基因的克隆及表达重组体并体外表达E6蛋白．方法：聚合酶链方法从1例宫颈腺癌患者癌组织DNA中获得HPV58 E6基因,并将其与克隆载体pGEM—T Easy连接,获得重组体HPV58-E6-pGEM—T,继之以双酶切将E6基因与同样双酶切的线性化的pRSET-A表达载体连接,得到E6表达重组体pRSET-58E6,转化E．coliBL21(DE3),用LPTG诱导表达．结果：从1例宫颈癌患者中成功获得了少见HPV58型的E6基因并构建了其重组表达载体．经IPTG诱导后可表达M24000的6His HPV58E6融合蛋白,表达量占菌体蛋白的10％．结论：成功获得了少见HPV58高危型的E6基因,并可在E．coli中高效表达．     

人乳头瘤病毒16 E6转染冻融人外周血树突状细胞疫苗体外抗宫颈癌作用

目的：制备来源于人外周血并转染人乳头瘤病毒（HPV）16 E6基因的冻融树突状细胞（DC）疫苗，检测其细胞形态。转染情况及体外诱导的免疫效应。方法：细胞因子扩增人外周血DC，低温-70℃冻存；Lipofectamine转染HPV16 E6制备DC疫苗。动态形态学观察，免疫细胞化学检测E6分子表达，体外诱导并测定细胞毒性T淋巴细胞活性。结果：转染E6基因的人外周血冻融DC呈形态迥异的多突起状，免疫细胞化学染色显示E6蛋白表达阳性；MTT法检测人宫颈癌细胞株（CaSKIi细胞）的杀伤活性明显高于对照组（P〈0．01），与新鲜DC疫苗比无统计学意义（P〉0．05）。结论：转染历基因的人外周血冻融DC疫苗保持了功能成熟DC的形态特征，且内源性表达E6蛋白，并在体外诱导出高效特异性的抗宫颈癌免疫反应，为宫颈癌的主动特异性免疫治疗提供了理想的疫苗和实验依据。     

HPV 58在宫颈癌组织中的感染分析及其转化基因的克隆

目的 分析中国陕西宫颈癌组织中HPV58的感染情况并克隆其E6、E7主要转化基因.方法 采用HPV GP5+/GP6+通用引物PCR 扩增58例宫颈癌组织DNA粗提物,继之将荧光偏振技术与模板指导的末端延伸反应(TDI-FP)结合,应用探针杂交延伸反应检测HPV58.用特异性引物随机从1例 HPV58 阳性标本中PCK 扩增HPV58 E6、E7基因,将其分别与pGEM-T Easy载体连接,所获得的重组质粒经内切酶消化和测序鉴定.结果 58例宫颈癌标本中10例(17.24%)为HPV 58阳性,克隆获得的HPV 58 E6、E7重组质粒经BLAST分析证实分别含有HPV 58完整的E6、E7基因,与GenBank收录的标准株比较,E6、E7基因分别有5个和2个硷基发生变异,可导致相应的蛋白质氨基酸序列中分别有4个和1个氨基酸替换.结论 中国陕西人宫颈癌组织中HPV 58感染较为多见,且HPV 58 E6和E7转化基因的硷基序列与标准株有所差异.本研究为下一步HPV 58相关肿瘤诊断试剂及疫苗的研制奠定了基础.     

HPV58E6基因的克隆及体外表达

目的：克隆并体外表达HPV58E6，为E6致癌作用和疫苗的研究奠定基础。方法：通过PCR方法从HPV58全基因克隆中扩增出HPV58E6基因片段，利用基因重组技术，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3的T7启动子下游，体外转录成mRNA后，在源自网织红细胞的翻译缓冲液中表达生物素标记的HPV58E6蛋白，化学发光法检测，X光胶片曙光显影鉴定，结果：酶切电泳证实质粒构建正确，SDS-PAGE电泳显示在相当于HPV58E6分子量约18.8kD的位置出现条带，X光胶片亦在相应位置出现印迹条带。结论：成功表达了含有生物素标记的HPV58E6蛋白，为其致癌作用和治疗的研究奠定基础。     

HER2/neu诱导DBA/2小鼠特异性CTL应答及其抑瘤效应研究

目的：探讨HER2/neu原癌基因DNA疫苗免疫诱导特异性细胞免疫应答及其在体内的抑瘤效应。方法：将重组HER2/neu原癌基因真核表达载全转染P815细胞，用细胞组织化学及Western-blot方法鉴定质粒在细胞中的表达。在DBA/2小鼠体内构建表达HER2抗原的肿瘤动物模型，通过重组质粒免疫小鼠，诱导小鼠产生细胞免疫应答，观察免疫动物体内的抗瘤效应。结果：在体外获得了稳定表达HER2/neu基因的P815细胞；免疫小鼠脾细胞中诱导出特异性CTL，并杀伤HER2/neu阳性的P815细胞；荷瘤小鼠的肿瘤生长受抑，存活期延长。结论：HER2/neu原癌基因DNA疫苗免疫可诱导特异性细胞免疫应答，并具有一定抗瘤效应。     

CD40L融合改造后的人乳头瘤病毒16型E7基因DNA疫苗的构建及其免疫原性测定

目的研究针对人乳头瘤病毒(HPV)16型的DNA疫苗,测定其免疫原性,用于治疗HPV16感染及感染相关恶性肿瘤。方法联合采用基因切割重排、定点突变及密码子优化等策略改造HPV16的转化基因E7,基因合成法获得改造后的E7基因(mE7);PCR法将mE7基因与CD40L胞外区编码序列融合,然后以pVR1012为载体构建pVR1012-mE7(mE7)及pVR1012-mE7/CD40L(mE7/CD40L)表达质粒;经肌肉免疫C57BL/6小鼠;ELISA法检测E7特异性血清抗体水平,ELISPOT法分析E749-57(H-2b)特异性分泌IFN-γ的CD8 T细胞活化水平,胞内染色-流式细胞检测分析E7特异性CD4 Th细胞活化水平;并在C57BL/6小鼠体内进行疫苗抗瘤活性检测。结果与野生型E7基因(wE7)相比,mE7基因诱发产生的E7特异抗体水平(P<0.01)、分泌IFN-γ的CD8 T细胞数目(P<0.01)及CD4 Th细胞活化水平(P<0.05)均显著提高;与mE7基因相比,mE7/CD40L融合基因可进一步显著提高E7特异性分泌IFN-γ的CD8 T细胞数目(P<0.01),但对E7特异性抗体产生及CD4 Th细胞活化水平没有明显影响。疫苗小鼠体内预防性免疫实验中,经wE7免疫的小鼠接种瘤细胞后2周内全部形成移植瘤,而所有经mE7及mE7/CD40L免疫的小鼠在瘤细胞攻击后第7周仍未见移植瘤形成;疫苗体内治疗性免疫实验中,小鼠在接种wE7后第8天左右全部形成移植瘤,并呈渐进性生长,而接种mE7的小鼠移植瘤清除率为30%,接种mE7/CD40L的小鼠移植瘤清除率增高至45%。对移植瘤的组织学检查结果显示,mE7/CD40L及mE7免疫组小鼠瘤细胞间及瘤组织周围可见大量淋巴细胞浸润,而wE7组小鼠的瘤细胞呈编织状紧密排列,未见有淋巴细胞浸润。结论HPV16型mE7/CD40L融合基因疫苗免疫小鼠后可诱发较强的E7特异性细胞免疫及体内抗瘤活性,具有较强的免疫原性。     

树突状细胞疫苗联合CpG-ODN对膀胱肿瘤细胞的免疫学效应研究

目的 探讨负载肿瘤抗原的树突状细胞(DC)疫苗联合含未甲基化胞嘧啶鸟嘌呤(CpG)序列的寡脱氧核糖核苷酸(CpG-ODN)对膀胱肿瘤细胞的免疫学效应.方法 用小鼠BTT739细胞反复冻融抗原致敏培养第7天的DC,48h后分别加入CpG-ODN及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导DC成熟,制备负载肿瘤抗原的DC疫苗,灭活后用于刺激T淋巴细胞制备效应细胞(CTL),乳酸脱氢酶释放实验测定各组CTL对BTT739细胞的杀伤活性,ELISA法测定效应细胞培养上清液的干扰素-γ(IFN-γ)水平,同时检测了CTL对自体淋巴细胞的杀伤活性.结果负载肿瘤抗原的DC诱导的效应细胞分泌较高水平的IFN-γ,并对BTT739细胞具有较高的杀伤效应,CpG-ODN活化的DC疫苗诱导的效应细胞分泌IFN-γ水平及对肿瘤细胞的杀伤活性均高于TNF-α活化的DC疫苗诱导的效应细胞(P<0.01).DC疫苗对自体淋巴细胞无明显免疫杀伤活性.结论 CpG-ODN可增强负载肿瘤抗原的DC疫苗对膀胱肿瘤细胞的免疫杀伤效应,并且对自体淋巴细胞无免疫杀伤活性,为膀胱癌的免疫治疗提供了实验基础.     

减毒沙门氏细胞为载体的人乳头瘤病毒双启动子DNA疫苗载体构建

目的：构建一种廉价高效的防治宫颈癌的人乳头瘤病毒新型双启动子DNA疫苗。方法：设计合成细菌厌氧诱导启动子Nir，含有FNR顺式反应元件、RBS和真核基因Kozak元件，插入pTriEx真核启动子CMV IE下游，构建pCMVnir双启动子载体。将人乳头瘤病毒16型L1L7，融合基因，插入pCMVnir，制备pCMVnirL1E7,转化减毒沙门氏细菌SL3261，厌氧诱导表达，SDS－PAGE和Western blot分析检测Nir启动子的活性。结果：经DNA序列和限制性内切酶鉴定分析，成功构建了HPV双启动子DNA疫苗载体pCMVnirL1E7,转化沙门氏细菌SL3261，厌氧条件下可诱导表达HPVL1E7蛋白质。结论：成功构建了一种与胞内寄生细菌（减毒沙门氏细菌）匹配的双启动子DNA疫苗新型载体，并构建了HPV16pCMVnirL1E7新型DNA疫苗。