HIV-1辅受体配体的逆转录病毒载体的构建和表达

目的: 构建HIV-1辅受体的配体-趋化因子RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体,并观察在NIH3T3细胞的表达.方法: 从重组质粒pCMV-R-K-S-K中获取RANTES-KDEL-SDF-KDEL基因片段,构建RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体pLNCX-R-K-S-K,酶切鉴定并测序.采用标准的磷酸钙共沉淀法转染包装细胞Bing, G418筛选克隆细胞,制备重组病毒液,继之感染NIH3T3细胞,计算病毒滴度.间接免疫荧光检测NIH3T3细胞中RANTES、SDF-1的表达.结果: pLNCX-R-K-S-K逆转录病毒载体酶切和测序结果与预期一致,筛选出抗性克隆,制备了高滴度的重组病毒液,间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1可表达于转染细胞.结论: HIV-1辅受体的配体、趋化因子RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体构建成功,重组病毒可以感染NIH3T3细胞,为下一步HIV-1感染实验打下了基础.     

去C末端JAK3基因重组逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 :构建去C末端Jak3重组逆转录病毒载体 ,获得能稳定产生去C末端Jak3基因的重组逆转录病毒的细胞株 ,为利用去C 末端Jak3对白血病进行基因治疗的实验研究打基础。方法 :用限制性内切酶从质粒PcJak3(ΔC)中切出目的基因并从凝胶中回收该目的基因片段 ,连接到逆转录病毒载体PLXSN多克隆位点上构建重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC) ,通过转化感受态细菌后氨卞青霉素筛选、酶切及DNA测序鉴定 ;用脂质体LIPOFECTAMINE转染包装细胞PA317细胞并用G4 18筛选抗性细胞 ,转染的包装细胞包装出病毒粒子 ,同时用PCR方法检测PA317阳性细胞中是否插入目的基因片段 ;用该病毒感染靶细胞NIH3T3,G4 18筛选抗性克隆 ,检测出病毒滴度 ;经免疫沉淀 (IP)、SDS PAGE电泳、Westernblotting检测NIH3T3细胞中Jak3(ΔC)的表达情况。结果 :①重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC)酶切和DNA检序均表明已含有 2 796bp的Jak3(ΔC)基因 ;②转染的PA317阳性细胞经PCR扩增后得到与目的基因一致的片段 ;③病毒滴度为 1.2～ 2 .0× 10 4CFU/ml;④转染的NIH3T3细胞中表达出了Jak3(ΔC)蛋白 ,其分子量为 10 7KD。结论 :我们已成功构建了去C 末端Jak3重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC) ,并得到稳定产生病毒粒子的PA317细胞克隆 ,为利用Jak3(ΔC)对白血病     

表达HIF1α与EGFP融合蛋白的重组逆转录病毒载体构建及鉴定

目的构建表达人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)与EGFP融合蛋白的重组逆转录病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞感染效率.方法采用基因工程技术,将HIF-1α基因片段克隆至逆转录病毒载体pLEGFP-N1上,鉴定后用脂质体法转染PT67细胞包装、扩增,最后用重组逆转录病毒感染NIH3T3细胞.其中采用PCR方法对重组病毒进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测.结果酶切、测序及PCR结果与HIF-1α基因重组逆转录病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达1.2×106 pfu/ml,并对NIH3T3细胞有强感染能力.结论应用基因工程技术,成功构建了表达HIF-1α与EGFP融合蛋白的重组逆转录病毒载体,为应用于治疗性血管生成创造了条件.     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

雄激素受体反义RNA逆转录病毒载体的构建及其鉴定

目的　构建雄激素受体 (AR)反义RNA逆转录病毒载体pL AR SN并进行包装和鉴定。方法　PCR扩增ARcDNA片段并将之反向插入到逆转录病毒载体pLXSN ,用脂质体法转染PA31 7细胞 ,提取转染细胞基因组DNA和培养上清中重组逆转录病毒RNA ,用PCR和RT PCR法进行鉴定 ,NIH 3T3细胞测定病毒滴度。结果　限制性内切酶分析证明pL AR SN含有反向插入的ARcDNA目的片段 ;培养上清中病毒滴度为 2 .34× 1 0 5 CFU/ml,PCR和RT PCR分别从转染细胞基因组DNA和培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的目的片段。结论　成功构建了AR反义RNA逆转录病毒载体并包装出了高滴度的重组逆转录病毒。     

人HIF1α基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定

目的构建人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因重组逆转录病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞感染效率.方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将HIF-1α基因片段克隆至含IRES-EGFP逆转录病毒载体上,鉴定后用脂质体法转染PT67细胞进行包装、扩增,最后用重组逆转录病毒感染NIH3T3细胞.其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果酶切鉴定及PCR结果与HIF-1α基因重组逆转录病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达(1.4×106 pfu/ml),并对NIH3T3细胞有强感染能力.结论应用基因工程技术,成功构建了含人HIF-1α基因重组逆转录病毒载体,为应用于治疗性血管生成创造了条件.     

靶向Bi-1基因的重组慢病毒载体构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 慢病毒载体技术已被广泛应用于基因功能分析、信号转导通路和基因治疗的研究.文中应用慢病毒系统构建凋亡抑制基因Bi-1的慢病毒表达载体并检测其在NIH3T3细胞中的表达,为后续的以Bi-1基因为靶点的肿瘤基因治疗研究奠定基础. 方法 根据慢病毒表达载体酶切位点的特征序列设计PCR扩增引物并扩增人Bi-1cDNA,并采用DNA重组技术定向克隆至pLCMV-IG质粒中,构建重组慢病毒载体质粒pLCMV-IG-Bi-1,经PCR、双酶切和测序鉴定后,包装慢病毒感染至小鼠成纤维细胞株NIH3T3中,RT-PCR及Western-blot 分别检测NIH3T3细胞中Bi-1基因和蛋白的表达. 结果 PCR、酶切及测序结果 表明重组慢病毒载体构建成功;NIH3T3细胞感染重组载体包装的慢病毒后出现明显的Bi-1基因高表达. 结论 成功构建靶向Bi-1基因的重组慢病毒载体,为进一步研究Bi-1基因对细胞生长转化的影响提供了实验依据.     

TH基因逆转录病毒表达载体的构建及产病毒细胞系的建立

目的　构建含有鼠酪氨酸羟化酶 (TH)基因的重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH,建立 PA317产病毒细胞系。方法　将质粒 p GEM- 2上酶切下的 THc DNA片段与线性化的逆转录病毒表达载体 N2 A连接 ,克隆出重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH。把 p N2 ATH质粒转入 PA317包装细胞 ,通过 G4 18抗性筛选 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,得到高滴度产毒 PA317/p N2 ATH细胞株 ,免疫组化测定细胞 TH表达。结果　重组质粒 p N2 ATH经酶切鉴定证明 THc DNA正向插入 N2 A表达载体中 ,PA317/p N2 ATH产毒细胞高效表达 TH。结论　成功地构建了重组逆转录病毒表达载体p N2 ATH,建立了 PA317/p N2 A产毒细胞株     

重组载体pLNCX/iNOS的构建及其在NIH3T3细胞中滴度的测定

目的 :构建重组质粒pLNCX/iNOS。方法 :用PCR技术从pCMV/iNOS质粒中扩增出iNOS全长cDNA ,与逆转录病毒pLNCX构建重组质粒pLNCX/iNOS ;通过脂质体介导把重组质粒转染入包装细胞PA3 17中 ,经G418筛选出抗性克隆。通过NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果 :经过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定重组质粒构建正确。G418筛选出 16个抗性克隆 ,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 2 .1×10 4CFU·ml-1。结论 :逆转录病毒载体pLNCX可有效地介导iNOS的转染     

miR-148a克隆及逆转录病毒载体构建

目的 克隆微小RNA hsa-miR-148a并构建逆转录病毒表达载体.方法 将PCR扩增得到的miR-148a前体序列和pMSCV载体经双酶切连接产生pMSCV-miR-148a逆转录病毒表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆.用pMSCV-miR-148a和PIK packaging质粒以磷酸钙共沉淀法转染包装细胞293FT,包装产生逆转录病毒.将病毒感染NIH3T3细胞进行滴度测定.结果 经双酶切鉴定和测序证实,成功构建了miR-148a的逆转录病毒表达载体pMSCV-miR-148a.并测得病毒滴度为5×108CFU/ml.结论 以miR-148a前体序列构建的逆转录病毒表达载体pMSCV-miR-148a能够产生高滴度的逆转录病毒,为深入研究miR-148a的生物学功能奠定了基础.     

含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立

目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。　方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况。　结果 :逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G4 18后筛选得到阳性克隆细胞 ,命名为PA317/TK。PCR检测PA317/TK细胞出现一特异性 4 0 4bp阳性条带 ,而PA317细胞没有扩增出相应条带。PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起 ,其周围有许多呈团状的病毒颗粒。证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中。　结论 :成功建立含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞     

逆转录病毒介导癌基因疗法体外安全实验

从逆转录病毒ｐＬＸＳＮ与人ＩＬ－２ｃＤＮＡ基因进行重组，包括ＰＡ３１７细胞，建立逆转录病毒包装体系细胞ＰＡ３１７／ｐＬＩＬ－２ＳＮ。用病毒上清液转导人淋巴细胞（ＴＩＬ，ＰＢＬ）和３株人腺癌细胞株（ＳＰＣ－Ａ１，ＭＫＮ－ＨｅｐＧ２）对转ＩＬ－２基因的淋巴细胞（ＴＩＬ／ＩＬ－２，ＰＢＬ／ＩＬ－２）和转ＩＬ－２基因的人癌细胞（ＳＰＣ－Ａ２／ＩＬ－２，ＭＫＮ－４５／ＩＬ－２，ＨｅｐＧ２／ＩＬ２）进行体外安     

c-myb反义RNA重组载体构建及其包装细胞株的建立

【目的】构建反义c-myb重组逆转录病毒载体并建立其包装细胞株。【方法】采用RT-PCR方法,获取目的基因,通过TA克隆方法克隆入pUC19,再反向亚克隆入逆转录病毒载体pDOR中。采用DOTAP法将重组逆转录病毒载体转入包装细胞,以NIH3T3细胞为靶细胞测定产病毒滴度。【结果】序列测定结果与GenBank中序列一致。c-myb基因片段已定向克隆入pDOR。细胞转染表明,已形成稳定的包装细胞株PA317/pDOR-myb,产病毒滴度达5.2×104～9.5×104CFU/mL。【结论】成功构建了含有反义c-myb的重组逆转录病毒质粒,并建立其包装细胞株。     

iNOS转基因在血管平滑肌细胞的表达

目的 研究逆转录病毒介导诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因在体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞（VSMC）中的表达。方法 通过脂质体介导的DNA转染法将PLXSNiNOS导入PA317细胞中；经G418筛选获得抗性克隆；用NIH3T3细胞测定病毒上清滴度；将病毒上清转染体外培养的VSMC；采用RT-PCR、Western blot检测VSMC内iNOS mRNA和蛋白的表达。结果 PLXSNiNOS转染体外培养的VSMC48h后，在VSMC内可检测到外源性iNOS mRNA和蛋白；而用PLXSN转染体外培养的VSMC48h后未能检测到外源性iNOS mRNA和蛋白表达。结论 逆转录病毒介导iN0s基因可高效转染体外培养的VSMC，并在细胞内表达iNOS蛋白。     

Delta1-IRES-EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体.方法利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES-EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1-IRES-EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP E86和PA317,嘌呤霉素(puromycin)筛选获得阳性表达克隆;"乒乓球"法提高病毒滴度;重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞仪(FACS)及RT-PCR法分别检测细胞荧光和Delta1 mRNA表达变化;C2C12共培养实验检测蛋白的功能.结果酶切、PCR鉴定及DNA测序证实逆转录病毒表达载体pDelta1-IRES-EGFP构建正确;经体外包装,获得最高滴度9.7×105 CFU/ml的重组病毒液;重组病毒液感染NIH3T3细胞,FACS检测部分细胞荧光强度显著提高;RT-PCR证实细胞内有外源基因Delta1表达;C2C12共培养实验证实外源蛋白Delta1可抑制C2C12细胞的分化.结论逆转录病毒基因转移系统安全,效率较高,可获得外源基因长期、稳定的表达.     

含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因应用于基因治疗。构建、包装含CD基因的假型逆转录病毒。构建含CD基因的逆转录病毒重组表达载体pLCDSN基础上，以重组表达载体pLCDSN转染包装细胞PA317，pLCDSN整合入PA317染色体中。结果：CD基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒感染NIH／3T3细胞，逆转录病毒重组表达载体pLCDSN整合入NIH／3T3细胞染色体中，CD基因获得表达。5－FC对有CD基因表达的包装细胞PA317（pLCDSN）和NIH／3T3（pLCDSN）产生杀伤毒性。结论：我们已成功地构建、包装了含重组逆转录病毒载体pLCDSN且具有感染能力的假型逆转录病毒。该工作为以逆转录病毒介导的CD基因应用于肿瘤基因治疗奠定了基础。     

反义人血管生成素的真核表达载体的构建及其体外功能的初步研究

目的构建含反义人血管生成素的真核表达载体,并转染人肺癌细胞株A549,使之特异性地封闭A549细胞中血管生成素的表达,以达到抑制肿瘤生长的目的.方法用RT-PCR的方法合成血管生成素的cDNA,将其反向克隆入逆转录病毒质粒载体中,通过PA317细胞包装为假病毒颗粒,体外转染肺癌细胞株A549.结果构建出含反义血管生成素的逆转录病毒载体,感染A549细胞后,能有效抑制A549细胞血管生成素蛋白的表达.结论利用反义血管生成素的逆转录病毒载体能够有效抑制培养细胞血管生成素的表达,为今后的体内应用奠定了基础.