大鼠原代培养肝细胞的生物学特性研究

目的 :观察培养的原代大鼠肝细胞形态学和功能的动态变化 ,探讨其短期培养内的最佳功能状态。方法 :采用Seglen胶原酶二步灌流法分离肝细胞。光镜、透射电镜和免疫组化方法观察细胞形态学改变 ;并收集不同时期培养上清监测生化指标的改变。结果 :平均每只大鼠肝获取 1.2 1× 10 8个肝细胞 ,平均活力为 93.6 %。光镜下见肝细胞生长良好 ,可存活 3周 ,电镜下可见丰富的细胞器 ,细胞连接及胆小管 ,细胞角蛋白 18强阳性表达。肝细胞功能检测白蛋白分泌及尿素合成功能在第 3,4天时较好。结论 :肝细胞的形态和功能具有一致性 ,原代肝细胞在培养第 3,4天功能较好 ,可能为肝细胞移植和生物人工肝应用的最佳时机。     

大鼠原代肝细胞的形态和功能

目的 :对分离培养的原代大鼠肝细胞进行形态学观察和功能研究 ,探讨其短期培养内的最佳功能状态 ,以便更好地用于肝细胞移植或生物人工肝 .方法 :采用Seglen胶原酶二步灌流法灌注SD雄性大鼠肝脏 ,获取的肝细胞在含有多种辅助因子的Williams’E培养基中进行培养 .台盼蓝排斥法计算细胞产量和细胞活率 ;光镜下直接或HE染色后动态观察细胞形态学改变 ,透射电镜观察其超微结构 ;并收集不同时期培养上清检测其细胞分泌等功能 .结果 :每只大鼠肝平均可获取 1 .2 1× 1 0 8个肝细胞 ,平均活力为 93.6 % .光镜下可见肝细胞呈多角形生长 ,有双核 ,连接成片状或岛状 .电镜下可见内质网、车轮状线粒体、糖原颗粒、细胞连接及胆小管 .肝细胞功能检测显示LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成功能在 1wk内出现波动性变化 ,第 3日LDH漏出量最低 ,白蛋白分泌及尿素合成功能较好 .结论 :离体培养的 3d原代肝细胞具有较好的功能 ,可能为肝细胞移植和生物人工肝应用的最佳时机     

大鼠肝细胞分离、原代培养及生物学特性研究

目的 :探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法、原代培养肝细胞的生物学特性。　方法 :以SD大鼠作肝细胞供者 ,采用胶原酶消化法分离获取肝细胞 ,并进行原代培养 ;以锥虫蓝染色法测细胞活力 ,在倒置显微镜下观察肝细胞形态变化 ,采用Beckman全自动生化分析仪检测各培养体系不同时间培养上清中Albumin、LDH、Urea的含量。　结果 :胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整、贴壁良好、活性高、功能强。LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成功能在 1周内出现波动性变化 ,第 3天时LDH漏出量最低 ,白蛋白分泌及尿素合成功能较好。　结论 :胶原酶消化法为一较好的肝细胞分离方法 ,分离的肝细胞在培养第 3天功能最佳     

大鼠肝细胞的原代培养

目的探索肝细胞的分离和原代培养条件.方法两步灌流法分离SD大鼠肝细胞,并将其培养在Hepatozyme-SFM培养基中,用MTT试验和尿素合成功能检测了解培养中的肝细胞的生物学活性.结果分离肝细胞的即时存活率为88%±2%,产量为(39±12)×106/g克肝脏;培养于体外的肝细胞维持形态稳定和尿素合成等功能达1周.结论应用两步灌流法可取得较好的肝细胞分离效果,应用Hepatozyme-SFM培养基能使肝细胞体外维持生物学功能达1周.     

三明治培养新生实验小型猪肝细胞的功能与形态

目的 探索双层胶原夹心猪肝细胞的方法，观察培养猪肝细胞的功能与形态特征。方法 将两步法分离的新生中国实验小型猪肝细胞接种于胶原被覆的培养板常规培养，24h后，肝细胞上再加一层胶原形成双层胶原夹心（三明治）培养，观察培养猪肝细胞的白蛋白分泌、形态学特征和乳酸脱氢酶（LDH）漏出量。结果 成功将新生实验小型猪肝细胞固定于双层胶原中，形成三明治状。培养1周内，用SDS／PAGE可检测出猪肝细胞分泌的白蛋白，倒置相差显微镜下观察到典型的形态特征，培养期内LDH漏出量较少。结论 可用双层胶原对新生乳猪肝细胞进行三明治样培养，为肝细胞提供更接近体内的培养环境，有助于维持特殊的肝功能和形态学特征。     

大鼠肝细胞的分离及原代长期培养

目的 :研究大鼠肝细胞分离的简易方法及长期培养过程中肝细胞形态变化过程。方法 :采用体外胶原酶二步灌注法分离大鼠肝细胞 ,TB染色法计算细胞数及细胞活率。 MTT法观测新生牛血清对大鼠肝细胞增殖的影响。在含 1 0 %新生牛血清及其他附助因子的 Williams′E条件培养基中原代长期培养 ,并进行形态学的动态观察。结果 :平均每只大鼠可获取 2 .2 6× 1 0 8个肝细胞 ,平均活力为 95.6%。新生牛血清浓度与大鼠肝细胞增殖有明显的量效关系 (P<0 .0 1 )。在 Williams′E培养基中可存活 5～ 6周并保持正常形态。结论 :本方法分离的肝细胞有较高的获取率和活力 ,适合体外长期原代培养     

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法

为寻求一种简易、价廉的原代小鼠肝细胞培养方法 ,采用非灌注法、冰浴操作处理肝组织块及改良低血清培养基进行了原代鼠肝组织块和鼠肝细胞单层培养。通过光镜观察细胞形态、电镜观察超微结构及检测培养上清白蛋白水平证实培养细胞为肝细胞。持续培养结果显示原代培养第 6～ 12 d左右为肝细胞功能最佳观察和实验阶段。     

微载体黏附培养SD大鼠肝细胞的生物学特性

目的:探讨微载体黏附培养SD大鼠肝细胞的生物学特性. 方法:对胶原酶消化法分离获取的SD大鼠肝细胞行微载体黏附培养,在倒置显微镜及扫描电镜下观察肝细胞形态变化,采用CL-800全自动生化分析仪检测不同时间培养上清中白蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)和尿素的含量. 结果:微载体黏附培养肝细胞的正常形态及白蛋白、尿素合成功能可维持1 wk以上,LDH漏出量、白蛋白及尿素水平1 wk内呈波动性变化,在培养第3日白蛋白及尿素水平最高、LDH漏出量最低. 结论:微载体培养可提供高活性、高密度生长的肝细胞,可望为肝细胞移植、生物型人工肝提供较理想的细胞材料;微载体培养肝细胞在培养第3日功能最佳,可能为应用于肝细胞移植、生物型人工肝的最佳时间.     

缺氧对培养肝细胞极性的影响

目的观察缺氧对培养肝细胞极性的影响。方法利用三明治构型培养成鼠肝细胞,观察缺氧后肝细胞形态、特异性膜区域蛋白分布以及胞质钙离子的变化,以确定对细胞极性的影响。结果缺氧后,肝细胞变得扁平,分化良好的小管样结构消失;免疫组织化学证明肝细胞膜小管区域蛋白失去特异性分布;激光共聚焦显微镜显示肝细胞胞质钙离子荧光强度增强。结论缺氧可导致肝细胞极性丧失,从而造成肝细胞损伤,本研究可为在细胞水平研究肝脏缺血性再灌注损伤的发病机制提供一个体外模型。     

胎肝前体细胞脾移植对大鼠急性肝功能衰竭的实验研究

目的 :探讨经脾内同种异体移植培养的原代胎肝前体细胞与成体肝细胞悬液对大鼠药物性肝衰竭的疗效 ,并观察脾内移植肝细胞的生物学特性。方法 :采用 D-氨基半乳糖 ( D- gal)建立大鼠急性肝衰竭模型 ,2 4 h后随机分为三组进行治疗。 A组 :经脾内移植体外培养 7d的肝细胞 2× 1 0 7;B组 :经脾内移植肝细胞悬液 2× 1 0 7;C组 :经脾内注射生理盐水1 ml。观察受体大鼠的存活率、肝脏功能和病理变化及移植肝细胞的生物学特性。结果 :A组、B组大鼠存活率 ( 77%、5 9% )与 C组大鼠存活率 ( 2 2 % )相比具有显著性差异 ,肝功能各项指标均有明显改善 ,A、B组与 C组大鼠的肝功能改变方面有统计学差异。经 HE和 PAS染色证实 ,移植的肝细胞在受体脾内结构和功能保持较好。结论 :经脾内移植的培养的原代胎肝前体细胞和肝细胞悬液均能提高大鼠药物性肝衰竭的存活率、改善肝功能及肝脏组织病理变化 ,但培养原代胎肝前体细胞优于成体肝细胞悬液。     

重组人类生长激素改善蛋白质营养不良机制的研究

目的探讨重组人类生长激素(rhGH)对大鼠肝细胞所表达的部分营养指标的影响。方法应用原位二步法制备肝脏单细胞悬液后进行细胞培养,在培养液中加入rhGH,分别检测分泌性白蛋白(Alb)、转铁蛋白(Trf)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、IGF结合蛋白-1(IGFBP-1)和IGF结合蛋白-3(IGFBP-3)的表达量。结果1)rhGH组的Alb、Trf、IGF-Ⅰ均显著高于对照组,2组比较差异有统计学意义(P<0.01)。2)rhGH组的IGFBP-1明显低于对照组,而IGFBP-3则明显高于对照组,2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论rhGH明显增加肝细胞的分泌性Alb、Trf、IGF-I等营养指标的合成和(或)分泌,明显抑制肝细胞对IGFBP-1的合成,显著上调IGFBP-3的表达。     

11,12-EET对大鼠心脏缺血/再灌注损伤保护作用研究

目的观察不同质量浓度11,12-EET对心肌缺血/再灌注损伤的影响及给药后不同时间11,12-EET保护作用的变化,以期了解11,12-EET对心肌保护作用的特点。方法复制大鼠心脏缺血/再灌注模型,给予不同浓度的11,12-EET,观察不同时间点的心功能变化。结果给予6.24×10-7.5mol/L、6.24×10-8mol/L 11,12-EET均可改善心肌缺血/再灌注损伤的大鼠心功能,6.24×10-9mol/L 11,12-EET作用较弱;给药24 h后11,12-EET拮抗大鼠心肌缺血/再灌注损伤的作用也减弱。结论11,12-EET的浓度及给予11,12-EET的时间对心脏保护作用有一定的影响。     

Taqman荧光定量PCR是核酸水平对管家基因GAPDH进行定量的好方法

目的比较Taqman荧光定量PCR法、SYBR Green I荧光定量PCR法和普通PCR法制作3-磷酸甘油醛(GAPDH)标准曲线的检出下限、线性范围的差异,确定一种较好的GAPDH绝对定量方法。方法构建含GAPDH全长的质粒,经PCR和EcoR I限制性酶切鉴定确认后,紫外定量并连续稀释10倍作为标准品。分别用Taqman法和SYBR Green I法于荧光定量PCR仪上制作标准曲线,同时用普通PCR结合琼脂糖凝胶电泳利用Quantity One软件定量并制作标准曲线。结果Taqman法检出GAPDH的下限为2.0×104拷贝,线性范围:2.0×104~2.0×1010拷贝;SYBR Green I法检出GAPDH的下限为2.0×107拷贝,线性范围:2.0×107~2.0×1010拷贝;普通PCR检出GAPDH的下限为2.0×106拷贝,线性范围:2.0×107~2.0×109拷贝。结论Taqman荧光定量PCR法比SYBR Green I荧光定量PCR法和普通PCR法的灵敏度高,线性范围宽,是核酸水平对GAPDH定量的好方法。     

Fischer344大鼠上皮性卵巢癌动物模型的建立

目的建立类似人卵巢癌临床表现的大鼠上皮性卵巢癌动物模型。方法将大鼠上皮性卵巢癌NuTu19细胞按不同细胞数接种于同种Fischer344大鼠腹腔内,观察其体质量、生存期的改变;接种细胞4周、8周、16周后,系统解剖接种后大鼠并做常规病理学检查。结果接种后大鼠半数生存期:细胞数为5×106组为30d;1×106组62d;5×105组66d;1×105组129d;5×104组160d;1×104组223d;所有模型大鼠死亡前3周体质量均上升,并出现腹水;出现与人卵巢癌晚期类似临床表现,如血性腹水,腹膜和横膈、盆腔腹腔器官表面接种粟粒状结节,大小网膜呈饼状。组织学检查结果为浆液性乳头状囊腺癌,但卵巢组织在晚期才表现为癌症浸润。结论Fischer344大鼠上皮性卵巢癌动物模型在肿瘤生长方式、疾病进展过程、组织学类型、并发症等方面与人卵巢癌类似,是较为理想的卵巢癌动物模型。     

糖尿病视网膜病变与糖尿病肾病关系的研究

目的本研究探讨了2型糖尿病患者糖尿病肾脏病变(diabetic nephropathy,DN)与视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)之间的相关性。方法本研究的患者为无糖尿病视网膜病变(non-diabetic retinopathy,NDR)或增殖期视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)的2型糖尿病患者。根据8 h尿微量白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate,UAER)将患者分为3组:A组:UAER<20μg/min,B组:UAER为20～200μg/min;C组:UAER>200μg/min,A组病人共169人,其中NDR 53人,PDR 116人;B组病人共76人,其中NDR 37人,PDR 39人;C组病人共66人,其中NDR 40人,PDR 26人。比较各亚组间肾小球滤过率差异。结果根据目前推荐的MDRD简化公式:估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)=186×(SCr)-1.154×(Age)-0.203×(0.742女性),计算出肾小球滤过率,进行3组中各亚组间对比发现,PDR亚组eGFR均较NDR亚组eGFR降低。其中B组和C组PDR亚组与NDR亚组eGFR比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论增殖期糖尿病视网膜病变的出现,能够预测肾功能损伤程度,但其与尿微量白蛋白排泄率相关性不大。原因与微量白蛋白尿作为DN诊断生物标志物的特异性较差有关。     

Abnormal mitochondrial function impairs calcium influx in diabetic mouse pancreatic beta cells

Background  Abnormal insulin secretion of pancreatic beta cells is now regarded as the more primary defect than the insulin function in the etiology of type 2 diabetes. Previous studies found impaired mitochondrial function and impaired Ca²⁺ influx in beta cells in diabetic patients and animal models, suggesting a role for these processes in proper insulin secretion. The aim of this study was to investigate the detailed relationship of mitochondrial function, Ca²⁺ influx, and defective insulin secretion.

Methods  We investigated mitochondrial function and morphology in pancreatic beta cell of diabetic KK-Ay mice and C57BL/6J mice. Two types of Ca²⁺ channel activities, L-type and store-operated Ca²⁺ (SOC), were evaluated using whole-cell patch-clamp recording. The glucose induced Ca²⁺ influx was measured by a non-invasive micro-test technique (NMT).

Results  Mitochondria in KK-Ay mice pancreatic beta cells were swollen with disordered cristae, and mitochondrial function decreased compared with C57BL/6J mice. Ca²⁺ channel activity was increased and glucose induced Ca²⁺ influx was impaired, but could be recovered by genipin.

Conclusion  Defective mitochondrial function in diabetic mice pancreatic beta cells is a key cause of abnormal insulin secretion by altering Ca²⁺ influx, but not via Ca²⁺ channel activity.

     

犬小孢子菌微量液基稀释法抗真菌药敏试验的方法学研究

目的对北京儿童医院的头癣患者分离所得的182株犬小孢子菌进行抗真菌药敏试验条件的探索。方法对致病真菌进行取样、培养、鉴定、分离和纯化,经微量稀释法测定8种常见抗真菌药物的最小抑菌浓度,并对原药敏方案进行适当调整。结果受试菌株的接种浓度为1~3×104CFU/mL。除伊曲康唑、联苯苄唑、阿莫罗芬外,使用沙氏液体培养基测定的药物最小抑菌浓度均较使用RPM I-1640液体培养基时药物浓度明显升高。孵育温度为28℃,孵育时间为5 d。结论各种药物的最小抑菌浓度(m in im al inh ib itory concentration,M IC)之间的差异有统计学意义,M38-A方案有较好的重复性和稳定性,可作为一种较好的实验室方法被应用。