大鼠肝细胞的分离及BRL细胞培养上清对原代肝细胞增殖的影响

目的 :研究大鼠肝细胞分离的方法及正常大鼠肝细胞来源的BRL细胞培养上清对原代大鼠肝细胞贴壁和增殖的影响。方法 :采用体外胶原酶 2步灌注法分离大鼠肝细胞 ,台盼兰染色法计算细胞数及细胞活率。以四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法检测不同浓度的BRL细胞培养上清及含体积分数 15 %胎牛血清的普通培养液对肝细胞贴壁和增殖的影响。结果 :平均每只大鼠可获 2× 10 8个肝细胞 ,平均活力 94 .3%。用普通培养液培养肝细胞 ,肝细胞贴壁率低 ;BRL细胞培养上清能明显促进肝细胞的贴壁和生长 ,且有量效关系 (P <0 .0 5 )。结论 :用本法分离的大鼠肝细胞有较高的获取率和活力 ,BRL细胞培养上清能促进正常大鼠肝细胞的贴壁及增殖     

大鼠原代肝细胞的形态和功能

目的 :对分离培养的原代大鼠肝细胞进行形态学观察和功能研究 ,探讨其短期培养内的最佳功能状态 ,以便更好地用于肝细胞移植或生物人工肝 .方法 :采用Seglen胶原酶二步灌流法灌注SD雄性大鼠肝脏 ,获取的肝细胞在含有多种辅助因子的Williams’E培养基中进行培养 .台盼蓝排斥法计算细胞产量和细胞活率 ;光镜下直接或HE染色后动态观察细胞形态学改变 ,透射电镜观察其超微结构 ;并收集不同时期培养上清检测其细胞分泌等功能 .结果 :每只大鼠肝平均可获取 1 .2 1× 1 0 8个肝细胞 ,平均活力为 93.6 % .光镜下可见肝细胞呈多角形生长 ,有双核 ,连接成片状或岛状 .电镜下可见内质网、车轮状线粒体、糖原颗粒、细胞连接及胆小管 .肝细胞功能检测显示LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成功能在 1wk内出现波动性变化 ,第 3日LDH漏出量最低 ,白蛋白分泌及尿素合成功能较好 .结论 :离体培养的 3d原代肝细胞具有较好的功能 ,可能为肝细胞移植和生物人工肝应用的最佳时机     

新生牛血清对大鼠脂肪来源细胞生长的影响

目的探索新生牛血清对大鼠脂肪来源细胞生长状态的影响。方法用新生牛血清代替传统的胎牛血清对脂肪来源细胞进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态,与胎牛血清培养条件下的脂肪来源细胞形态进行比较。结果新生牛血清培养条件下的大鼠脂肪来源细胞镜下呈短梭形或多角形,与胎牛血清培养的脂肪来源细胞形态相似,但细胞在P2～P3代即出现了衰老趋势。结论新生牛血清对体外培养的脂肪来源细胞的活力有负面影响,可能不适用于脂肪来源细胞的培养。     

不同取材来源肝细胞体外培养的比较

目的：比较体外培养正常成年大鼠,大鼠乳鼠及人胎肝细胞的生物学性能,方法：采用不同的分离方法获取肝细胞进行体外培养,台盼蓝染色法测定细胞活率,MTT法检测细胞增殖活力,通过检测白蛋白分泌反映肝细胞的功能,结果：人胎肝细胞生长活力和蛋白合成功能最佳,乳鼠肝细胞次之,乳鼠肝细胞较人胎肝细胞易传代,成年大鼠肝细胞分离操作方便,但在体外存活时间较短。结论：不同取材来源的肝细胞体外培养性能有显著性差异（P＜0．05）。     

评估无血清培养子宫内膜间充质干细胞的可行性

目的 使用无血清培养基体外分离扩增子宫内膜间充质干细胞,研究其生物学特性.方法 比较在无血清培养基中和含10%胎牛血清培养基中子宫内膜间充质干细胞细胞形态细胞表型、增殖能力、细胞活率和分化能力等生物学特性.结果 无血清培养基和有血清培养基培养的子宫内膜间充质干细胞形态相似,但是前者呈明显的漩涡状生长,更加细长,立体感更强;无血清和有血清培养的子宫内膜间充质干细胞表面标记物均呈阳性;无血清培养的子宫内膜间充质干细胞细胞活率更高、细胞增殖能力更强.结论 无血清培养基能够在体外扩增子宫内膜间充质干细胞,并使其生物学特性(细胞增殖,细胞活率)优于胎牛血清培养的子宫内膜间充质干细胞,且分化能力无改变,可以取代胎牛血清用于细胞治疗,避免有血清培养的干细胞治疗引起的人畜共患病及免疫原性反应.     

银杏内酯对原代培养新生大鼠肝细胞增殖的影响

目的 :探讨银杏内酯对原代培养新生大鼠肝细胞增殖的影响。方法 :P7SD大鼠肝脏组织块用胰蛋白酶消化 ,获取的分离肝细胞植入 2块 2 4孔培养板中 ,每板分成 2组 ,各 12孔 :(1)银杏内酯组加入含 37.5 g/L银杏内酯和 2 0 %小牛血清的 William E培养液 ;(2 )对照组仅加入含 2 0 %小牛血清的 William E培养液。培养板置 37℃、5 %CO2 培养箱中培养。第 8d取其中一块培养板在倒置显微镜下 ,每孔随机取 5个视野行肝细胞计数 ,并检测培养液中白蛋白的含量 ;另一块培养板行 MTT试验。结果 :银杏内酯组肝细胞数量较多 ,在放大 40 0倍的情况下 ,每视野 2 14 .8± 2 0 .2 ,白蛋白含量为 3.5 5± 0 .2 3g/L,MTT试验的 OD值为 0 .380± 0 .0 17;而对照组中肝细胞数量较少 ,每视野 176 .4± 2 4.4,白蛋白含量为 3.0 8± 0 .2 4g/L,MTT试验的 OD值为 0 .339± 0 .0 2 3。t检验表明 ,上述指标两组间的差异均具有显著性意义 (P均 <0 .0 1)。结论 :银杏内酯具有促进体外培养肝细胞增殖的作用 ,从而使培养液中白蛋白含量和 MTT试验 OD值增高。     

乳兔和成年兔肝细胞体外分离及培养的比较研究

目的 研究比较体外分离培养乳兔和成年兔肝细胞增殖活性及功能。方法 采用非灌注胶原酶消化法分离乳兔和成年兔肝细胞,比较细胞产率和细胞活率,均采用DMEM培养液（含10%胎牛血清）培养,计数法观察原代细胞增殖变化,MTT法观察传代细胞增殖情况,检测培养液中白蛋白含量变化。培养过程采用相差显微镜进行形态学观察,培养细胞采用PAS染色法鉴定。结果 分离收获乳兔肝细胞较成年兔肝细胞数目多,活率高。培养过程中,乳兔肝细胞较成年兔肝细胞折光性好,生长快,增殖能力强,培养液上清蛋白含量高并且增长速度较快,具有统计学意义。PAS染色观察,乳兔和成年兔肝细胞胞质中充满大量糖原颗粒,两者差异无显著性。结论 乳兔肝细胞比成年兔肝细胞,更加适合体外培养研究。     

三明治构型大鼠原代肝细胞长期培养及生物学特性的研究

目的观察三明治构型大鼠原代肝细胞长期培养的形态学变化,并对其功能进行测定。方法采用改良原位2步法门静脉胶原酶灌注分离单肝细胞,台盼蓝拒染实验观察细胞活力,利用三明治培养构型培养成年大鼠原代肝细胞,倒置显微镜下连续观察肝细胞的形态学变化,定期收集培养细胞上清液,检测培养肝细胞的分泌及合成功能,并与单层胶原培养肝细胞比较。结果平均每个鼠肝可获取2×108~3×108个肝细胞,活率在(93±3)%;体外肝细胞培养第3天,清蛋白分泌功能、尿素合成能力恢复到最佳状态。三明治构型培养的肝细胞清蛋白分泌功能、尿素合成能力在培养的14d内始终维持较高的水平,并形成肝索样结构,伴胆小管网络形成,肝细胞形态维持达28d以上。结论三明治构型肝细胞培养体系更接近于肝细胞体内生长环境,肝细胞可在较长时间内保持良好的形态结构和功能,三明治构型不仅可以应用于肝细胞的基础研究,而且为肝细胞移植和生物人工肝治疗肝衰竭奠定了一定的基础。     

大鼠原代培养肝细胞的生物学特性研究

目的 :观察培养的原代大鼠肝细胞形态学和功能的动态变化 ,探讨其短期培养内的最佳功能状态。方法 :采用Seglen胶原酶二步灌流法分离肝细胞。光镜、透射电镜和免疫组化方法观察细胞形态学改变 ;并收集不同时期培养上清监测生化指标的改变。结果 :平均每只大鼠肝获取 1.2 1× 10 8个肝细胞 ,平均活力为 93.6 %。光镜下见肝细胞生长良好 ,可存活 3周 ,电镜下可见丰富的细胞器 ,细胞连接及胆小管 ,细胞角蛋白 18强阳性表达。肝细胞功能检测白蛋白分泌及尿素合成功能在第 3,4天时较好。结论 :肝细胞的形态和功能具有一致性 ,原代肝细胞在培养第 3,4天功能较好 ,可能为肝细胞移植和生物人工肝应用的最佳时机。     

新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养

[目的]建立新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞体外培养的方法.[方法]选用出生后24 h内的SD大鼠,分离大鼠大脑皮质细胞,加入含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养,于倒置相差显微镜下观察细胞生长形态;取传代培养的第3代细胞,采用计数板计数法和四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长情况.[结果]从新生大鼠大脑皮质分离的细胞生长旺盛,星形胶质细胞形态典型,未见其他种类细胞生长.[结论]建立了一种简单易行的大鼠星形胶质细胞体外培养方法.     

分离、鉴定与培养大鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞

目的：建立稳定的同时分离原代大鼠肝细胞（HC）、肝星状细胞（HSC）和Kupffer细胞（KC）的方法,并初步评估其在体外培养的特征。方法：通过胶原酶原位灌注获得肝脏单细胞悬液,随后行等密度离心结合选择性贴壁纯化肝脏原代细胞,细胞的产量和活力经自动细胞计数仪计算出,纯度经免疫荧光、特殊染色及吞噬等实验进行鉴定。结果：大鼠原代HC产量为（21.0±8.2）×106/g肝组织,活力为92.1%±2.1%,纯度为96.5%±2.2%;原代HSC产量为（2.5±0.8）×106/g肝组织,活力为90.1%±3.8%,纯度为93.1%±1.5%;原代KC产量为（4.1±1.2）×106/g肝组织,活力为96.2%±2.7%,纯度为95.1%±1.4%。分离的HC、HSC和KC适合体外长期培养。HSC在体外培养过程中失去维生素A,逐渐向成纤维细胞表型转变。KC在体外可增殖,至14 d时仍表达CD68,具有较强的吞噬能力。结论：成功建立同时分离和培养大鼠HC、HSC和KC的方法,为进一步研究肝脏病理生理提供细胞基础。     

大鼠肝细胞分离、原代培养及生物学特性研究

目的 :探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法、原代培养肝细胞的生物学特性。　方法 :以SD大鼠作肝细胞供者 ,采用胶原酶消化法分离获取肝细胞 ,并进行原代培养 ;以锥虫蓝染色法测细胞活力 ,在倒置显微镜下观察肝细胞形态变化 ,采用Beckman全自动生化分析仪检测各培养体系不同时间培养上清中Albumin、LDH、Urea的含量。　结果 :胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整、贴壁良好、活性高、功能强。LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成功能在 1周内出现波动性变化 ,第 3天时LDH漏出量最低 ,白蛋白分泌及尿素合成功能较好。　结论 :胶原酶消化法为一较好的肝细胞分离方法 ,分离的肝细胞在培养第 3天功能最佳     

不同剂量抗纤复方药物血清对正常大鼠肝细胞增殖与活力的影响

目的 :探讨大鼠给予不同剂量抗纤复方药物后其血清对体外培养正常大鼠肝细胞增殖与活力的影响。方法 :常规培养大鼠肝细胞 ,用 5、10与 2 0倍剂量抗纤复方药物血清分别温育肝细胞 48h ,同时以对照血清作为参照 ,用 [3 H] TdR掺入法测定细胞增殖 ,[3 H] Pro掺入法测定细胞活力。结果 :各剂量组抗纤复方药物血清均能增加肝细胞 [3 H] TdR(2 0 %的 2 0倍剂量组除外 )和 [3 H] Pro掺入量 ,其中 10 %的 10倍剂量抗纤复方药物血清作用最满意。结论 :抗纤复方药物血清能促进正常肝细胞增殖和活力 ,最佳剂量为 10倍剂量。     

介绍一种简易高效的大鼠原代肝细胞分离方法

目的介绍一种简易高效的大鼠原代肝细胞分离方法。方法在Selgen两步胶原酶灌注法基础上加以改进,进行大鼠原代肝细胞分离。结果平均每只成年SD大鼠获取（1.56±0.31）×10^8个肝细胞,平均肝细胞活率（95.1±4.2）%,平均肝细胞纯度98%。结论本试验介绍方法简便易行,且肝细胞产量高、活力好、纯度高,适宜在一般条件实验室推广应用。     

原代培养大鼠肝细胞分离方法的比较研究

目的 探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法。方法 以Ｗｉｓｔａｒ大鼠做为肝细胞供体,分别采用直接分离法与胶原酶消化法分离获取肝细胞并原代培养;以台盼蓝染色法测细胞存活率,在位相关倒置显微镜下观察细胞形态变化,ＭＴＴ法测培养细胞活性,并检测不同时期培养上清液中白蛋白的含量。结果 直接分离法获取的肝细胞活性及功能欠佳,而胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整,贴壁良好、活性高、功能强。结论 经胶原酶消化分     

琼脂支架上兔肝细胞的生长

目的　研究兔肝细胞在琼脂支架上的生长情况。方法　将营养琼脂、小牛血清、抗生素按一定比例制成固体支架,取乳兔肝细胞,作原代培养,观察细胞在固体支架上生长繁殖情况。结果　兔肝细胞能够在琼脂支架上生长。结论　以营养琼脂、胎牛血清、抗生素按一定比例制成固体支架,可以用来培养动物软组织细胞。     

体外培养海马神经干细胞的分化及超微结构观察

目的：研究胎鼠海马神经干细胞（NPCs）体外培养方法、了解其分化及超微结构特点．方法：分离胎鼠海马NPCs,应用机械分离法将海马组织制成单细胞悬液,用含有bFGF和EGF的无血清培养基培养,传代后用含血清培养基促分化,免疫细胞化学方法对NPCs及其分化后的子代神经细胞进行鉴定,并在电镜下观察分化后细胞的形态结构特征．结果：海马NPCs在无血清培养基中悬浮成球,贴壁后,细胞逐渐从细胞球向周围迁移分化．体外培养胎鼠海马NPCs表达巢蛋白（nestin）,在体外可诱导分化产生分别表达Tuj-1和GFAP的神经细胞．电镜观察到分化后的神经细胞及突起相互间排列、具有各种细胞器结构,可见细胞间紧密连接,完整的突触结构．结论：采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的大鼠胚胎NPCs．     

大鼠卵巢颗粒细胞体外培养及哈蟆油对其增殖功能的影响

目的 采用CCK-8法研究哈蟆油对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响,对比分析哈蟆油含药血清对颗粒细胞的最佳作用浓度和时间,为进一步体外试验奠定基础.方法 选用25日龄未成年雌性SD大鼠,腹腔注射孕马血清,48 h后脱颈处死,收集卵巢颗粒细胞,在DMEM-F12培养液中培养,并通过HE染色和免疫荧光技术对颗粒细胞进行鉴定.25只SD大鼠分为正常对照组、阳性药对照组、哈蟆油低、中、高剂量组,灌胃给药7d后采血并分离血清.将体积分数为10％,20％,40％,80％各组不同浓度的含药血清加入体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞体系中,采用CCK-8法检测各组24、48 h和72 h细胞增殖情况.结果 哈蟆油显著提高了颗粒细胞的增殖能力,有一定的量效和时效关系,随着哈蟆油浓度的增加,其促增殖能力逐渐增强,在作用48 h后,20％浓度体积分数的哈蟆油含药血清组最为显著(P＜0.05).结论 体外建立大鼠卵巢颗粒细胞的培养方法,有助于深入研究哈蟆油等中药对卵巢的作用和机制.     

不同浓度胎牛血清对原代心肌成纤维细胞增殖及分化的影响

目的: 探讨不同浓度胎牛血清体外培养对原代心肌成纤维细胞增殖和分化的影响。方法: 用酶消及差速贴壁法分离并培养SD乳鼠心肌成纤维细胞;采用不同浓度胎牛血清（1%、5%、10%和20%）培养心肌成纤维细胞并观察细胞形态,免疫荧光共聚焦法检测α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）蛋白表达,划痕实验检测心肌成纤维细胞的迁移能力,CCK8实验检测心肌成纤维细胞的增殖能力。结果: 随着胎牛血清浓度升高,细胞形态逐渐变圆,细胞表面积增加,α-SMA阳性细胞比例增加,心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞分化增多,细胞迁移能力增加。高浓度胎牛血清（20%）培养时心肌成纤维细胞增殖能力最旺盛,低浓度胎牛血清（1%）培养时心肌成纤维细胞增殖能力最低,5%和10%胎牛血清培养时心肌成纤维细胞增殖均旺盛。结论: 高浓度胎牛血清培养会导致心肌成纤维细胞分化,5%胎牛血清培养心肌成纤维细胞较10%和20%胎牛血清培养分化程度少,增殖能力较1%胎牛血清好,选用5%胎牛血清培养心肌成纤维细胞较好。     

胶原酶灌注法制备小鼠肝细胞

目的:建立体外培养小鼠肝细胞的实验体系。方法:采用两步原位胶原酶灌注法分离小鼠肝细胞,在RPM I1640培养液中培养。结果:用胶原酶灌注法分离的小鼠肝细胞活率可达90%以上,产量平均为2.8×107,完全满足实验要求。肝细胞在RPM I1640培养液中2 h即可贴壁,48 h内细胞贴壁充分,伸展良好,1周后死细胞增多。结论:胶原酶灌注法成功制备出小鼠肝细胞。