新生大鼠海马神经元的原代培养与鉴定

目的:探讨建立简便高效的大鼠海马神经元原代培养的纯化方法。方法:(1)离体培养新生24 h内SD乳鼠海马神经元,每天在倒置相差显微镜下进行神经元的形态学观察;(2)MTT法检测培养不同时间段神经元的活力变化,并绘制生长曲线;(3)纯化培养9 d神经元利用免疫荧光染色法检测β-微管蛋白Ⅲ(β-tublinⅢ)的表达率。结果:(1)倒置相差显微镜下观察原代培养的海马神经元,刚分离种植时可见神经细胞为圆形,24 h大多数细胞贴壁,3 d细胞突起增大、增粗,培养5~7 d神经元胞体丰满,突起交织成的网络更密集,培养14~16 d后,神经元开始退化;(2)生长曲线结果发现海马神经元体外培养经历了4个时期,即生长潜伏期、对数生长期、平台期、生长停滞期;(3)经β-tublinⅢ鉴定海马神经元纯度为(93.0%±2.5%)。结论:本实验方法步骤简便,可获得纯度较高的海马神经元,为研究与海马神经元相关的疾病提供了实验基础。     

一种大鼠海马神经元的原代培养方法

目的 建立一种简便高效的海马神经元的原代培养方法.方法 无菌环境下取新生SD大鼠(24 h内)海马,清洗、剪碎,以0.25%胰蛋白酶消化,200目滤网过滤,混合培养,约5 d后加入阿糖胞苷抑制神经胶质细胞的生长.采用免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达情况,观察海马神经元形态.结果 海马神经元纯度≥90%.神经元接种3 d后具有典型的形态特征,13～14 d突起形成密集的神经纤维网络,14 d后细胞出现凋亡.结论 本实验方法步骤简便,可获得纯度较高的海马神经元,为研究与海马神经元相关的疾病提供了实验基础.     

SD大鼠海马神经元原代培养及形态学观察

目的：掌握SD大鼠海马神经元体外培养方法,观察神经元形态学特点,测定细胞生长曲线。方法：新生SD乳鼠,剥离海马,胰酶消化,接种,1 d换为Neurobasal培养基;小鼠抗大鼠微管相关蛋白-2、兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶为一抗,免疫细胞化学法计数阳性细胞百分率并显微摄影;1%甲苯胺蓝、苏木精伊红染色。结果：原代培养神经元6~8 h内开始贴壁,培养5~7 d突起增粗增长,连接成网,以多极神经元为主,胞体呈三角形、梭形、椭圆形;MAP-2、NSE染色为棕褐色,经鉴定神经元纯度达90%左右;细胞经历生长潜伏期,对数生长期,平台期;细胞核大而圆,HE染色胞核深蓝色,胞浆红色,胞体中可见尼氏颗粒。结论：相差显微镜下神经元形态多样,MAP-2、NSE染色阳性细胞,HE染色细胞核呈深蓝色,胞浆为红色,尼氏体位于细胞质内,神经突起内少见。     

培养大鼠下丘脑神经元生长规律及免疫细胞化学研究

目的：探讨体外培养胎鼠下丘脑CRH神经元的形态、生长变化规律及CRH的表达变化。方法：取17d胎鼠下丘脑分散培养下丘脑神经元，镜下连续观察神经元胞体直径、突起长度、数目等变化规律，应用免疫组织化学染色方法观察CRH神经元的生长变化规律。结果：培养下丘脑CRH神经元3-6d生长速度最快；7-10d神经元细胞数量、胞体直径、突起长度和CRH染色强度均达高峰；12d以后部分神经元出现退形性改变。结论：培养下丘脑CRH神经元7-10d迅速生长趋于成熟，是神经元机能测试的最佳时期。     

C57BL/6胎鼠大脑皮质神经元体外培养与鉴定

【摘要】目的探讨近交系C57BL／6胎鼠皮质神经元体外培养方法,观察其生长情况,并进行鉴定。方法分离孕17dC57BL／6胎鼠大脑皮质,剪碎吹打,静置取上清液,余组织块以木瓜酶和DNaseI消化,差速贴壁提纯,培养6h后以添加含谷氨酰胺和B27的Neurobasal培养基继续培养,观察其生长情况,并于体外培养3、5d时,以神经元特异性核蛋白（neuronspecificnuclearprotein,NeuN）和微管相关蛋白一2（microtubule-associatedprotein-2,MAP-2）为标志物,用免疫荧光双染法对分离培养的原代细胞进行鉴定。结果体外培养6h细胞已贴壁,少量细胞发出l～3个短小突起;此后神经元相继发出突起、并伸长,与邻近细胞突起互相接触,培养5d突起已互相交织成网;体外培养3、5d的NeuN阳性细胞率分别为（94．1±5．0）％、（95．0±5．6）％;MAP一2阳性细胞率分别为（96．7±2．9）％、（95．6±5．6）％,NeuN、MAP-2阳性细胞率差异无统计学意义（P〉0．05）,NeuN和MAP-2鉴定结果一致性好。结论本方法制备的C57BL／6胎鼠皮质原代神经元纯度高,损伤小,生长发育状态良好,无明显增殖性,可作为神经元体外研究的良好实验材料。     

丝素纤维与海马神经元的生物相容性细胞培养研究

目的:研究丝素与体外培养的大鼠海马神经元的生物相容性。方法:采用制备丝素与SD大鼠胎鼠海马神经元共培养7天,每天倒置显微镜观察,免疫细胞化学染色激光共聚焦显微镜观察、分析。结果:通过光镜观察,发现大鼠海马神经元与丝素纤维共培养3天后,海马神经元附着于丝素纤维,神经突起沿丝素纤维向远处生长、延伸;培养7天后海马神经元形成神经元网络,包绕丝素纤维。免疫细胞化学染色显示附着于丝素上的细胞为神经元。结论:海马神经元沿着丝素纤维包裹生长,提示丝素纤维与海马神经元具有良好的生物相容性。     

成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定

目的观察体外培养成年小鼠海马神经细胞生长情况及其形态学变化.方法获取成年海马组织,制成细胞悬液,接种于培养板,分别于1,3,7,10,13,15 d观察细胞生长情况,用神经元特异烯醇化酶抗体经免疫组织化学染色技术鉴定神经元.结果成年海马神经元接种后1～3 d,有较多的杂质和部分细胞漂浮,贴壁细胞较少量.每隔3 d半量换液后,杂质不断减少,但第1周细胞生长缓慢,第7～10 d才见细胞生长良好.培养15 d后,大部分细胞出现有明显的颗粒等早期退化征象.免疫组化染色证实培养细胞呈现神经元特异烯醇化酶染色阳性染色,免疫阳性产物主要分布于细胞质;证明是神经元.结论体外培养成年海马神经元早期生长缓慢,7～10 d才显示良好的生长状态,2周左右细胞则开始退变.提示10 d以前的细胞是供体外研究用的理想细胞.     

一种简单高效的新生鼠海马神经元原代培养方法

【目的】建立一种简单、高效、高纯度的新生小鼠海马神经元的原代培养方法。【方法】取出生24 h内的C57BL/6J新生鼠,分离海马组织,采用胰蛋白酶消化加机械吹打的方法获得单个细胞,用含体积分数1%B27及2%Glutamax-100X、终浓度25μmol/L Glutamate的Neurobasal-A培养基接种培养,3 d后用去Glutamate成分的上述培养基换液,并加阿糖胞苷作用48 h以抑制胶质细胞增长。于倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态,采用微管蛋白相关标志物2(MAP2)及Hoechst33258免疫荧光染色鉴定神经元纯度。【结果】此培养方法获得的海马神经元生长状态良好,细胞形态从接种时的圆形透亮、无突起,到培养第7天后发展为神经元胞体聚集、树突发达并形成纵横交错的神经网络;经鉴定,神经元的纯度高达97.2%以上,且能稳定存活2~3周。【结论】该方法操作简单、高效,所得神经元纯度高,结果稳定。     

ICR胎鼠原代神经元细胞培养及鉴定

目的 建立较理想的胎鼠神经元细胞体外原代培养方法。方法 取13.5 d ICR胎鼠的大脑皮层,经剪碎消化得到单细胞悬液进行培养,观察细胞形态并作PCR及Western blotting等进行神经元相关的基因及蛋白Tuj1和Map2的鉴定。结果 细胞生长状态良好,细胞胞体明显,周围有明亮光晕,细胞突触交错形成网络样,通过PCR及Western blotting验证证明所分离培养的细胞是神经元细胞。结论 本培养方法简单易行,可获得典型和纯度较高的ICR胎鼠大脑皮层神经元细胞。     

脊髓神经细胞的培养及鉴定

目的:探索体外培养原代脊髓神经细胞的方法,为研究脊髓损伤及修复的分子机制、药物作用机制提供前提条件。方法:将妊娠15 d的孕鼠处死后取出胎鼠脊髓,分离出神经细胞作为原代细胞进行培养,观察神经元细胞形态学特征,并采用DAPI和NSE双重染色对所培养细胞进行鉴定。结果:胎鼠脊髓神经细胞在体外培养生长好,纯度高,经免疫荧光鉴定,所培养细胞荧光染色符合神经细胞特点。结论:采用该实验方法进行脊髓神经细胞培养方法简便,纯度高,能满足各种神经科学研究的需要。     

大鼠神经干细胞的培养和鉴定

目的：自新生第1天（P1期）和成年SD大鼠海马和纹状体分离培养神经干细胞。方法：分别分离P1期和成年SD大鼠海马和纹状体组织，制成单细胞悬液，利用无血清培养技术，在添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、表皮生长因子（EGF）和B27的DMEM／F12培养液中进行培养，形成神经球（neurosphere)后每8－10d传代1次，以免疫组织化学方法对原代和传代培养形成的神经球以及原代和传代培养的神经球分化后的细胞进行鉴定。结果：在上述条件下培养及传代的细菌不断分裂增殖，形成悬浮生长的呈巢蛋白（nestin)阳性的神经球；神经球贴壁后分化的细胞表现为神经元和星形胶质细胞的形态，且分别呈神经元特异性烯醇化酶（NSE）阳性和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性。结论：新生及成年SD大鼠的海马和纹状体存在神经干细胞。     

大鼠骨髓间质干细胞脑内移植后分化行为的观察

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)植入大鼠脑内后,在脑微环境作用下的分化行为.方法:梯度离心法分离、培养、纯化MSC,Hoechst33342标记后植入大鼠海马CA4区;1,2,4周后处死大鼠取脑,制作冷冻切片;观察Hoechst33342阳性细胞,免疫荧光法CY3显示神经元特异性烯醇酶(neurone specific enolase, NSE)、神经巢蛋白(nestin)、神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)阳性表达细胞.结果:MSC植入后可见大量细胞存活,沿针道、注射区向周围散在分布,植入细胞有呈红色荧光的NSE,nestin,GFAP及NGF阳性表达细胞.结论:MSC植入动物脑内后能够存活,并分化为神经系统样细胞,表达功能产物NSE、nestin、GFAP及NGF.     

蛛网膜下腔出血后小鼠早期脑损伤海马区神经细胞凋亡的变化

目的探讨蛛网膜下腔出血(SAH)后小鼠早期脑损伤海马区神经细胞凋亡的变化。方法将60只小鼠随机分为正常组、实验组和生理盐水注射组(对照组),实验组30只,对照组24只,正常组6只;实验组与对照组再随机分为3、6、12、24 h和3、7 d 6个亚组。实验组利用制备好的氧和血红蛋白制作蛛网膜下腔出血模型;对照组应用无菌生理盐水代替氧和血红蛋白制作动物模型。应用免疫组织化学法检测3组海马区神经元特异性烯醇化酶(NSE)及caspase-3的表达情况。结果实验组海马区NSE表达在24 h后开始减少,3～7 d表达明显减少,与对照组和正常组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组海马区caspase-3的表达随时间的延长而增多,12 h后表达量明显增多,但在3 d时略有下降,第7天又继续上升;12 h至7 d各时间段与对照组和正常组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。Spearman等级相关法对NSE和caspase-3的相关性分析显示,二者在海马区表达无相关性(r=0.336 1,P=1.031 7)。结论 SAH后早期脑损伤海马区神经细胞出现凋亡,凋亡细胞与神经元的减少无关。     

戊四氮致痫幼鼠不同脑区脑损伤研究

目的：研究S100B蛋白、碱性髓鞘蛋白（MBP）和神经元特异性烯醇酶（NSE）在戊四氮（PTZ）诱导致痫幼鼠海马、额叶、中脑和血清中的动态改变,评鉴癫痫（EP）造成不同脑区的神经损伤。方法雄性SD幼鼠60只,随机分对照组（10只）和实验组（50只）。实验组腹腔注射（IP）PTZ 50 mg/kg 1次,A组IP生理盐水。根据EP发作分级,0～1级9只视为B组,立即取脑;2级以上发作41只,于EP发作后0 h（C＝10）、6 h（D＝11）、24 h （E＝10）、72 h（F＝10）断头,分别取下海马、中脑和额叶皮质,断头前抽取躯干血。采用ELISA法检测血清和各脑区S100B和MBP ,采用EIA法检测血清和各脑区 NSE值。结果 EP发作后,海马、额叶和血清S100B蛋白、MBP和NSE均明显高于对照组。海马和额叶的NSE峰值出现在中脑NSE之前。各脑区和血清S100B蛋白皆于EP后24 h达高峰,而MBP于EP后72 h达高峰。结论 EP发作可以造成大脑不同脑区神经元细胞、胶质细胞和神经髓鞘的损伤。     

白介素-1β对原代培养海马神经元毒性的研究

目的 探讨IL-β对体外培养的海马神经元活性及合成和分泌脑源性神经营养因子(BDNF)的影响.方法 采用SD新生鼠进行海马神经元原代培养.培养7d的细胞以细胞免疫化学法枪测神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达,计算阳性细胞率.实验分IL-β为0ng/ml的正常组和IL-β为5 ng/ml、10ng/ml、20ng/ml 3个实验组,进行海马神经元无血清培养48 h.采用甲基噻唑基四唑(MTT)试验检测细胞活性,ELISA法检测培养上清BDNF的含量.结果 NSE细胞免疫化学鉴定显示阳性细胞达到90%以上;IL-1β降低体外培养的海马神经元活性,各剂量组按浓度在590nm波长处检测OD值为(0.5585±0.2407; 0.4295±0.1401; 0.4191±0.1050),与正常组(0.9462±0.2972)比较,差异具有显著性(分别为P<0.05,P<0.01,P<0.01 ANOVA);IL-1β降低体外培养的海马神经元合成和分泌BDNF水平,各剂量组显著BDNF含量分别是[(8.65±0.71)pg/ml,(8.90±0.35)pg/ml,(7.90±0.35)pg/ml],与正常组(12.40±1.77)pg/ml比较差异具有显著性(均P<0.05 ANOVA).结论 IL-1β可导致体外培养海马原代神经元的损伤,其机制可能与海马神经元合成和分泌BDNF的减少有关.     

胰岛素诱导低血糖对新生大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的探讨胰岛素诱导低血糖对新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法新生1日龄大鼠禁食24 h后腹腔注射胰岛素50 u.kg-1,血糖值<1.0 mmol.L-1后取脑海马组织在含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和B27的无血清培养基中进行原代和传代培养,并分别对原代和传3代的细胞进行单克隆培养及诱导分化:单克隆培养细胞行巢蛋白(Nestin)免疫细胞荧光染色;诱导分化后的细胞分别行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞荧光染色,计数NSE阳性细胞比例。结果原代组培养细胞与传代组和对照组原代细胞相比生长较快;单克隆培养的细胞均Nestin阳性表达,诱导分化后的细胞分别呈NSE或GFAP阳性表达;原代组的细胞诱导分化为神经元的比例明显高于传代组和对照组(P<0.05);传代组的细胞诱导分化为神经元的比例与对照组传代细胞比较无统计学意义(P>0.05)。结论低血糖能够短暂地促进新生大鼠海马神经干细胞增殖及提高向神经元分化比例。     

慢性应激大鼠抑郁症模型的免疫组织化学和MRI研究

目的:探讨大鼠抑郁症模型海马容积改变的特点及其病理特征。方法:对大鼠抑郁症模型组、治疗组和对照组行MRI检查,测量两侧海马容积,采用免疫组化方法观察抑郁症大鼠模型组和治疗组海马及额叶5-HT、NSE、GFAP的变化。结果:①MRI显示抑郁症大鼠脑纵裂增宽,扩大且左侧海马容积小于对侧;②氟西汀治疗组未见明显海马容积及形态改变;③模型组海马及额叶NSE表达明显减弱,额叶的GFAP表达明显减弱;治疗组NSE及GFAP的表达有明显增强。结论:抑郁症时存在独特的病理变化,在一定程度上支持神经影像学的发现。     

缺氧预处理对不同鼠龄大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨缺氧预处理对不同鼠龄大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响.方法:随机选取新生1天(Q1组)、新生7天(Q7组)、新生14天(Q14组)大鼠各6只,分别缺氧2小时.将各组大鼠海马在无血清培养液中,进行原代、单克隆和传代培养;单克隆培养细胞进行巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色;传三代细胞诱导分化3d后...