牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法的建立及应用

目的建立用于牛源样本中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双重RT-PCR检测方法。方法选择已发表的BVDV 1型和BVDV 2型包含5’UTR区高保守区域基因作为靶基因,分别设计合成引物,建立双重BVDV RT-PCR方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行方法学评价。同时用建立的RT-PCR方法检测了小牛血清、小牛血清去蛋白提取液、脾多肽注射液等41批次牛源性样本和64份牛血浆样本。牛源样本和64份牛临床样本。结果建立的BVDV RT-PCR检测方法与牛副流感病毒III型(BPIV3)、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)均无交叉反应;检测BVDV 1型和BVDV 2型DNA模板最低浓度分别为每微升8.87×10~2拷贝和6.31×10~2拷贝,BVDV 1型和2型c DNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带。应用建立的BVDV RT-PCR方法检测41批次牛源样本和64份牛血浆样本,核酸阳性率分别为14.6%和29.7%。结论建立的BVDV RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源样本携带BVDV核酸的检测。     

仙台病毒RT-PCR检测方法的建立及灰仓鼠中流行情况调查

目的建立仙台病毒(SV)RT-PCR检测方法,并对灰仓鼠仙台病毒感染情况进行调查。方法根据NCBI发表的SV(gi:9627219)基因组序列设计引物,建立RT-PCR方法,对方法的特异性和灵敏性进行验证,并用该方法检测60份灰仓鼠的肺脏样本。结果建立的SV RT-PCR方法显示有较好的敏感性和特异性:以仙台病毒为模板扩增产生197 bp的单一目的条带,经测序比对与NCBI数据库中SV相关序列的一致率为98%,而以猴副流感病毒(SV5)、犬瘟热病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒III型及腮腺炎病毒为对照无任何条带产生;能检出的SVcDNA最低浓度是96.8 ng/mL;用该方法检测60份灰仓鼠,SV的感染率为3.33%(2/60)。结论建立的SV RT-PCR方法可用于实验类啮齿动物动物SV的常规检测,自然条件下灰仓鼠感染SV的问题不容忽视。     

牛冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立特异灵敏的牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)荧光定量PCR检测方法,并对牛源性样本进行筛查。方法根据Genbank中登录的BCV的N基因序列设计Taq Man引物探针,建立基于Taq Man探针法的BCV PCR检测方法,对收集到的牛源样本进行BCV筛查,并对部分阳性样本的PCR产物进行测序鉴定。结果建立了能够特异检测BCV的Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法,其标准曲线相关系数Slope为-3.417,相关系数r2为0.999,,扩增效率Eff为96.195%。该方法检测BCV的敏感度为40 copies。使用该方法检测64份牛肛拭子样本检出率为1.5%,检测33份牛源生物制品检出率为6%,部分阳性样本的PCR产物经测序比对为BCV核酸序列,说明BCV在国内牛群中流行,牛源相关生物制品中有感染BCV的潜在风险。结论经测序验证,建立的方法能够灵敏的检测样本中的BCV核酸,应加强牛源相关生物制品中BCV的监测,避免人感染BCV的潜在风险。     

呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR检测方法的建立

目的建立呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR检测方法,应用于实验动物及人用动物源性材料及生物制品外源Reo3的检测。方法根据已发表的呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3)M1基因序列,设计合成引物。提取Reo3细胞毒RNA,以其为模板,进行PCR扩增。优化反应条件,进行特异性、敏感性、重复性试验。结果建立的Reo3RT-PCR检测方法特异、敏感、稳定。以Reo3 RNA逆转录产物为模板,所能检测RNA最小模板浓度为0.42pg/μL,可检测病毒最小滴度为10-9/mL。结论建立的呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR检测方法可用于实验动物及人用动物源性材料及生物制品外源Reo3的检测。     

常见腹泻病毒的多重荧光RT-PCR检测方法的建立及临床应用

目的：建立能同时检测病毒性腹泻病人粪便中星状病毒(Astrovirus)、A族轮状病毒(Group A Rotavirus)、肠道腺病毒(Enteric Adenovirus)、诺如病毒 GI/GII(Norovirus GI/GII)的多重荧光RT-PCR方法。方法：根据各病毒基因组保守性序列设计引物和探针,建立多重荧光RT-PCR检测方法。对建立的多重荧光RT-PCR方法进行特异性、敏感性、灵敏性实验,并使用该法对256份病毒性腹泻粪便标本进行检测,同时使用基因测序进行验证。结果：成功建立常见腹泻病毒的多重荧光RT-PCR检测方法,对星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒以外的病原体不发生扩增反应。该法检测星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒的灵敏度可达500copies/ml。256份标本中：星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒阳性率分别为3.13%( 8/256),42.97%(110/256),9.38%( 24/256),10.16%(26/256),与基因测序方法检测结果符合率达到100%。结论：该多重荧光RT-PCR检测方法具有快速、灵敏、特异的的优点,可用于临床病原诊断。     

柯萨奇B组3型病毒SYBR Green Ⅰ RT-PCR 检测方法的建立

目的 建立一种灵敏、特异的柯萨奇B组3型(CV-B3)病原SYBR Green Ⅰ RT-PCR实时荧光定量检测方法,用于快速、准确地检测CV-B3。方法 设计柯萨奇B组病毒通用引物以及VP1基因的T7启动子特异性引物,以体外转录获得的RNA为标准品,绘制标准曲线,建立CV-B3的荧光定量PCR检测方法;对检测方法的敏感度、特异性、重复性进行评价。结果该检测方法在10～10⁹ 拷贝/微升范围内具有良好的扩增效率和线性关系,最低检测限为10拷贝/微升,标准曲线r2=0.999, 扩增效率为95.7%;且对柯萨奇病毒A组6型(CV-A6)、柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)、肠道病毒71型(EV-71)均无交叉反应,重复性实验变异系数(CV%)<2%。结论 本实验建立的检测方法敏感度较高,同时具备良好的特异性及重复性,可用于CV-B3病原的临床及实验室样本的定性定量检测。     

实时定量RT-PCR检测博尔纳病病毒方法的建立

目的 建立检测博尔纳病病毒(BDV)RNA的实时定量RT-PCR(real-time RT-PCR)方法.方法 设计BDV-p40基因特异性引物和探针,优化反应条件;并以已知的BDV-p40基因扩增产物的克隆为标准品,建立标准曲线;然后对已知BDV RNA进行实时定量RT-PCR的特异性和敏感性检测.结果 建立了特异检测BDV RNA的实时定量RT-PCR技术,并且可以检测到感染细胞中1个拷贝以上BDV RNA.结论 本技术可以直接用于BDV感染的检测和定量分析.     

小鼠脑脊髓炎病毒RT-PCR方法的建立及初步应用

目的 建立小鼠脑脊髓炎病毒RT-PCR方法并对方法进行初步应用。方法 根据NCBI发表的TMEV GD VII株(GI:62039)基因组序列设计特异引物,建立RT-PCR方法,验证方法的敏感性和特异性;脑腔接种方式感染9只BALB/c小鼠,感染后第6天采集动物的脑、心、肝、脾、肺、肾、盲肠内容物和血清等样本,用建立的方法进行检测;同时检测100份小鼠盲肠内容物样本,对方法进行初步应用。结果 以GD VII RNA为模板,建立的RT-PCR方法能够扩增出约371bp的单一目的条带,敏感性验证显示能够检测到的最低GD VII cDNA量为0.69pg/μL;以脑心肌炎病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、日本乙型脑炎病毒、小鼠诺如病毒及正常小鼠脑组织为对照进行方法特异性验证,均未出现目的条带。脑腔接种感染小鼠,所有小鼠在接种第3天均产生不同程度的精神萎靡后肢麻痹等症状,其中2只小鼠于第5天死亡;采集心、肝、脾、肺、肾、脑、盲肠内容物及血清等样本进行检测,所有小鼠的脑组织均检测到GD VII RNA,而其他组织均未检测到;对100份小鼠盲肠内容物进行检测,结果均为阴性。结论 建立的TMEV GDVII株RT-PCR方法能够高效的检测小鼠组织中的病毒感染,可作为实验动物国家标准的有力补充。     

结合内标的小鼠诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的 建立一种快速、特异、敏感的荧光定量RT-PCR检测方法，用于小鼠诺如病毒（Murine Norovirus，MNV）的检测。方法 根据MNV ORF1-ORF2结合区域中保守序列设计一对特异性引物和Taqman探针，同时设计和制备了内标用于监控假阴性，建立含有内标的荧光定量RT-PCR检测体系，通过优化，得到最佳反应体系和反应条件；构建质粒标准品并以之为模板绘制标准曲线；进行特异性、敏感性和重复性试验，最后用建立的方法检测344份小鼠临床样本，验证在临床应用中的效果。结果 该方法特异性强，与小鼠肝炎病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、出血热病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒不发生交叉反应。构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系相关系数R2＝0.9986，可以检测到10拷贝/μL的质粒标准品，对MNV活病毒检测可检测到1.78?0-2 TCID50/mL的病毒，检测灵敏度比常规RT-PCR高10倍，比病毒分离高100倍。对5份样品进行5次批内和批间重复检测，检测结果变异系数均小于2%。通过对344份临床样品检测，检测到阳性样品103份，阳性率29.94%。有5份样本结果为假阴性。 结论 本研究建立的MNV荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好，由于加入了内标, 能有效地监控假阴性的出现，适合用于MNV日常监测、临床诊断和流行病学调查。     

荧光定量RT-PCR在轮状病毒检测中的应用

目的:建立轮状病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,用于检测临床腹泻样本。方法:使用Taqman探针技术,建立轮状病毒VP6特异的荧光定量RT-PCR体系。与WHO推荐的轮状病毒检测方法ELISA平行检测,对该体系的检测范围、灵敏度、特异性等参数进行评价。并将该体系用于临床腹泻样本。结果:该荧光定量RT-PCR体系具有高度灵敏度和特异性,线性范围宽,最低可检出1TCID50/ml。对113份临床腹泻样本的平行检测结果显示,该荧光定量RT-PCR体系与ELISA的检出率差异无统计学意义(χ2=0.41,P>0.5),可同样用于临床样本检测。结论:成功建立了轮状病毒荧光定量RT-PCR体系,该体系灵敏、特异、重复性好,可用于临床检测。     

蚊媒体内登革病毒的快速分型检测

目的：建立一种用于蚊媒体内登革病毒(DEN)快速检测和分型的实验方法。方法：利用标记地高辛(Dig)的登革病毒通用引物进行RT-PCR扩增蚊媒体内的病毒RNA，然后以反向斑点杂交法检测病毒扩增片段并进行分型。结果：RT-PCR可扩增出预期的DEN基因片段，杂交检测和分型结果特异，易于判断，可测出3pg的病毒RNA。结论：该方法灵敏、特异、稳定性好，可用于登革病毒分型及混合感染的检测，4h左右即可获得结果，为早期快速诊断蚊媒体内的登革病毒提供了一种可靠方法。     

大鼠细小病毒双重PCR检测方法的建立

目的 建立快速检测大鼠细小病毒的PCR方法.方法 根据大鼠细小病毒基因序列的特点,建立鉴别检测大鼠细小病-(RPV)与其他三种大鼠细小病毒(H-1、KRV、RMV)的双重PCR方法.根据RPV核酸序列的性质,在VP2基因筛选了一对用于特异扩增RPV株的引物,在NS1基因设计了一对用于特异性扩增H-1,KRV和RMV的引物.结果 两对引物组成的二重PCR方法可以特异性的扩增RPV而不扩增核酸同源性高的小鼠细小病毒和多种其他病原微生物;敏感性实验表明,二重PCR的最低检测限可达1 000拷贝/μL.双重PCR结合测序在检测23份临床样本中,检测出7份RMV阳性,包括1份与RPV共感染阳性样本.结论 本研究建立的检测RPV的双重PCR方法具有特异性好、灵敏度高及操作简单等优点,是一种简便、可靠的检测方法.     

登革热病毒多重荧光PCR检测及基因分型方法的研究

目的 建立一种登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测方法,用于登革热病毒的实验室诊断和基因分型.方法 选取登革热病毒Ⅰ-Ⅳ型病毒保守区设计型特异性引物探针和通用型引物探针,评估多重荧光PCR检测方法的特异性、重复性和检测限;并对20份阳性样本进行检测.结果 20个登革热阳性核酸标本在通用型检测全部为阳性,特异性型别检测发现登革热病毒Ⅰ型10例、登革热病毒Ⅱ型3例、登革热病毒Ⅲ型3例、登革热病毒Ⅳ型4例;20名正常无症状人群标本提取的核酸和HIV、HCV和HEV通用型和特异性型别检测全部为阴性.梯度检测的变异系数均小于5％.对登革热Ⅰ-Ⅳ型病毒检测最低检测限达103 copies/ml.结论 本研究建立的登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测及分型方法具有特异性好、重复性好、快速易操作等优点,可用于登革热病毒的快速检测和基因分型鉴定.     

一种诺如病毒快检试剂盒的评价

目的系统评价一种诺如病毒快检试剂盒的检测性能。方法收集130份非轮状病毒感染的腹泻样本,分别采用德国拜发公司生产的RIDA快速检测试剂盒和检验检疫行业标准中推荐的RT-PCR方法平行检测诺如病毒,统计分析两种方法的检测结果 ,并用RT-PCR测定快检试剂盒的最低检测下限。结果在130例腹泻样本中,快检试剂盒检出21例诺如病毒阳性,检出率为16.2%,RT-PCR检出24例诺如病毒阳性,检出率为18.5%。两种检测方法的符合率为97.7%(127/130),两种方法的检测结果差异无统计学意义(P=0.25),快检试剂盒的最低检测下限可达到1 000拷贝数。结论基于固相膜免疫测定的诺如病毒快检试剂盒具有较高的特异性和灵敏度,可以用于临床病毒性腹泻样本的快速筛检和国境口岸的应急检测。     

三种流感病毒检测方法的比较

目的对胶体金法、病毒分离培养法和荧光定量RT-PCR法等3种检测流感病毒方法和结果进行比较研究,筛选快速准确的检测方法,为流感监测与防控工作提供及时可靠的病原学依据。方法同时采用胶体金法、病毒分离培养法和荧光定量RT-PCR检测法对2012年深圳市龙岗区流感监测哨点医院采集的流感样病例样本进行检测,比较检测结果。结果荧光定量RT-PCR的流感病毒核酸检测阳性率为70.8%,其中98份为季节性H3N2流感病毒,51份为B型Victoria株,4份为B型Yamagata株;病毒分离培养法的阳性率为46.3%,分离出61株季节性H3N2流感病毒,35株B型Victoria株,4株B型Yamagata株;胶体金法检出率为3.7%。3种方法中,荧光定量RT-PCR的阳性率最高,病毒分离培养法次之,胶体金法阳性率最低。结论与病毒分离培养法和RT-PCR法相比,胶体金法并不适合单独用于诊断流感病毒感染,病毒分离培养法费时费力,荧光定量RT-PCR法有较高的敏感性和特异性,适用于流感疫情的病原学快速诊断。     

柯萨奇病毒B5巢式RT-PCR检测方法的建立

目的:建立一种快速、灵敏、特异的柯萨奇病毒B5(CVB5)检测方法。方法:根据GenBank发表的CVB5河南分离株全基因组序列,在其VP1区设计并合成巢式RT-PCR引物,优化PCR反应条件,建立检测CVB5的巢式RT-PCR方法。将已测得TCID50的病毒标准株进行10倍梯度稀释后用上述方法检测,以评价该方法的灵敏性;将5株不同的CVB5毒株和EV71等4株其他肠道病毒毒株及阴性对照用该方法进行扩增,以检测其特异性。用建立的巢式RT-PCR方法对52份病毒性脑炎病例样本进行检测。结果:该方法对CVB5的两轮PCR扩增敏感性分别为10TCID50和10-4TCID50;所有CVB5毒株用该方法扩增结果均为阳性,所选其他肠道病毒扩增结果均为阴性。52份临床病例样本中检出10份CVB5阳性,阳性率为19.23%。结论:所建立的CVB5巢式RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异度。     

猴免疫缺陷病毒(SIV)实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒(SIV)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法 RT-PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796 bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD-SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIV QPCR检测方法,质粒DNA模板在107～102拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3.26,相关系数为0.999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV%均小于1%。结论建立的SIV QPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)核酸拷贝量。     

肺炎衣原体ELISA抗原检测方法的建立和应用

目的 采用ELISA技术,建立肺炎衣原体抗原检测方法.方法 建立酶联免疫吸附法,检测标本中的肺炎衣原体.采用常见的呼吸道病原体进行特异检测.对来自本院的560份临床咽拭子样本和肺泡冲洗液样本进行检测.采用流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒进行特异性评价.结果 本方法对流感病毒(甲型、乙型)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒无特异性反应.对本院的临床样本检出13份,其中咽拭子4份,肺泡冲洗液9份.结论 本肺炎支原体抗原检测方法可用于肺炎衣原体感染的辅助诊断.     

实时荧光定量RT-PCR快速检测四种呼吸道病毒的研究

目的利用实时荧光定量RT-PCR建立快速检测人腺病毒(HADV)、人博卡病毒(HBoV)、人偏肺病毒(HMPV)、人呼吸道合胞病毒(HRSV)等四种呼吸道病毒的方法。方法寻找四种呼吸道病毒的相对保守序列,针对该序列分别设计4对引物对及其相应的Taqman探针,将此保守序列作为目的基因片段,使用一步法RT-PCR试剂盒建立、优化反应体系;采用10倍稀释体外转录RNA,检测建立的体系的灵敏度和重复性并建立反应体系标准曲线;通过临床样本检验体系的特异性。结果 HADV、HBoV、HMPV、HRSV四种病毒的检测灵敏度均为10 copies/μl,标准曲线的决定系数分别为:HADV R2=0.9998,HBoV R2=0.9981,HMPV R2=0.9981,HRSV R2=0.9947和0.9965,扩增效率分别为:HADV 105.08%,HBoV 107.81%,HMPV 102.08%,HRSV FAM荧光106.38%及CY5荧光107.95%。荧光RT-PCR反应体系检测体外转录的RNA的各个拷贝数浓度的变异系数均较低,对临床样本检验的特异性为100%。结论本研究建立的实时荧光定量RT-PCR体系可快速、准确地检测人HADV、HBoV、HMPV、HRSV等四种呼吸道病毒,且重复性较好,特异性高。     

1型HIV感染多重PCR检测方法的建立及临床应用

目的建立检测人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的多重巢式PCR(nPCR)和多重反转录PCR(RT-PCR)方法。将其与已经上市的NASBA法试剂盒进行检测敏感性比较;探讨血浆RNA水平对PCR检测敏感性的影响;评价该方法用于我国HIV-1感染者诊断的价值。方法针对HIV-1的gag、pol和gp41区设计3套引物,建立检测HIV DNA的多重nPCR和检测HIVRNA的多重RT-PCR方法;分别以建立的PCR方法和NASBA法对119例HIV阳性患者进行检测,比较2者的检测敏感性;将患者分为不同的病毒载量组,比较PCR方法在各组患者中的检测敏感性差异;使用建立的PCR方法对10例可疑急性感染者进行检测;扩增HIV-1膜区C2-C3段,对nPCR检测阳性的43例DNA样本进行亚型鉴定。结果多重nPCR的检测敏感度为97.5%(116/119),多重RT-PCR的敏感度为78.2%(93/119),2者的特异度均为100%(50/50),多重nPCR和多重RT-PCR的阳性预测值分别为97.5%(116/119)和78.2%(93/119),阴性预测值均为100%(50/50),准确性分别为98.2%和84.6%。经比较,多重nPCR和多重RT-PCR的检测敏感度都高于NASBA法。在病毒载量<103copy/mL的患者,nPCR的检测敏感性高于RT-PCR,在病毒载量在(103～104)copy/mL的患者及病毒载量≥104copy/mL的患者,2者的敏感性比较相近,均接近100%;检测的10例可疑急性感染者中,有5例患者的nPCR和RT-PCR检测结果阳性,抗体在随访过程中阳转,证实为HIV急性感染者;检测的43例DNA样本分属于B’亚型(37例),AE亚型(5例)和BC亚型(1例)。结论本课题组建立的PCR检测方法可以对我国主要流行的B’、AE和BC亚型病毒株得到很好的扩增效果;nPCR的检测敏感性受血浆RNA水平的影响相对较小,RT-PCR的检测敏感性受血浆RNA水平的影响相对较大;PCR方法可以用于HIV急性感染者的早期诊断。