猴D型反转录病毒巢式PCR检测方法的建立

目的建立SRV-1巢式PCR检测方法并进行初步应用。方法针对SRV-1env基因的保守区序列,设计特异性引物,以感染SRV-1 Raji细胞提取出的含有前病毒DNA的基因组DNA为模板,进行巢式PCR反应。扩增产物测序后与GenBank报道的序列进行同源比对。将DNA样本进行10倍梯度稀释,以检测巢式PCR反应的灵敏度。使用该方法对正常Raji细胞以及感染SIV、STLV的外周血淋巴细胞DNA样本进行扩增,检测该方法的特异性。用建立的巢式PCR方法检测40份储存猴血标本。结果使用巢式PCR扩增出的特异片段经测序分析,结果证实与GenBank报道的序列一致。所建立的巢式PCR检测法检测限度可达1.5×10-3ng/μL,而且方法特异。用此方法检测40份猴血标本,未检测到阳性标本。结论初步建立SRV-1的巢式PCR检测方法,该方法灵敏、特异,为SRV-1的检测提供了一个快速、有效的手段。     

基于定型肠道病毒VP1基因的不同巢式或半巢式PCR评价

目的评价三组基于肠道病毒定型的VP1基因的不同巢式或半巢式PCR方法,建立一种快速、灵敏的分子检测方法用于直接检测临床样品。方法从文献中选出目前常用三组引物,外加一对针对B群肠道病毒改良引物。对代表A群肠道病毒的CVA16毒株和代表B群肠道病毒的CVB5和ECHO20三个毒株分别进行连续10倍稀释至10^-7,对稀释度为10^-3~10^-7的病毒株进行巢式或半巢式PCR。对20份手足口病（HFMD）患儿的粪便样品和16份病毒性脑炎的脑脊液样品进行巢式或半巢式PCR。结果所选三组引物均能检测2.50CCID50/ml CA16病毒;在CVB5和ECHO20检测中,Leitch等设计的引物灵敏度最高,即能够检测含1.12CCID50/ml和1.00CCID50/ml的病毒。在粪便临床样品检测中,Iturriza-Gómara等设计的引物阳性率最高,其中A群肠道病毒检测率为55.0%（11/20）,B群为10.0%（2/20）;而Leitch等设计的引物检测率则为A群为15.0%（3/20）,B群为45.0%（9/20）,其次为Nix等设计的引物检测率为45.0%（其中A群为30.0%,B群为15.0%）,改良的引物为20.0%（4/20）。但脑脊液样品仅有Leitch等设计引物检出,而检出率仅为6.25%（1/16）。结论 Iturriza-Gómara等设计的A群肠道病毒的引物和Leitch等设计的B群的引物组合检测临床样品最佳。     

1起由肠道病毒CA6引起的手足口病聚集性疫情的病原学鉴定

目的对2015年6月开封市1所幼儿园发生的1起由CA6型肠道病毒引起的手足口病聚集性疫情进行病毒型别快速鉴定。方法采集病例及密切接触者的粪便标本,运用荧光定量PCR方法进行总肠道病毒、CA16、EV71和CA6检测,并采用半巢式PC R方法进行肠道病毒VP1序列扩增,对目的条带测序鉴定肠道病毒型别。结果 24例病例24份标本中22份标本检出总肠道病毒阳性,36名密切接触者36份标本中有10人10份标本检出阳性,肠道病毒阳性率分别为91.67%和27.78%,其中分别有22例病例和6名密切接触者CA6阳性,阳性率分别为91.67%和16.67%,所有标本CA16和EV71检测阴性。6例病例和3名密切接触者的9份标本半巢式PCR扩增阳性,测序结果显示VP1序列均为CA6。结论开封市此次发生在幼儿园的1起手足口病聚集性疫情由肠道病毒CA6型引起;荧光定量PCR与半巢式PCR扩增肠道病毒VP1序列能快速准确的鉴定CA6型肠道病毒。     

病毒性脑炎患者肠道病毒71型的分离与鉴定

目的:探讨肠道病毒71型在病毒性脑炎的病原学地位,进而建立快速诊断肠道病毒71型感染的实验室方法。方法:采用病毒分离和半巢式RT-PCR法对88例病毒性脑炎患者的脑脊液进行EV-71检测。结果:88例患者中EV-71病毒分离阳性8例。以病毒核酸为模板进行半巢式RT-PCR反应,结果扩增片断长度为226个碱基对的片段。阳性标本结果与同样条件下来自EV-71病毒BrCr株的分离结果相同。结论:通过病毒分离和半巢式RT-PCR的比较表明,半巢式RT-PCR技术与传统的组织培养法相比,快速、敏感性高且具有相同的特异性。     

用RT-PCR技术检测石蜡包埋组织中的肠道病毒RNA

目的:应用逆转录PCR技术(RT-PCR)在石蜡包埋的心肌组织切片中检测肠道病毒(柯萨奇病毒B3,CVB3)RNA.方法:用Trizol法从石蜡包埋的心肌组织切片中提取CVB3RNA,用适当的引物合成cDNA第一链,从中取出适量进行聚合酶链反应(PCR).PCR结果用琼脂糖凝胶电泳检测并将PCR产物做核苷酸序列分析.阳性对照采用CVB3感染的人羊膜细胞.结果:用RT-PCR技术可扩增出一条约500 bp(540 bp)的核苷酸片段,测序结果表明是CVB3的一个片段.结论:RT-PCR技术应用于长期保存的石蜡包埋的组织切片进行肠道病毒的检测可获得较满意结果,可将RT-PCR技术用于回顾性研究.     

双重实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒方法的建立及应用

目的 建立检测肠道病毒(EV)和肠道病毒71型(EV71)的双重实时荧光RT-PCR法.方法 设计特异性引物和探针,建立双重实时荧光RT-PCR反应体系,绘制标准曲线,对该方法的灵敏度、精密度等进行评价.收集109例临床手足口病患者粪便和咽拭子标本用该法进行检测,并与EV71商品化试剂盒检测结果进行比较.结果 双重荧光PCR法建立的EV和EV71标准曲线相关系数(r)均为0.998;该法检测EV和EV71的灵敏度分别达到0.5 TCID50/mL和0.05 TCID50/mL;检测EV和EV71的批内精密度均小于3％,总精密度均小于或等于4％;对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行检测,显示了良好的特异性.109例临床样本用该法检测出84例EV病毒阳性样本,其中EV71阳性56例,EV71总阳性率为51.4％;与单重荧光PCR商品化试剂盒的检测结果完全一致(P=1.000).结论 建立的双重实时荧光RT-PCR法灵敏度高、稳定性好,对手足口病的早期高通量快速诊断具有重要意义.     

奉化市2010—2013年手足口病病原监测及病毒基因分析

目的探讨手足口病临床病例样本的肠道病毒流行特征。方法收集350例临床诊断为手足口病患者的咽拭子、血浆和粪便标本387份,采用巢式PCR方法进行肠道病毒的检测,对肠道病毒阳性的标本应用测序方法根据5’UTR基因序列进行病毒分型。结果在350例临床诊断病例中,病原学诊断或者核酸检测阳性病例245例,其中男138例,女107例,性别比1.54∶1。387份临床样本中,肠道病毒阳性共217份,检出率为56.1%。245例病原学诊断或核酸检测阳性病例中,人肠道病毒71型(EV71)125例,占51.0%;柯萨奇病毒A组(CVA)16型90例,占36.7%;其他型肠道病毒20例,占8.2%;有10份阳性病例无法鉴定分型,占4.1%。结论奉化市2010—2013年手足口病以EV71及CVA16型为主,其中2010—2012年以EV71为主,2012—2013年以CVA16为主,其他型如CVA4、CVA6、CVA10、CVA12及CVB3等也有发现。     

1型HIV感染多重PCR检测方法的建立及临床应用

目的建立检测人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的多重巢式PCR(nPCR)和多重反转录PCR(RT-PCR)方法。将其与已经上市的NASBA法试剂盒进行检测敏感性比较;探讨血浆RNA水平对PCR检测敏感性的影响;评价该方法用于我国HIV-1感染者诊断的价值。方法针对HIV-1的gag、pol和gp41区设计3套引物,建立检测HIV DNA的多重nPCR和检测HIVRNA的多重RT-PCR方法;分别以建立的PCR方法和NASBA法对119例HIV阳性患者进行检测,比较2者的检测敏感性;将患者分为不同的病毒载量组,比较PCR方法在各组患者中的检测敏感性差异;使用建立的PCR方法对10例可疑急性感染者进行检测;扩增HIV-1膜区C2-C3段,对nPCR检测阳性的43例DNA样本进行亚型鉴定。结果多重nPCR的检测敏感度为97.5%(116/119),多重RT-PCR的敏感度为78.2%(93/119),2者的特异度均为100%(50/50),多重nPCR和多重RT-PCR的阳性预测值分别为97.5%(116/119)和78.2%(93/119),阴性预测值均为100%(50/50),准确性分别为98.2%和84.6%。经比较,多重nPCR和多重RT-PCR的检测敏感度都高于NASBA法。在病毒载量<103copy/mL的患者,nPCR的检测敏感性高于RT-PCR,在病毒载量在(103～104)copy/mL的患者及病毒载量≥104copy/mL的患者,2者的敏感性比较相近,均接近100%;检测的10例可疑急性感染者中,有5例患者的nPCR和RT-PCR检测结果阳性,抗体在随访过程中阳转,证实为HIV急性感染者;检测的43例DNA样本分属于B’亚型(37例),AE亚型(5例)和BC亚型(1例)。结论本课题组建立的PCR检测方法可以对我国主要流行的B’、AE和BC亚型病毒株得到很好的扩增效果;nPCR的检测敏感性受血浆RNA水平的影响相对较小,RT-PCR的检测敏感性受血浆RNA水平的影响相对较大;PCR方法可以用于HIV急性感染者的早期诊断。     

贵阳地区2013年手足口病非 EV71、非 CVA16型肠道病毒的检测分析

目的：了解贵阳地区引起手足口病（HFMD）的非肠道病毒71型（EV71）、非柯萨奇病毒 A（CVA）16型肠道病毒的病原构成及优势型别,为贵阳地区 HFMD 防治工作提供依据。方法收集2013年4～6月检测为非 EV71、非 CVA16型肠道病毒的 HFMD 患者肛拭子标本共107例。提取病毒核酸,用巢式 RT-PCR 法扩增病毒 VP4区序列,对 PCR 阳性扩增产物进行测序,通过与 GenBank 收录的序列 BLAST 比对确定病毒型别;并对优势型别进行序列和进化分析。结果107例标本中共有100例标本巢式 RT-PCR 检测为阳性（93％）,其中100例 PCR 产物测序成功,经 BLAST 比对后,100例标本病毒型别均得到确定：CVA6为46例,CVA10为30例,CVA5为10例,CVA2为6例,CVA3和 CVA4各2例,CVB2和 ECHO16各2例。 CVA6在型别确定的非 EV71、非 CVA16型肠道病毒中占42．99％,为优势肠道病毒型别。结论贵阳地区引起 HFMD 的肠道病毒型别多样,CVA6为非 EV71、非 CVA16型肠道病毒中的优势型别。     

结合内标的小鼠诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的 建立一种快速、特异、敏感的荧光定量RT-PCR检测方法，用于小鼠诺如病毒（Murine Norovirus，MNV）的检测。方法 根据MNV ORF1-ORF2结合区域中保守序列设计一对特异性引物和Taqman探针，同时设计和制备了内标用于监控假阴性，建立含有内标的荧光定量RT-PCR检测体系，通过优化，得到最佳反应体系和反应条件；构建质粒标准品并以之为模板绘制标准曲线；进行特异性、敏感性和重复性试验，最后用建立的方法检测344份小鼠临床样本，验证在临床应用中的效果。结果 该方法特异性强，与小鼠肝炎病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、出血热病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒不发生交叉反应。构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系相关系数R2＝0.9986，可以检测到10拷贝/μL的质粒标准品，对MNV活病毒检测可检测到1.78?0-2 TCID50/mL的病毒，检测灵敏度比常规RT-PCR高10倍，比病毒分离高100倍。对5份样品进行5次批内和批间重复检测，检测结果变异系数均小于2%。通过对344份临床样品检测，检测到阳性样品103份，阳性率29.94%。有5份样本结果为假阴性。 结论 本研究建立的MNV荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好，由于加入了内标, 能有效地监控假阴性的出现，适合用于MNV日常监测、临床诊断和流行病学调查。     

乙型肝炎病毒表面抗原检测的准确性分析

目的探讨乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）检测的安全性和可靠性。方法收集经检查HBsAg阴性的血清983份,采用雅培ArchitectⅠ2000电化学发光仪定量检测HBsAg;巢式聚合酶链反应PCR扩增乙肝病毒S区、C区、X区。诊断为隐匿性乙肝病毒感染者,巢式PCR扩增病毒PreS/S区,产物直接测序并与标准病毒序列对比分析病毒株变异。结果经雅培ArchitectⅠ2000复检HBsAg弱阳性率为6.5%（64/983）,HBsAg滴度中位数为0.17 U/ml;60.9%（39/64）病毒2个区扩增阳性,4.0%（39/983）为隐匿性HBV携带者血清;35.9%（14/39）病毒PreS/S区段扩增阳性,未发现＂a＂决定簇内的变异株。结论目前经常规检测HBsAg为阴性的血液,用敏感性更高的试剂仍能检测出HBsAg及HBV DNA。     

多重PCR技术检测病毒性肝炎相关病毒的研究

目的建立一种快速、特异的可同时检测血中多种病毒性肝炎相关病毒的多重PCR方法。方法参照各病毒特异性核酸序列,按多重PCR引物设计的特殊要求设计引物,以核酸测序确证扩增产物,用标准病毒株及临床阳性血清样本DNA、RNA为模板优化PCR反应体系和反应条件,建立病毒性肝炎相关病毒多重PCR检测方法。应用建立的多重检测方法对120例ALT升高的血清标本进行多重检测,并将检测结果与单一PCR检测结果进行比较。结果采用多重PCR技术可同时对EBV、TTV、HBV、HSV 4种DNA病毒进行扩增;采用多重RT-PCR技术可同时对Cox-V、HEV、HCV 3种RNA病毒进行扩增。各病原体单一及多重扩增条带均清晰、均一,无非特异性扩增条带,片段长度与理论值一致;核酸测序证实各扩增产物属各病原体特异性基因片段。临床标本检测多重感染率为19.2%,与单一检测结果一致。结论建立的多重PCR检测方法稳定可靠,敏感度、特异度好,适用于病毒性肝炎相关病毒的实验室诊断与临床筛查。     

心肌炎和克山病患者分离的肠道病毒核酸序列

目的分析自心肌炎和克山病患者分离的肠道病毒的核酸序列,探讨病毒病因的分子基础。方法使用肠道病毒特异引物对从心肌炎和克山病患者分离的肠道病毒RNA进行RT-PCR扩增,PCR产物经纯化后分别经不同的引物正反向直接核酸循环测序,并应用SeqEd和DNA软件及Assem blyLIGN软件对测序结果进行分析。结果确定7株病毒5＇端从核苷酸位点40到750之间710 bp基因序列;序列分析结果发现,尽管为同血清型病毒,但其5＇端非编码区基因变异率仍在25％左右,而血清型为柯萨奇B5病毒则高达34.08％,与肠道病毒各血清型之间5＇端非编码区基因变异率无明显差异;对血清型为CVB3的两分离株病毒5＇端基因特殊位点分析,发现与CVB3标准株(Nancy株)比较234位由T→C、690位由C→A。结论确定了所分离到的一些肠道病毒5＇端非编码区基因序列;肠道病毒5＇端非编码区基因与血清型关系不大;CVB3分离株5＇端基因特殊位点变异与致病的关系值得进一步探讨。[全文刊登于中华微生物学和免疫学杂志2001.21(1):21]     

献血员HBsAg筛查的安全性和病毒变异分析

目的探讨国内血站对献血员乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）筛查的安全性和可靠性。方法收集经血站筛查HBsAg阴性的合格献血员血浆983份,用雅培Architect12000电化学发光仪定量检测HBsAg;巢式PCR扩增乙肝病毒S区、C区、X区。诊断为隐匿性乙肝病毒感染者,巢式PCR扩增病毒PreS／S区,产物直接测序并与标准病毒序列对比分析病毒株变异。结果经雅培Architect I2000复检HBsAg弱阳性率为6．5％（64／983）,HBsAg滴度中位数为0．171U／ml;60．9％（39／64）病毒两个区扩增阳性,4．0％（39／983）健康献血员为隐匿性HBV携带者;35．9％（14／39）病毒PreS／S区段扩增阳性,未发现“a”决定簇内的变异株。结论目前经血站常规检测ItBsAg为阴性的合格血液用敏感性更高的试剂仍能检测出HBsAg及HBV DNA。     

深圳地区手足病肠道病毒5'端非编码区部分基因克隆和序列分析

目的:分析深圳地区手足口病病人肠道病毒(EV)5'端非编码区(5'UTR)部分基因序列,了解本地区手足口病病人EV感染的基因型.方法:设计特异性引物,建立检测EV的RT-PCR方法,对临床疑诊为EV感染的病人的粪便和/或咽拭子、脑脊液标本进行检测,并对5例典型手足口病病人中分离株的PCR阳性扩增产物进行克隆和序列测定.结果:分离出的5株EV 5'UTR基因的核苷酸同源性为85.5%～99.3%,与EV71 BrCr原株、CVA9、CVA16和CVB3同源性为86.3%～93.3%.结论:深圳地区手足口病EV 5'UTR与几种常见的肠道病毒血清型同源性均较高,提示可能存在多种基因型的肠道病毒感染.     

多重RT—PCR同步快速检测A型和B型流感病毒

目的　建立特异、敏感、快速、同步检测含漱液中A、B型流感病毒的分子生物学检测方法。　方法　以流感病毒A型保守的M基因和流感病毒B型的NS基因为模板分别设计的两对引物 ,用MRT -PCR同时扩增A型M基因和B型NS基因的片断 ,得到相对应的病毒片段 ,根据扩增出的片段的位置和大小来判断含漱液中A、B型流感病毒分型。　结果　用MRT -PCR从 19株A型流感病毒毒株和 11株B型流感病毒毒株分别特异地扩增出M基因 5 0 1bp的片段和NS基因 13 6bp的片段 ,灵敏度可达 1 6× 10 -5TCID5 0 ;对 2份黑天鹅的咽拭子和肺组织标本均检出A型流感病毒M基因 5 0 1bp的片段。　结论　多重逆转录聚合酶链反应能特异、敏感快速的检测A、B型流感病毒。     

大鼠细小病毒双重PCR检测方法的建立

目的 建立快速检测大鼠细小病毒的PCR方法.方法 根据大鼠细小病毒基因序列的特点,建立鉴别检测大鼠细小病-(RPV)与其他三种大鼠细小病毒(H-1、KRV、RMV)的双重PCR方法.根据RPV核酸序列的性质,在VP2基因筛选了一对用于特异扩增RPV株的引物,在NS1基因设计了一对用于特异性扩增H-1,KRV和RMV的引物.结果 两对引物组成的二重PCR方法可以特异性的扩增RPV而不扩增核酸同源性高的小鼠细小病毒和多种其他病原微生物;敏感性实验表明,二重PCR的最低检测限可达1 000拷贝/μL.双重PCR结合测序在检测23份临床样本中,检测出7份RMV阳性,包括1份与RPV共感染阳性样本.结论 本研究建立的检测RPV的双重PCR方法具有特异性好、灵敏度高及操作简单等优点,是一种简便、可靠的检测方法.     

应用通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒

目的设计通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应(RT-n-PCR),以达到广泛.特异及快速诊断肠道病毒(Enterovirus,EV)感染.方法在EV基因组5'端非编码区(5'-UTR)设计二对通用第物,建立RT-n-PCR检测方法,对3种EV和3种非EV标准株以及165例可疑EV感染的327份临床标本进行检测.结果EV标准株均在电泳中检测到一清晰312bp扩增条带,而非EV标准株则无扩增条带;共有104份标本检测到相应大小扩增条带,阳性率31.8%;147例病例同时检测了粪便和咽拭子,粪便阳性49例,咽拭子阳性44例,其中粪便和咽拭子同时阳性35例,粪便和咽拭子EV阳性比较无显著性差异(P＞0.05).病例总阳性数64例,阳性率38.8%.结论RT-n-PCR可以准确地检测出肠道病毒,特异性强,用时少,同时检测多份标本可以提高EV阳性率.     

2009年湖南省哨点医院手足口病病原学检测与分析

目的 针对2009年湖南省哨点医院手足口病(HFMD)实验室检查结果进行分析,为湖南省HFMD的综合防治提供参考资料. 方法 收集湖南省2009年4～12月份监测哨点医院HFMD病例送检的咽拭子、粪便、疱疹液等标本,用RD、Hep-2细胞进行病毒分离,应用RT-PCR技术检测肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CVA16)、非EV71和CVA16的其它肠道病毒(EV). 结果 374例HFMD患者的551份各类样本中EV71病毒、CVA16病毒、EV71和CVA16病毒以及EV的检出率分别为:35.02%、12.30%、0.27%、25.40%.三种不同型别肠道病毒的在全年中交替变更;病例人群男性高于女性(1.99∶1),其中1～2岁儿童是病例数和重症病例数最多年龄段;52例HFMD重症病例中,EV71的检出率高于CVA16(P<0.01);对不同类型的阳性标本进行病毒分离,共获67份阳性毒株,包括EV71型43株,CVA16型5株,EV型16株,混合毒株3株(EV71+CVA16型1株,EV71+EV型1株,CVA16+EV型1株).不同类型标本的肠道病毒阳性检出率和阳性检出构成差异均有显著性(P<0.05),粪便标本的检测阳性率和分离率最高. 结论 EV71型是2009年湖南省HFMD流行的主要致病病毒,同时也是引起手足口重症病例和死亡病例的主要毒株类型.     

多重巢式和定量PCR联合应用提高SARS病毒检测率

目的寻求一种可靠、可行的对急性严重呼吸道综合征病毒的早期诊断方法。方法应用多重巢式PCR联合荧光实时定量方法，对广州地区91份确诊和疑似病例标本、25份健康志愿者标本同时进行检测。结果25份健康志愿者标本经两种方法检测均为阴性。91份确诊和疑似病例标本经多重巢式PCR方法检测，阳性标本数53例，总阳性检测率58．24％；荧光实时定量PCR检测阳性标本数68例，阳性检出率74．73％；两种方法联合，阳性标本数76例，阳性检出率83．52％。结论多重巢式PCR联合荧光实时定量方法可进一步提高SARS病毒的阳性检出率，也为今后应对可能发生的其它突发性传染病病毒的检测提供分子诊断基础。