Nogo-C对PC12细胞分化和突起生长的影响

目的:利用PC12细胞研究Nogo-C和神经元细胞分化及突起生长的关系. 方法: NGF诱导PC12细胞,利用RT-PCR及免疫荧光技术检测细胞内Nogo-C的表达,并在PC12细胞中过表达Nogo-C,通过细胞计数检测Nogo-C对突起生长的影响. 结果: ① RT-PCR检测到NGF诱导的PC12细胞中有少量Nogo-C的mRNA分子表达;②免疫荧光染色观察到NGF诱导的PC12细胞中有少量Nogo-C的表达;③细胞计数观察到转染Nogo-C后的PC12细胞在NGF诱导后突起增长百分数相对于EGFP组明显增高. 结论: NGF诱导的PC12细胞中有Nogo-C的表达,同时过表达Nogo-C可促进NGF诱导下的PC12细胞的分化以及影响细胞的突起生长.     

PC12细胞诱导分化成神经元样细胞的培养机制研究

目的：研究适宜PC12细胞的培养方法及其在神经生长因子（NGF）作用下的分化效果.方法：PC12细胞培养于F12K培养基中,传代时直接将细胞吹打下来,并用注射器吹散成单细胞悬液;PC12细胞接种于6孔培养板中,并用含NGF 50μg/L的无血清培养基进行诱导分化5d,倒置显微镜下观察细胞的形态特征,Image J软件进行图像分析.结果：PC12细胞生长状态良好,且经NGF作用5d后,细胞体积显著增大,突起增多增长,细胞分化率达（72.60±3.61）％.结论：本实验中对PC12细胞培养的方法简单易行,适用于PC12细胞的培养;NGF能够诱导PC12细胞分化成神经元样细胞,可为神经退行性疾病的研究奠定基础.     

NGF诱导PC12细胞向神经元的分化

目的：研究NGF诱导PC12细胞向神经元的分化情况。方法：实验分为10、20、50和80 μg•L^-1 NGF组及含10%胎牛血清的对照组。不同浓度的NGF组均诱导PC12细胞72 h,在24、48和72 h分别观察细胞的突起长度和细胞最大直径的变化情况;在诱导72 h后利用免疫细胞化学技术,观察不同剂量NGF作用后PC12细胞向MAP2阳性细胞分化的情况。 结果： 20、50和80 μg•L^-1 NGF组MAP2阳性细胞数明显高于对照组,且以50 μg•L^-1 组最为明显（P<0.05）。与对照组比较,加入NGF组分化的细胞其突起和细胞直径明显增长和增大,以50 μg•L^-1 组最为明显（P<0.01）。结论：NGF能够诱导PC12细胞向神经元分化,50 μg•L^-1 的NGF浓度是诱导PC12细胞向神经元分化的最适浓度。     

京尼平固定NGF壳聚糖膜的制备及缓释NGF作用探讨

目的:探讨京尼平固定神经生长因子(NGF)壳聚糖膜(GCN膜)缓释NGF的方法和作用。方法:实验组(GCN膜)采用纯天然生物交联剂京尼平将NGF固定在壳聚糖上,采用壳聚糖固定NGF以后的膜与未分化的PC12细胞共培养法观察细胞生长状态。另设阴性对照组(GC膜)不加NGF,阳性对照组(低血清F12K完全培养基中加入50ng/mlNGF)。结果:GCN膜组的PC12细胞在膜中释放出的NGF作用下突起生长明显,与阴性对照组有显著差异。结论:京尼平固定NGF壳聚糖膜可以有效缓释出具有生物活性的NGF,为临床上损伤神经的修复提供新的可能。     

神经节苷脂GM1对神经生长因子诱导PC12细胞分化的影响

目的 研究神经节苷脂GM1是否介导神经生长因子（NGF）诱导的PC12细胞的分化。方法 采用MTT法、葡萄神经酰胺合成抑制剂（D－PDMP）分析神经节苷脂GM1对NGF诱导的PC12细胞分化的影响。结果 神经节苷脂GM1对PC12细胞的生长无明显的影响，而能够促进NGF对PC12细胞的生长抑制作用；NGF能诱导PC12细胞分化，但NGF无法诱导神经节苷脂缺乏型PC12细胞的分化；在神经节苷脂缺乏型PC12细胞中添加神经节苷脂GM1后，细胞恢复对NGF的反应性。结论 神经节苷脂GM1在NGF诱导的PC12细胞分化过程中发挥重要作用。     

神经生长因子对β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞凋亡的保护作用

目的:研究神经生长因子(NGF)对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导鼠肾上腺嗜咯瘤细胞(PC12)凋亡的作用,从而探讨NGF对阿尔茨海默病的治疗作用。方法:以PC12细胞为神经元的细胞模型,将Aβ和NGF+Aβ分别加入培养的PC12细胞中,采用MTT法观察细胞存活率,相差显微镜观察细胞形态改变,hochest33258观察细胞核变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,比较两组间差异。结果:Aβ组细胞存活率随作用时间延长而下降(P<0.01),胞体变小,轴突退化变形,可见特征性的凋亡细胞核,并检测到典型的凋亡峰;而NGF+Aβ组细胞存活率明显增高,凋亡率明显减少(P<0.01)。结论:一定浓度的Aβ2535能诱导PC12细胞凋亡,NGF对Aβ诱导的PC12细胞凋亡具有保护作用。     

MAPK、PI3K途径在蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞分化的作用

目的 研究丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途径在蛇毒神经生长因子(NGF)诱导PC12细胞分化中的作用.方法 应用蛋白免疫印迹法分析p44/p42MAPK和Akt的磷酸化水平,并利用MAPK抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY294002,观察其对NGF诱导的PC12细胞形态学改变的影响.结果 眼镜蛇毒NGF在10ng/mL即可诱导PC12细胞长出突起,100,1000ng/mL作用明显,呈剂量效应关系;NGF能有效刺激p44/p42MAPK、Akt的磷酸化;分别用特异抑制剂PD98059抑制MAPK活性,LY294002抑制PI3K活性后,NGF诱导的细胞分化均受抑制.结论 蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞的分化作用与p44/p42MAPK和PI3K/Akt途径相关.     

TrkA膜外域各结构域重组蛋白的制备和活性测定

目的:制备有活性的TrkA 膜外域各结构域重组蛋白.方法:用PCR法克隆TrkA膜外域各结构域(分别命名为CLC、Ig1和Ig2)的cDNA片段,然后插入融合表达载体pET-28a(+)中,经测序证实后,转入大肠杆菌BL21中表达,并用亲和层析法进行纯化,用神经生长因子(NGF)诱导PC12细胞株测定TrkA与配体结合的关键结构域(CLC、Ig1和Ig2)活性.结果:成功地用大肠杆菌制备了纯度达90％以上的TrkA膜外域各结构域重组蛋白;NGF+Ig2组PC12细胞突起生长率明显低于NGF组(P<0.05),NGF+CLC、NGF+Ig1组与NGF组相比没有显著差异.结论:Ig2能抑制经NGF诱导的PC12细胞的分化,CLC和Ig1不能抑制PC12细胞的分化.     

牛膝多肽可能通过ERK1/2途径诱导PC12细胞向神经元分化

目的:研究牛膝多肽(ABPP)诱导PC12细胞向神经元分化的作用,初步探讨ABPP作用于PC12细胞的信号转导途径?方法:以体外培养的PC12细胞为研究模型,观察在低血清的情况下不同浓度ABPP(0.25?0.50?1.00 μg/ml)诱导PC12细胞发生的形态学改变?采用免疫荧光细胞化学法,观察神经丝蛋白(NF-H)在ABPP诱导分化的PC12细胞中的表达;采用Western blot法观察ABPP(1.0 μg/ml)加药后不同时间段(0?6?12 h和1?2?3?7 d)和不同浓度ABPP(0.25?0.50?1.00 μg/ml)加药2 d后对PC12细胞ERK1/2活性的影响,同时应用ERK1/2特异性拮抗剂PD98059与ABPP共培养PC12细胞,分析ABPP对PC12细胞的作用与ERK1/2通路的关系?结果:ABPP处理3 d后,部分PC12细胞开始出现神经元样的形态?随着加药时间延长具有神经元样的细胞逐渐增多,到7 d时,可以见到神经生长因子(NGF)和ABPP处理组PC12细胞的突起都显著增多,能形成网络;14 d时,这种现象愈发显著?加药后7 d和14 d,ABPP各浓度组的细胞分化率以及细胞突起长度均明显提高,且存在明显的剂量反应关系?加药第7天和第14天,ABPP高剂量组与NGF组的PC12细胞均出现NF-H标记阳性的分化细胞?ABPP对ERK1/2的激活作用存在明显的量效关系,以1.0 ug/ml作用2 d为最大?当用PD98059抑制ERK1/2的活化时,ABPP对ERK1/2的激活作用被部分阻断?结论:ABPP具有诱导PC12细胞神经元性分化的作用,此作用可能是通过ERK1/2信号转导途径实现的?     

三七总皂甙对大鼠骨髓基质细胞分化为神经样细胞中NGF表达的影响

目的 研究三七总皂甙(Panax notoginseng saponins, PNS)对大鼠骨髓基质细胞(bone marrow strowal cells,BMSCs)分化为神经样细胞中神经生长因子(nerve growth factor,NGF)表达的影响.方法 分离、纯化大鼠骨髓基质细胞(BMSCs),实验分对照组、诱导组、PNS组,分别采用常规培养液,常规培养液加入二甲亚砜(DMSO)、丁羟回醚(BHA)的诱导分化液及含100mg/L PNS的诱导分化液培养;观察细胞形态学变化,采用免疫组化及ELISA法了解细胞Nestin及NGF的表达.结果 骨髓基质细胞体外诱导分化6h即出现形态学变化,表现为细胞胞体呈球形,突起增多,形态类似神经元.免疫组化显示Nestin染色阳性;诱导组、PNS组NGF表达明显低于对照组(P＜0.01),PNS组高于诱导组(P＜0.05～P＜0.01).结论 骨髓基质细胞在体外可以定向诱导为神经细胞,诱导分化后NGF表达下降,PNS可以促进其神经诱导后NGF的表达.     

神经生长因子的提取及其对MGC-803细胞的凋亡作用

目的:从广西眼镜蛇蛇毒中提取神经生长因子(nerve growth factor,NGF)并探讨其对人胃癌MGC-803细胞的生长抑制作用.方法:①粗毒采用Sephadex G75 凝胶过滤及CM Sepharose CL-6B阳离子交换柱进行分离纯化,洗脱峰用大鼠嗜铬神经瘤细胞(PC12细胞)测定活性, 通过SDS-PAGE测定纯度和相对分子质量;②采用MTT法,以NGF浓度分别为7.5、15、30、60、120 mg/L处理人胃癌MGC-803细胞24 h,观察不同浓度NGF对MGC-803细胞的毒性和生长抑制率;③采用AO/EB双重染色法,NGF浓度分别为25、50、75 mg/L,观察不同浓度NGF作用后细胞染色及形态的变化,计算细胞凋亡率;④Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡率变化.结果:①所得NGF为单一组分,SDS-PAGE结果为一条带,相对分子质量约为23 000,对PC12细胞有良好的促进分化作用;②NGF对MGC-803细胞的生长有抑制作用且呈剂量依赖关系,作用24 h的IC50值为49.9 mg/L;荧光显微镜下可观察到凋亡细胞主要特点为:细胞体积缩小,染色质固缩,橘红色荧光增强,各浓度组与对照组的细胞凋亡率比较有明显差异(P<0.01);流式细胞仪检测到早期细胞凋亡率随NGF浓度的增高而增加,各浓度组与对照组的细胞凋亡率比较有明显差异(P<0.01).结论:采用Sephadex G75 凝胶过滤及CM Sepharose CL-6B阳离子交换柱提取得到的眼镜蛇毒NGF能诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡且呈剂量依赖关系.     

神经细胞生长因子诱导的神经元化对PC12细胞紫外线耐受量的影响

目的 评估神经细胞生长因子(NGF)诱导的神经元化对PC12细胞紫外线耐受量的影响.方法 采用10、30、60、80、100、200 mJ/cm2紫外线分别照射经NGF诱导的PC12细胞(研究组)和未经NGF诱导的正常PC12细胞(对照组),照射后继续培养24 h,MTT测定细胞存活率.结果 对照组细胞在辐射强度30 mJ/cm2时开始出现明显的细胞凋亡,研究组细胞在辐射剂量100 mJ/cm2时才出现明显凋亡.结论 NGF诱导的神经化可提高PC12细胞的紫外线耐受量.     

PC12细胞凋亡进程中NGF诱导BimEL表达

目的 调查神经生长因子(NGF)缺乏诱导的PCI2细胞凋亡中Bim EL表达的变化情况.方法 分别用含有NGF或NGF抗体的培养基培养PC12细胞,RT-PCR方法检测BimEL在PC12细胞中的表达变化.结果 拮抗NGF处理的PC12细胞中Bim EL的表达明显大于NGF处理组(P<0.05),而拈抗NGF一段时间后再加入NGF培养的处理组,细胞中Bim EL的表达量少于NGF拮抗组(P<0.05),但却大于NGF处理组(P<0.05).结论 提示NGF可能通过调节Bim EL参与PC12细胞凋亡.     

NGF诱导PC12细胞分化的神经细胞行为观察

目的 :观察PC12细胞分化的神经细胞的分裂、突起延伸、迁徙和分化等细胞行为。方法 :采用Giemsa、甲绿 派郎宁染色和增殖细胞核抗原 (PCNA)免疫组织化学染色方法观察培养的PC12细胞。结果 :培养分化的神经细胞呈现横裂、纵裂等不同方式的无丝分裂像 ;分裂中的神经细胞可呈现形态及化学不对称性 ;分化的神经细胞有明显的细胞迁徙运动和突起延伸。结论 :NGF诱导PC12细胞分化的神经细胞能以无丝分裂方式增殖 ;分化神经元可以通过细胞迁徙、突起延伸及共同胞质桥等方式相连接。     

Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞神经元样分化中作用的研究

【立论依据】 在神经系统的发育和修复过程中,神经元间的细胞通讯在细胞的静息、增殖、分化和凋亡过程的发生发展中发挥着重要作用。细胞间通讯有缝隙连接、膜表面分子接触通讯和化学通讯三种方式,而缝隙连接(GJ)是细胞间直接通讯的唯一方式。缝隙连接蛋白(connexin)是GJ结构和功能的基础,在缝隙连接蛋白家族中,Cx43在中枢神经系统的发育过程中发挥重要作用。功能性缝隙连接(GJIC)是通过缝隙连接在相邻细胞间传递氨基酸、离子、小分子等的一种通讯方式。研究表明,神经生长因子(NGF)可以促进Cx43磷酸化,同时可以诱导嗜铬细胞瘤PC12细胞分化而产生与交感神经元相似的神经元。但是Cx43形成的功能性缝隙连接(GJIC)在NGF诱导PC12细胞分化中的作用尚不清楚。因此,本研究拟阐述Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞分化中的作用。 【设计思路】 本实验拟构建Cx43稳定转染的PC12细胞系,并检测Cx43形成的GJIC的功能。 NGF诱导PC12细胞和Cx43稳定转染的PC12细胞,分析Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞神经元样分化过程中的作用,为神经损伤和修复提供新的研究靶点。 【实验内容】 (1)构建Cx43稳定转染的PC12细胞系;(2)实验分组:NGF诱导PC12细胞组,NGF诱导Cx43稳定转染的PC12细胞组,NGF诱导PC12细胞组+缝隙连接抑制剂(CBX),NGF诱导Cx43稳定转染的PC12细胞组+CBX;(3)形态学观察和NES免疫荧光细胞化学染色检测细胞分化率;(4)Dye Coupling检测Cx43形成的GJIC。 【材料】 PC12细胞;NGF;Cx43真核表达质粒;Cx43引物和抗体;CBX;NES单克隆抗体;FITC-IgG。 【可行性】 本研究前期研究工作通过形态学观察及Image软件测量显示在一定范围内,NGF量的增加可以有效提高PC12细胞的分化水平,课题组成员熟练掌握相关实验的方法和技术;研究室能提供相关的仪器和材料。实验思路清晰,实验过程明确。 【创新性】 本研究应用NGF诱导PC12细胞分化模型,探究Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞分化过程中的作用,从而为神经损伤和修复提供新的研究依据和调控靶点。     

硅纳米材料复合神经生长因子的实验研究

目的:研究硅纳米材料复合神经生长因子的可行性. 方法:将神经生长因子( NGF)复合硅纳米材料. 在含有5%小牛血清和10%马的血清的RPMI-1640溶液中培养PC12细胞. 通过使用细胞浓度测定96水溶液的MTS试验确定由煅制氧化硅纳米材料诱导的PC12细胞的分化. 通过卡玛斯蓝染色显像以最终确定蛋白质( NGF)数量.结果:NGF可以有效的结合到介孔硅纳米材料上,药物有效结合率达到0.93%w/w(6.98%). NGF结合的硅纳米材料更有效的促进了PC12细胞的分化. 结论:该研究证明了硅纳米材料复合NGF后有效的促进了PC12细胞的分化.     

具有神经生长因子缓释功能的聚羟基脂肪酸酯膜片的制备及其对PC12细胞神经分化的研究

目的 制备一种可缓慢释放神经生长因子(NGF)的的高分子复合材料,用于神经组织工程的研究.方法 采用溶剂挥发的方式,将NGF与聚羟基脂肪酸酯(PHA)在有机溶剂中充分混合,再将其倒入圆形玻璃器皿中,形成一个表面和内部都含有NGF的PHA膜,并将纯的PHA膜和浸泡干燥的PHA膜(粘附NGF的PHA膜)作为对照.将上述三种膜分别进行微观形貌(扫描电子显微镜)、水接触角和NGF体外释放的检测.最后,在连续培养6 d后,观察三种膜对PC12细胞的神经分化影响.结果 相对于两个对照组,负载NGF的PHA膜表面形貌更起伏粗糙,有明显的蛋白粘附,也具有最佳的亲水性.同时,负载NGF的PHA膜能连续6天释放出稳定的且有活性的NGF,浓度大于100 ng/mL.负载NGF的PHA膜上的PC12细胞分化明显,在培养第3天时出现神经样细胞的分化表型,长出了轴突,而第6天邻近的几个PC12细胞的轴突相互接触并形成类似神经网结构;其他对照组没有明显现象.结论 成功利用生物材料PHA制备出一种具有NGF缓释功能的生物高分子膜片,并可诱导PC12细胞向神经细胞表型分化.     

NGF诱导PC12细胞分化的神经细胞行为观察

目的：观察PC12细胞分化的神经细胞的分裂、突起延伸、迁徙和分化等细胞行为。方法：采用Giemsa、甲绿-派郎宁染色和增殖细胞核抗原（PCNA0免疫组织化学染色方法观察培养的PC12细胞,结果：培养分化的神细胞呈现横裂=纵裂等不同方式的无丝分裂像;分裂中的神经细胞可呈现形态及化学不对称性;分化的神经细胞有明显的细胞迁徙运动和突起延伸,结论：NGF诱导PC12细胞分化的神经细胞能以无丝分裂方式增殖;分化神经元可以通过细胞迁徙、突起延伸及共同胞质桥等方式相连接。     

红茴香根皮提取液对神经细胞生长和增殖作用的影响

目的探讨红茴香根皮提取液对神经细胞生长和增殖的影响。方法①对未分化的PCI2细胞的促神经生长作用：将未分化的PCI2细胞制成细胞悬液,分成8组：阴性对照组、神经生长因子（NGF）阳性对照组、红茴香根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,以及红茴香根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别与NGF（50彬L）联合用药组。连续3d（24、48、72h）进行光镜观察,计算突起生长细胞（≥2倍细胞直径）占总细胞的百分率。②对NGF分化的PCI2细胞的促增殖作用：取NGF诱导分化的PCI2细胞,分成8组：阴性对照组、NGF阳性对照组、红茴香根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组、以及红茴香根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与NGF（300μg/L）联合用药组。用酶联免疫检测仪测定570nm处的吸光度（OD570）,计算增殖率。结果①促神经生长作用：与阴性对照组相比,提取液各剂量组均能显著促进PCI2细胞突起生长,第2天（48h）诱导分化活性最强,提取液各剂量组与NGF联合应用时,对促进PCI2细胞突起生长有明显的协同作用。②促增殖作用：在有血清培养条件下,红茴香根皮提取液中剂量和高剂量组均对PCI2细胞有明显促增殖作用;在无血清培养条件下,受试药红茴香根皮提取液各剂量组均对PCI2细胞有明显促增殖作用,与阴性对照组比差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论红茴香根皮提取液可能是神经营养因子样物质,具有促神经细胞生长和增殖作用。     

大鼠骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞的实验研究

目的 探讨大鼠骨髓基质细胞（MSCs）体外诱导分化为神经细胞的可行性,为MSCs移植治疗缺血性脑血管病提供实验依据.方法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞,应用bFGF进行预诱导,然后用ATRA和NGF来诱导骨髓基质细胞,观察细胞的形态变化,用免疫组化法检测细胞的NSE和GFAP的表达.结果大鼠MSCs经ATRA和NGF诱导后,细胞的形态发生改变,免疫组化显示部分细胞表达NSE和GFAP.结论骨髓基质细胞可被ATRA和NGF在体外诱导分化为神经细胞和胶质细胞.