京尼平固定NGF壳聚糖膜的制备及缓释NGF作用探讨

目的:探讨京尼平固定神经生长因子(NGF)壳聚糖膜(GCN膜)缓释NGF的方法和作用。方法:实验组(GCN膜)采用纯天然生物交联剂京尼平将NGF固定在壳聚糖上,采用壳聚糖固定NGF以后的膜与未分化的PC12细胞共培养法观察细胞生长状态。另设阴性对照组(GC膜)不加NGF,阳性对照组(低血清F12K完全培养基中加入50ng/mlNGF)。结果:GCN膜组的PC12细胞在膜中释放出的NGF作用下突起生长明显,与阴性对照组有显著差异。结论:京尼平固定NGF壳聚糖膜可以有效缓释出具有生物活性的NGF,为临床上损伤神经的修复提供新的可能。     

TrkA膜外域各结构域重组蛋白的制备和活性测定

目的:制备有活性的TrkA 膜外域各结构域重组蛋白.方法:用PCR法克隆TrkA膜外域各结构域(分别命名为CLC、Ig1和Ig2)的cDNA片段,然后插入融合表达载体pET-28a(+)中,经测序证实后,转入大肠杆菌BL21中表达,并用亲和层析法进行纯化,用神经生长因子(NGF)诱导PC12细胞株测定TrkA与配体结合的关键结构域(CLC、Ig1和Ig2)活性.结果:成功地用大肠杆菌制备了纯度达90％以上的TrkA膜外域各结构域重组蛋白;NGF+Ig2组PC12细胞突起生长率明显低于NGF组(P<0.05),NGF+CLC、NGF+Ig1组与NGF组相比没有显著差异.结论:Ig2能抑制经NGF诱导的PC12细胞的分化,CLC和Ig1不能抑制PC12细胞的分化.     

PC12细胞诱导分化成神经元样细胞的培养机制研究

目的：研究适宜PC12细胞的培养方法及其在神经生长因子（NGF）作用下的分化效果.方法：PC12细胞培养于F12K培养基中,传代时直接将细胞吹打下来,并用注射器吹散成单细胞悬液;PC12细胞接种于6孔培养板中,并用含NGF 50μg/L的无血清培养基进行诱导分化5d,倒置显微镜下观察细胞的形态特征,Image J软件进行图像分析.结果：PC12细胞生长状态良好,且经NGF作用5d后,细胞体积显著增大,突起增多增长,细胞分化率达（72.60±3.61）％.结论：本实验中对PC12细胞培养的方法简单易行,适用于PC12细胞的培养;NGF能够诱导PC12细胞分化成神经元样细胞,可为神经退行性疾病的研究奠定基础.     

波形蛋白影响PC12细胞神经分化的研究

目的 探究波形蛋白分子在PC12细胞神经分化中的作用。方法 用免疫印迹方法检测PC12H和PC12L细胞中波形蛋白的表达情况。用免疫印迹方法检测PC12H细胞和PC12L细胞在NGF处理前后波形蛋白的表达情况。构建波形蛋白干扰质粒,用免疫印迹方法检测该质粒的干扰效果。分别将对照质粒、波形蛋白干扰质粒瞬时转染PC12H细胞,培养0、1、2、3天观察与记录细胞的分化情况,用Image-pro plus软件定量分析这两组细胞的平均神经突长度和含分化神经突细胞的百分比例。结果 PC12H细胞中波形蛋白的表达明显高于PC12L细胞（P=0.000）。NGF处理后PC12H和PC12L细胞中波形蛋白的表达量均增加,且在PC12L细胞中更明显（P=0.000）。波形蛋白干扰质粒能有效地抑制PC12H细胞中波形蛋白的表达（P=0.000）。瞬时转染波形蛋白干扰质粒能有效地抑制PC12H细胞的神经分化,定量分析结果显示干扰组细胞的平均神经突长度和含分化神经突细胞的百分比均明显小于对照组,差异均有统计学意义（P=0.000）。结论 波形蛋白分子可以促进PC12细胞的神经分化。     

硅纳米材料复合神经生长因子的实验研究

目的:研究硅纳米材料复合神经生长因子的可行性. 方法:将神经生长因子( NGF)复合硅纳米材料. 在含有5%小牛血清和10%马的血清的RPMI-1640溶液中培养PC12细胞. 通过使用细胞浓度测定96水溶液的MTS试验确定由煅制氧化硅纳米材料诱导的PC12细胞的分化. 通过卡玛斯蓝染色显像以最终确定蛋白质( NGF)数量.结果:NGF可以有效的结合到介孔硅纳米材料上,药物有效结合率达到0.93%w/w(6.98%). NGF结合的硅纳米材料更有效的促进了PC12细胞的分化. 结论:该研究证明了硅纳米材料复合NGF后有效的促进了PC12细胞的分化.     

神经细胞生长因子诱导的神经元化对PC12细胞紫外线耐受量的影响

目的 评估神经细胞生长因子(NGF)诱导的神经元化对PC12细胞紫外线耐受量的影响.方法 采用10、30、60、80、100、200 mJ/cm2紫外线分别照射经NGF诱导的PC12细胞(研究组)和未经NGF诱导的正常PC12细胞(对照组),照射后继续培养24 h,MTT测定细胞存活率.结果 对照组细胞在辐射强度30 mJ/cm2时开始出现明显的细胞凋亡,研究组细胞在辐射剂量100 mJ/cm2时才出现明显凋亡.结论 NGF诱导的神经化可提高PC12细胞的紫外线耐受量.     

神经生长因子对β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞凋亡的保护作用

目的:研究神经生长因子(NGF)对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导鼠肾上腺嗜咯瘤细胞(PC12)凋亡的作用,从而探讨NGF对阿尔茨海默病的治疗作用。方法:以PC12细胞为神经元的细胞模型,将Aβ和NGF+Aβ分别加入培养的PC12细胞中,采用MTT法观察细胞存活率,相差显微镜观察细胞形态改变,hochest33258观察细胞核变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,比较两组间差异。结果:Aβ组细胞存活率随作用时间延长而下降(P<0.01),胞体变小,轴突退化变形,可见特征性的凋亡细胞核,并检测到典型的凋亡峰;而NGF+Aβ组细胞存活率明显增高,凋亡率明显减少(P<0.01)。结论:一定浓度的Aβ2535能诱导PC12细胞凋亡,NGF对Aβ诱导的PC12细胞凋亡具有保护作用。     

松甙诱导PC12细胞分化及相关信号蛋白激酶

据CMJ报道,大连理工大学刘建辉等将甘松甙与大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞共培养,发现甘松甙能明显提高PC12细胞中有轴突细胞的比例及乙酰胆碱酯酶的活性,诱导PC12细胞神经样分化;同时,该提取物诱导的分化作用能明显地被有丝分裂原激活的蛋     

大鼠坐骨神经切除后人发角蛋白诱导的神经的再生机制

目的 观察人发角蛋白(HHK)诱导坐骨神经再生时的形态学变化,以揭示神经再生机制,方法制备坐骨神经损伤动物模型,植入HHK丝束桥接体,手术后2天、1、2、3、6、9、12周进行组织学观察.结果 术后第2天到2周,大量新生微血管长入HHK植入部位,切除后近远端的施万细胞发生去分化.去分化后的施万细胞沿着HHK丝束表面纵向分裂增殖.术后第3周人发开始降解,HHK周围可见很多巨噬细胞和多核巨细胞,大量增生的施万细胞有规则地排列于HHK丝间,有轴突和大量的微血管出现.术后第6周,在HHK丝周围可见大量新生的神经纤维,其间有微血管分布.术后第9周,人发角蛋白降解显著,再生神经纤维增多,有明显的神经外膜和束膜.术后第12周,实验组人发角蛋白基本完全降解,其部位被新的神经纤维所取代,并已贯通缺损部位,且外观形态接近正常神经.结论 1,HHK对缺损的坐骨神经修复具有良好的桥接作用.2、受损后高度分化的施万细胞通过去分化形成幼稚的施万细胞,其中胞质脱落起着关键作用.3、受损轴突立即发生保护性封闭、脱落.健康轴突形成膨大的带突起的生长锥,生长锥突起上伸出许多丝状生长芽.并与1到多个施万细胞嵌合,它们通过竞争性选择,最后只有一条生长芽可发育成完整的轴突.4、神经纤维屏障膜(神经外膜、束膜及内膜)是由最外侧的血管屏障膜中和束内的微血管间充质细胞演变而成的.总之,施万细胞、神经轴突、神经膜三者的再生模式是自身器官化过程所要求的,它们是同步进行的协调行为.     

神经节苷脂GM1对神经生长因子诱导PC12细胞分化的影响

目的 研究神经节苷脂GM1是否介导神经生长因子（NGF）诱导的PC12细胞的分化。方法 采用MTT法、葡萄神经酰胺合成抑制剂（D－PDMP）分析神经节苷脂GM1对NGF诱导的PC12细胞分化的影响。结果 神经节苷脂GM1对PC12细胞的生长无明显的影响，而能够促进NGF对PC12细胞的生长抑制作用；NGF能诱导PC12细胞分化，但NGF无法诱导神经节苷脂缺乏型PC12细胞的分化；在神经节苷脂缺乏型PC12细胞中添加神经节苷脂GM1后，细胞恢复对NGF的反应性。结论 神经节苷脂GM1在NGF诱导的PC12细胞分化过程中发挥重要作用。     

神经再生素对神经细胞生长影响的实验研究

目的：探讨神经再生素（NRF）对离体培养的PC12细胞、背根神经节细胞、大脑皮层细胞生长影响的分子生物学机制。方法：采用细胞体外培养、半定量RT-PCR、Western blot方法，观察和比较NRF组（添加NRF）、NGF组（添加NGF）和空白对照组（基础培养基）中细胞生存状况及相关基因mRNA及其蛋白水平的表达变化。结果：NRF作用于离体培养的PC12细胞，可促使其分化；作用于背根神经节细胞，GAP-43和NF-L mRNA表达在不同时间呈不同程度的上调；作用于大脑皮层细胞，GAP-43和NF蛋白亦比对照组表达量为高。结论：NRF具有维持细胞生存和促进神经细胞突起生长的作用，并可使神经元GAP-43和NF mRNA表达及其蛋白合成上调。     

人牙周膜细胞条件培养基促PC12细胞分化的作用研究

目的研究牙周组织中是否存在神经生长因子(NGF)的表达。方法采用培养的人牙周膜成纤维细胞(hPDLF)的条件培养基与PC12细胞共培养的方法研究hPDLF是否分泌具有活性功能的NGF。结果在hPDLF条件培养基中培养的PC12细胞长出突起,向神经元样细胞分化。对照组及NGF抗血清培养的PC12细胞仅有少量长出突起。结论本研究通过体外研究初次显示培养的hPDLF分泌NGF蛋白,提示NGF可能作为信号分子在牙周组织损伤愈合过程中的神经再支配中发挥作用。     

红茴香根皮提取液对神经细胞生长和增殖作用的影响

目的探讨红茴香根皮提取液对神经细胞生长和增殖的影响。方法①对未分化的PCI2细胞的促神经生长作用：将未分化的PCI2细胞制成细胞悬液,分成8组：阴性对照组、神经生长因子（NGF）阳性对照组、红茴香根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,以及红茴香根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别与NGF（50彬L）联合用药组。连续3d（24、48、72h）进行光镜观察,计算突起生长细胞（≥2倍细胞直径）占总细胞的百分率。②对NGF分化的PCI2细胞的促增殖作用：取NGF诱导分化的PCI2细胞,分成8组：阴性对照组、NGF阳性对照组、红茴香根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组、以及红茴香根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与NGF（300μg/L）联合用药组。用酶联免疫检测仪测定570nm处的吸光度（OD570）,计算增殖率。结果①促神经生长作用：与阴性对照组相比,提取液各剂量组均能显著促进PCI2细胞突起生长,第2天（48h）诱导分化活性最强,提取液各剂量组与NGF联合应用时,对促进PCI2细胞突起生长有明显的协同作用。②促增殖作用：在有血清培养条件下,红茴香根皮提取液中剂量和高剂量组均对PCI2细胞有明显促增殖作用;在无血清培养条件下,受试药红茴香根皮提取液各剂量组均对PCI2细胞有明显促增殖作用,与阴性对照组比差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论红茴香根皮提取液可能是神经营养因子样物质,具有促神经细胞生长和增殖作用。     

NGF诱导PC12细胞向神经元的分化

目的：研究NGF诱导PC12细胞向神经元的分化情况。方法：实验分为10、20、50和80 μg•L^-1 NGF组及含10%胎牛血清的对照组。不同浓度的NGF组均诱导PC12细胞72 h,在24、48和72 h分别观察细胞的突起长度和细胞最大直径的变化情况;在诱导72 h后利用免疫细胞化学技术,观察不同剂量NGF作用后PC12细胞向MAP2阳性细胞分化的情况。 结果： 20、50和80 μg•L^-1 NGF组MAP2阳性细胞数明显高于对照组,且以50 μg•L^-1 组最为明显（P<0.05）。与对照组比较,加入NGF组分化的细胞其突起和细胞直径明显增长和增大,以50 μg•L^-1 组最为明显（P<0.01）。结论：NGF能够诱导PC12细胞向神经元分化,50 μg•L^-1 的NGF浓度是诱导PC12细胞向神经元分化的最适浓度。     

DJ-1对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护机制研究

目的 探讨DJ-1基因对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤模型的保护机制.方法 用神经生长因子(NGF)将PC12诱导成神经元样分化的细胞株(多巴胺能神经元).用1-甲基-4苯基吡啶离子(MPP+)诱导帕金森病PC12细胞损伤模型,用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性,DHE染色法检测ROS水平变化.Western blot检测DJ-1和TH蛋白表达变化,RT-qPCR检测α-synuclein和凋亡相关基因的RNA水平.用pCDH1-cmv载体过表达DJ-1后检测DJ-1对MPP+环境中细胞的保护作用.用RT-qPCR检测α-synuclein、p53和Bax的表达变化.结果 160μmol/L的MPP+处理18 h后,PC12细胞活性降低,细胞内ROS水平升高,处理48 h后细胞凋亡增加.DJ-1和TH蛋白表达均明显下调,RNA水平上α-synuclein、p53和Bax表达增加.过表达DJ-1能够保护MPP+中的细胞活性,抑制ROS水平升高.α-synuclein以及凋亡基因p53和Bax的表达升高受到抑制,细胞凋亡减少.结论 MPP+作用于多巴胺神经元,可以下调DJ-1和TH蛋白,促进α-synuclein积累ROS水平升高,并使p53和Bax表达增加,导致细胞凋亡增加.DJ-1基因能够能够在MPP+处理时抑制p53和Bax的表达,减少α-synuclein积累,降低细胞内ROS水平,保护细胞免受MPP+引起的损伤.     

深低温停循环下神经生长因子的脑保护作用研究

目的建立一种新的深低温停循环模型,研究深低温停循环（DHCA）对兔大脑皮层、海马组织中神经细胞凋亡情况,探讨DHCA下神经生长因子的脑保护作用。方法健康新西兰大白兔幼兔（0.5 kg）20只,随机均分为2组：实验组（给予生长因子）和对照组（不给予生长因子）。在DHCA前、后不同时间窗监测血清S100β含量,并采用原位末端标记法（TUNEL染色法）观察和测定脑组织神经细胞凋亡的情况。对照分析两组不同时间窗S100β的变化以及神经细胞凋亡的情况。结果实验组幼兔在DHCA后神经细胞凋亡数目显著减少（P〈0.05）,在DHCA后30 min（T2）、1 h（T3）、3 h（T4）、5 h（T5）、12 h（T6）5个时间窗血清S100β蛋白含量明显低于对照组（P〈0.05）。结论给予外源性神经生长因子能明显抑制海马以及皮层神经细胞的凋亡,对深低温停循环后的神经细胞有良好的保护作用。     

MAPK、PI3K途径在蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞分化的作用

目的 研究丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途径在蛇毒神经生长因子(NGF)诱导PC12细胞分化中的作用.方法 应用蛋白免疫印迹法分析p44/p42MAPK和Akt的磷酸化水平,并利用MAPK抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY294002,观察其对NGF诱导的PC12细胞形态学改变的影响.结果 眼镜蛇毒NGF在10ng/mL即可诱导PC12细胞长出突起,100,1000ng/mL作用明显,呈剂量效应关系;NGF能有效刺激p44/p42MAPK、Akt的磷酸化;分别用特异抑制剂PD98059抑制MAPK活性,LY294002抑制PI3K活性后,NGF诱导的细胞分化均受抑制.结论 蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞的分化作用与p44/p42MAPK和PI3K/Akt途径相关.