肝癌细胞乙酰胆碱酯酶表达水平与丙型肝炎病毒感染之间的相互影响

目的 探讨丙型肝炎病毒（HCV）感染对乙酰胆碱酯酶（AchE）表达水平的影响以及细胞内AchE活性的变化对HCV感染的影响。方法 以细胞培养来源的HCV（HCVcc）感染人肝癌细胞系Huh7细胞,用蛋白质印迹法以及实时荧光定量PCR（qPCR）进一步验证HCV感染对AchE表达水平的影响,AchE活性检测试剂盒检测细胞内AchE活性的变化。以AchE抑制剂多奈哌齐和伊托必利处理Huh7细胞,同时用HCVcc感染,通过蛋白质印迹法以及免疫荧光法检测Huh7细胞的HCV感染情况。用针对AchE基因的小干扰RNA（siRNA）转染Huh7细胞,随后用HCVcc感染Huh7细胞,通过蛋白质印迹法和免疫荧光法检测AchE的表达以及HCV感染情况。结果 HCVcc感染Huh7细胞60 h后,AchE蛋白表达水平升高,同时酶活性也增强（P均<0.01）。AchE抑制剂呈浓度依赖性抑制HCV对Huh7细胞的感染（P<0.01）。用siRNA敲低AchE的表达后,HCV对Huh7细胞的感染降低（P<0.01）。结论 HCV感染Huh7细胞能上调AchE的表达并增强AchE活性,AchE表达增加和活性增强都能促进HCV的感染,表明AchE在HCV感染Huh7细胞的过程中起着正反馈增强感染的作用。     

WWP2干扰对Huh7肝癌细胞的增殖、凋亡及细胞周期的影响研究

目的 探讨WWP2对Huh7肝癌细胞系的增殖、凋亡及细胞周期的影响研究。方法 通过实时定量PCR （qPCR）、RNA干扰、流式细胞仪分析细胞周期及凋亡,了解WWP2在Huh7肝癌细胞周期的中作用。结果 在肝癌组织中,WWP2 mRNA水平显著性表达;敲除细胞中的WWP2会抑制细胞增殖、使细胞停滞在G₁期,并诱导细胞凋亡。结论 WWP2有可能通过调控细胞凋亡而促进肝癌细胞生长。     

长链非编码RNA CCAT1在支气管哮喘中的表达及对气道平滑肌细胞的影响

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)结肠癌相关转录因子1(CCAT1)对气道平滑肌细胞的影响。方法 选取2016年10月至2018年10月邯郸市中心医院收治的56例支气管哮喘急性发作期患儿,及56例同期健康体检儿童。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测支气管哮喘患儿和健康儿童血浆lncRNA CCAT1表达水平。Lipofectamine 2000^TM法构建lncRNA CCAT1过表达、低表达人气管平滑肌细胞系(分别记为pc-CCAT1组、si-CCAT1组),同时设置相应阴性对照(分别为pc-NC组、si-NC组),使用qRT-PCR进行验证;CCK-8实验、BrdU实验分别检测细胞活力、增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot检测细胞中B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达。结果 哮喘组儿童血浆lncRNA CCAT1表达高于健康组(P<0.001),pc-CCAT1组细胞中lncRNA CCAT1表达水平高于pc-NC组(P<0.001),si-CCAT1组细胞中lncRNA CCAT1的表达水平低于si-NC组(P<0.05)。48、72、96小时,pc-CCAT1组细胞的OD值高于pc-NC组(P<0.001),si-CCAT1组细胞的OD值低于si-NC组(P<0.001)。与pc-NC组相比,pc-CCAT1组BrdU阳性细胞百分比、细胞迁移率、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05),Bax蛋白表达降低(P<0.05);与si-NC组相比,si-CCAT1组BrdU阳性细胞百分比、细胞迁移率、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05),Bax蛋白表达升高(P<0.001)。结论 支气管哮喘患儿血浆CCAT1表达上调,lncRNA CCAT1参与气道平滑肌细胞的增殖、迁移和凋亡过程。     

长链非编码RNA ATB调控miR-144对胶质瘤迁移和侵袭的影响

目的 探讨长链非编码RNA ATB （lncRNA ATB）调控miR-144对胶质瘤迁移和侵袭的影响。方法 采用qPCR检测lncRNA ATB在胶质瘤组织和癌旁正常组织中的表达差异以及慢病毒si-ATB对胶质瘤细胞的转染效率情况;通过双荧光素酶报告基因进行检测lncRNA ATB和miR-144之间的关系;通过平板克隆实验检测lncRNA ATB对胶质瘤细胞株U87和U251增殖能力的影响;流式细胞术检测lncRNA ATB对胶质瘤细胞株凋亡行为的影响;Transwell实验检测lncRNA ATB对细胞株侵袭能力的影响;裸鼠体内实验检测lncRNA ATB对裸鼠移植瘤的体积和质量的影响情况。结果 胶质瘤lncRNA ATB的表达水平高于癌旁正常组织（P<0.05）,高水平lncRNA ATB患者的生存率低于低水平lncRNA ATB患者;使用si-ATB1和si-ATB2分别转染胶质瘤U87和U251细胞后,lncRNA ATB的表达水平降低;过表达miR-144后,野生型lncRNA ATB的荧光素酶活性受到抑制,对突变型lncRNA ATB的荧光素酶活性影响不明显。转染si-ATB 24、48和72小时后,U87[（186.4±12.4）个比（73.6±8.6）个比（62.6±5.6）个,P<0.05]和U251细胞[（192.2±15.3）个比（63.6±6.3）个比（68.3±7.6）个,P<0.05]和U251细胞的增殖能力低于对照组;lncRNA ATB的下调提高了U87和U251凋亡百分比（P<0.05）;抑制lncRNA ATB后,U87细胞和U251细胞的细胞侵袭能力降低;与对照组相比,si-ATB组肿瘤体积和肿瘤重量均小于或低于对照组（P<0.05）。结论 lncRNA ATB通过调控miR-144的表达促进胶质瘤细胞的生物学行为。     

姜黄素诱导人肝癌细胞系Huh7自噬和凋亡

目的 探讨姜黄素诱导人肝癌细胞Huh7自噬和凋亡的作用,以及抑制自噬对姜黄素诱导凋亡的影响。方法 将姜黄素（5、10、20、40 μmol/L）加入人肝癌细胞系Huh7的培养液中,用CCK-8检测细胞增殖水平变化。Huh7细胞用5~40 μmol/L姜黄素培养48 h,通过蛋白质印迹法检测自噬微管相关蛋白1轻链3（LC3）-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值,免疫荧光法检测自噬小体的形成,评估Huh7细胞自噬水平的变化。通过流式细胞术检测Huh7细胞凋亡情况。加入5 mmol/L自噬抑制剂3-甲基嘌呤（3-MA）和20 μmol/L姜黄素培养Huh7细胞,检测Huh7细胞凋亡水平和自噬水平的变化。结果 CCK-8检测显示姜黄素能抑制Huh7细胞的增殖（P<0.05,P<0.01）,且细胞凋亡率随着姜黄素浓度的升高而上升;蛋白质印迹检测显示加入姜黄素后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值上升（P<0.05,P<0.01）,免疫荧光检测显示加入20 μmol/L姜黄素后自噬小体增多。与单独使用20 μmol/L姜黄素培养的Huh7细胞相比,姜黄素联用3-MA培养的Huh7细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值下降（P<0.01）,自噬小体减少。流式细胞术检测发现5~40 μmol/L姜黄素促进了Huh7细胞凋亡（P<0.05,P<0.01）,而联用3-MA后与单独使用20 μmol/L姜黄素培养相比引起的Huh7细胞凋亡减少（P<0.05）。结论 姜黄素能诱导Huh7细胞凋亡、抑制细胞增殖并促进细胞自噬,抑制自噬能减弱姜黄素对Huh7细胞的诱导凋亡效应。     

AKT抑制剂GSK2141795诱导人肝癌细胞株Huh7凋亡的剂量和时间效应

目的 观察不同药物浓度和作用时间下蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶AKT抑制剂GSK2141795对人肝癌细胞株Huh7凋亡的影响及其剂量和时间效应。方法 分别使用终浓度为0、0.3、1、3、10、30 μmol/L的GSK2141795处理Huh7细胞24 h,同时选择终浓度为10 μmol/L的GSK2141795分别处理Huh7细胞0、2、6、12、24和48 h。利用蛋白质印迹法检测Huh7细胞中AKT、磷酸化AKT^S473（p-AKT^S473）的蛋白表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡情况,qPCR和蛋白质印迹法分别检测细胞中凋亡相关分子Bad、Bcl-2、Caspase-9的表达水平。结果 蛋白质印迹分析结果显示,在0～10 μmol/L范围内,随着GSK2141795终浓度的增加,Huh7细胞中AKT蛋白表达水平逐渐降低,p-AKT^S473蛋白表达水平逐渐升高;在0～24 h范围内,随着GSK2141795作用时间的延长,Huh7细胞中AKT蛋白的表达水平呈降低趋势、p-AKT^S473蛋白的表达水平呈升高趋势;48 h时AKT蛋白和p-AKT^S473蛋白的表达水平较0 h均升高。流式细胞术检测结果显示,随着GSK2141795浓度的增加和作用时间的延长,Huh7细胞的凋亡比例逐渐增加。qPCR及蛋白质印迹分析结果提示Huh7细胞中凋亡效应分子Bad、Caspase-9表达水平逐渐增加,凋亡拮抗分子Bcl-2表达水平逐渐降低。结论 AKT抑制剂GSK2141795能有效抑制AKT蛋白表达,并能通过下游Bad-Bcl-2通路诱导Huh7细胞凋亡,其药物效应呈一定的浓度和时间依赖性。此外,长时间使用GSK2141795刺激Huh7细胞,AKT蛋白表达可再次升高,提示存在负反馈信号环路。     

长链非编码RNA-H19特异性吸附微RNA-760调控nanog基因表达促进非小细胞肺癌细胞增殖和迁移

目的 探讨长链非编码RNA（lncRNA）-H19对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖、迁移的影响及分子机制。方法 收集2015年10月至2016年5月海军军医大学（第二军医大学）长海医院确诊的20例NSCLC患者手术切除的NSCLC组织及相应的癌旁正常组织。通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测NSCLC组织及癌旁正常组织,人NSCLC细胞系A549、NCI-H1299和人正常肺上皮细胞系BEAS-2B中lncRNA-H19的表达。在A549细胞中过表达lncRNA-H19后,采用CCK-8法和Transwell实验分别检测细胞的增殖和迁移能力。利用生物信息学分析预测lncRNA-H19与微RNA（miRNA）-760的结合位点,通过双荧光素酶报告基因实验分析lncRNA-H19对miRNA-760的吸附作用,采用qPCR和蛋白质印迹法分别检测lncRNA-H19过表达对miRNA-760及下游靶基因nanog表达的影响。通过对A549细胞转染miRNA-760模拟剂过表达miRNA-760后,检测过表达miRNA-760对lncRNA-H19促进NSCLC细胞增殖和迁移作用的影响。结果 LncRNA-H19在NSCLC组织和A549、NCI-H1299细胞中均呈高表达,分别与其在癌旁正常组织和BEAS-2B细胞中的表达水平相比差异均有统计学意义（P均<0.01）。与对照组相比,过表达lncRNA-H19后A549细胞的增殖能力增强（P<0.05）、迁移能力提高（P<0.01）。在线数据库starBase v3.0预测分析结果显示lncRNA-H19能特异性吸附miRNA-760。双荧光素酶报告基因检测结果显示lncRNA-H19与miRNA-760之间存在特异性结合。与对照组相比,过表达lncRNA-H19可抑制A549细胞中miRNA-760的表达（P均<0.05）,并促进其下游基因nanog在mRNA和蛋白水平的表达（P均<0.01）。过表达miRNA-760可抑制lncRNA-H19对A549细胞增殖和迁移的促进作用,与lncRNA-H19过表达组相比差异均有统计学意义（P均<0.05）。结论 LncRNA-H19可通过特异性吸附miRNA-760调控nanog基因表达,从而促进NSCLC细胞增殖和迁移。     

lncRNA XIST和miR-124在支气管哮喘患儿外周血单个核细胞中表达关系研究

目的 检测支气管哮喘患儿外周血单个核细胞中长链非编码RNA X染色体失活特异性转录本(lncRNA XIST)、微小RNA-124(miR-124)表达水平,并探讨其临床意义。方法 选取2020年1月至2021年3月因支气管哮喘于河南大学第一附属医院门诊及病房接受治疗168例患儿,其中急性发作期82例(急性发作组)、缓解期86例(缓解组);同期选取84例健康体检儿童作为对照组。实时荧光定量PCR法检测外周血单个核细胞中lncRNA XIST、miR-124水平,肺功能仪检测肺功能指标第一秒用力呼气量(FEV1),酶联免疫吸附法检测炎症因子白细胞介素(IL)-17、IL-1β、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;Pearson法分析支气管哮喘患儿lncRNA XIST、miR-124与肺功能指标、炎症因子水平相关性。结果 与对照组比较,缓解组、急性发作组lncRNA XIST及IL-17、IL-1β、TNF-α水平升高,miR-124、FEV1、IL-10水平降低,差异有统计学意义(P＜0.05);与缓解组比较,急性发作组lncRNA XIST及IL-17、IL-1β、TNF-α水平升高,miR-124、FEV1、IL-10水平降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。支气管哮喘患儿外周血单个核细胞lncRNA XIST与miR-124水平呈负相关(r=-0.668,P＜0.001)。支气管哮喘患儿lncRNA XIST与IL-17、IL-1β、TNF-α呈正相关(P＜0.05),与FEV1、IL-10呈负相关(P＜0.05);miR-124与FEV1、IL-10呈正相关(P＜0.05),与IL-17、IL-1β、TNF-α呈负相关(P＜0.05)。结论 支气管哮喘患儿外周血单个核细胞lncRNA XIST高表达,miR-124低表达,二者可能参与支气管哮喘疾病的发生发展。     

长链非编码RNA CCAT1在肝细胞肝癌中的表达及预后意义

目的 探讨lnc RNA CCAT1在肝细胞肝癌中的表达及其临床意义。方法 采用荧光定量PCR检测检测96例肝癌癌灶组织及癌旁组织中lnc RNA CCAT1的表达情况,并分析与各临床病理因素以及患者预后的相关性。结果 lnc RNA CCAT1在肝癌癌灶组织表达升高;肝癌癌灶组织中lnc RNA CCAT1表达量和门静脉癌栓、TNM分期等因素相关。进一步生存分析发现lnc RNA CCAT1表达阳性者术后平均生存时间（32.1个月,95% CI：26.3~38.0个月）明显短于阴性患者（47.2个月,95% CI：42.5~52.0个月）,差异有统计学意义（χ²=7.607,P=0.006）。并且lnc RNA CCAT1表达是肝癌患者总体生存的独立危险因素。结论 lnc RNA CCAT1表达在肝癌发生、发展中发挥重要作用;lnc RNA CCAT1表达是肝癌患者的独立预后因素。     

lncRNA UCA1对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究

目的 探究长链非编码RNA尿路上皮癌相关基因1（lncRNA UCA1）通过靶向miR-206调控Yes相关蛋白1（YAP1）的表达,介导口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞增殖、凋亡的分子机制。方法 通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测人正常口腔角质细胞系HOK和人口腔鳞状细胞癌细胞株TSCCA、SCCl5、HN13、CAL27、HSC3和SCC9中lncRNA UCA1和microRNA-206（miR-206）的表达;在HN13细胞中敲除IncRNA UCA1,采用CCK-8法和流式细胞术检测其对HN13细胞增殖和细胞凋亡的影响;通过生物信息学网站starBase预测IncRNA UCA1、YAP1与miR-206的互补结合位点,并通过双荧光素酶实验验证它们之间的结合关系;Western blotting检测YAP1蛋白的表达。结果 qRT-PCR结果显示,相比于人正常口腔角质细胞系HOK,6种OSCC细胞中lncRNA UCA1 mRNA相对表达量上调（P <0.05）,而miR-206 mRNA相对表达量均降低（P <0.05）。与转染siNC的对照组相比,siUCA1组细胞活力下降,凋亡比例升高（P <0.05）。生物信息学预测结合双荧光素酶实验证实miR-206与lncRNA UCA1、YAP1均存在互补结合。qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,siUCA1组miR-206 mRNA相对表达量较对照组升高（P <0.05）,YAP1 mRNA相对表达量较对照组降低（P <0.05）,而同时转染siUCA1和miR-206 inhibitor则抑制miR-206表达,恢复YAP1的表达（P <0.05）。结论 lncRNA UCA1在OSCC细胞中高表达,通过抑制miR-206的表达,上调YAP1,从而促进OSCC细胞增殖,抑制凋亡。     

慢病毒介导的FHIT基因过表达调控人肝癌细胞株生长实验研究

［摘要］目的　探讨过表达FHIT基因对FHIT基因含量不一致的人肝癌细胞株HepG2、Hep3B 和 Huh7的增殖、凋亡和细胞侵袭以及细胞周期的影响,以期证实FHIT基因在肝癌细胞株的表达差异与肝癌细胞的分化有密切相关性．方法　体外成功构建pLVX-IRES-FHIT慢病毒重组载体转染FHIT基因含量不一致的肝癌细胞株HepG2、Hep3B 和 Huh7,以MTT法、FCM法、Annexin V/PI双染色法、细胞周期检测技术和Transwell侵袭实验分析过表达的FHIT基因对三系肝癌细胞的增殖活性、凋亡、细胞侵袭性和细胞周期的影响机制及其生物学效应与时间梯度的关系．结果　体外成功构建重组慢病毒载体pLVX-IRES-FHIT转染FHIT含量不一致的肝癌细胞株HepG2、Hep3B 和 Huh7．（1）MTT法检测显示三系肝癌细胞株的pLVX-IRES-FHIT组细胞增殖活性明显降低,且随时间推移细胞增殖抑制效果更为显著,在48 h达到高峰,此后到72 h进入平台期,对照组细胞增殖抑制不明显（P＜0.05）．AnnexinV/PI双染色法检测发现pLVX-IRES-FHIT组三系肝癌细胞48 h凋亡率较对照组差异无统计学意义（P＞0.05）．三系肝癌细胞中对pLVX-IRES-FHIT组转染致FHIT基因过表达抑制增殖活性大小的顺序依次是HepG2＞Hep3B＞Huh7;（2）经过Transwell侵袭实验表明对FHIT基因过表达对三系肝癌细胞的pLVX-IRES-FHIT组侵袭性均有明显的抑制作用（P＜0.05）,而对照组未见明显差异（P＞0.05）．三系肝癌细胞的侵袭性顺序依次为HepG2＞Hep3B＞Huh7;（3）细胞周期检测发现pLVX-IRES-FHIT组G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,增殖指数减低,在HepG2细胞中与对照组间有统计学意义（P＜0.05）,在HepB和Huh7细胞中与对照组间无统计学意义（P＞0.05）．FHIT基因的过表达对三系肝癌细胞的细胞周期影响为细胞周期停滞于S期,且G0/G1期细胞增多的顺序依次是HepG2＜Hep3B＜Huh7．结论　FHIT基因在肝癌细胞株中的表达差异可能与肝癌细胞的恶性分化有密切正相关性,FHIT基因有可能成为原发性肝癌的基因治疗的基因靶标之一．     

lncRNA-135调控miR-592维持小鼠胚胎干细胞多能性

目的筛选并确定调控miR-592作用的关键lncRNA,探讨其对miR-592沉默靶基因cep135的调控作用。方法利用lncRNA基因芯片筛选小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)及KO miR-592 mESCs中差异的lncRNA从而找出关键调控分子lncRNA-135。利用转染试剂干扰lncRNA-135的表达,使用Western印迹法、双荧光素酶报告系统及免疫细胞化学染色等技术检测lncRNA-135对miR-592及其靶基因cep135的表达影响,进而阐明lncRNA-135对mESCs多能性的调控作用。结果lncRNA基因芯片分离确定了527条差异表达的lncRNA,经过生物信息学分析及qRT-PCR验证,确定了评分最高的lncRNA-135为关键作用分子。双荧光素酶报告系统证实了lncRNA-135能够结合miR-592以干扰其沉默靶基因cep135。而Western印迹法和免疫细胞化学染色结果则证实lncRNA-135通过作用于miR-592,阻止其对cep135的抑制作用,进而促进mESCs的多能性。结论lncRNA-135可以通过充当miR-592的“分子海绵”从而调节与mESCs多能性维持有关的多个基因的表达,这将可能帮助建立调控性miRNA网络与mESCs多能性之间的联系。     

Foxg1抑制肝癌细胞血管形成及其机制

目的 通过干扰和过表达肝癌细胞中的Foxg1,探讨Foxg1对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)血管生成能力的影响及其机制.方法 实验分为Hep3B干扰组、Hep3B对照组、Huh7过表达组和Huh7对照组,提取各组细胞条件培养基(conditional medium,CM);通过Transwell实验、管腔形成实验观察各组CM对HUVEC的迁移及管腔形成的影响;采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及Western blot检测血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)在各组肝癌细胞中的mRNA及蛋白水平,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组CM内VEGFA浓度;采用Western blot检测4组肝癌细胞AKT1、p-AKT1的蛋白水平.结果 Hep3B干扰组较Hep3B对照组CM的作用下,HUVEC细胞的迁移数显著增多(P＜0.01),Huh7过表达组较Huh7对照组CM的作用下,HUVEC细胞迁移数显著减少(P＜0.01);Hep3B干扰组CM的作用下,HUVEC细胞管腔形成数多于Hep3B对照组CM(P＜0.01),而Huh7过表达组CM的作用下,HUVEC细胞管腔形成数少于Huh7对照组CM(P＜0.01);Hep3B干扰组较Hep3B对照组VEGFA水平上调,Huh7过表达组较Huh7对照组VEGFA水平下调;Hep3B干扰组CM较Hep3B对照组CM的VEGFA水平上调,Huh7过表达组CM较Huh7对照组CM的VEGFA水平下调(P＜0.01);Hep3B干扰组较Hep3B对照组AKT1磷酸化水平升高,Huh7过表达组较Huh7对照组AKT1磷酸化水平降低.结论 Foxg1抑制肝癌血管生成的过程可能是通过抑制PI3K/Akt通路的激活下调VEGFA的表达来实现的.     

MicroRNA-340在肝细胞肝癌中抑制细胞增殖并促进凋亡

目的 探讨微RNA-340(miR-340)在肝细胞肝癌中的表达特点及其对细胞生物学行为的影响.方法 收集重庆医科大学附属第一医院肝胆外科2015年3月至2016年9月收治的40例肝细胞肝癌患者手术后切除的癌组织和癌旁组织标本.通过qPCR检测组织标本中miR-340的表达,并分析miR-340表达与临床病理学指标的关系.分别培养肝癌细胞株Hep3B、Bel-7402、HepG2和SMMC-7721以及正常肝细胞株HL-7702,48 h后使用qPCR检测5种细胞中miR-340的表达水平.通过转染增加或抑制SMMC-7721细胞中miR-340的表达,然后分别于细胞培养24、48、72 h后采用CCK-8法检测SMMC-7721细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡.通过生物信息学软件预测miR-340的靶基因,并使用qPCR和蛋白质印迹法进一步验证miR-340对靶基因的作用.结果 癌组织中miR-340的表达低于癌旁组织(P＜0.01),并且miR-340的表达与乙肝表面抗原、HBV DNA载量、肿瘤大小以及临床TNM分期有关(P＜0.01).正常肝细胞HL-7702内miR-340的表达高于4种肝癌细胞Hep3B、Bel-7402、HepG2和SMMC-7721(P＜0.05,P＜0.01).增加miR-340表达可抑制SMMC-7721细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01),而抑制miR-340的表达则促进SMMC-7721细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01);增加miR-340的表达可促进SMMC-7721细胞的凋亡(P＜0.01),而抑制miR-340则减少凋亡(P＜0.01).生物信息学分析显示S期激酶相关蛋白2(SKP2)基因是miR-340下游的一个靶基因.qPCR和蛋白质印迹分析结果显示增加SMMC-7721细胞中miR-340的表达可抑制SKP2的mRNA和蛋白表达,抑制miR-340表达则增加SKP2的mRNA和蛋白表达.结论 miR-340的异常表达可能与乙肝病毒的感染有关,其异常表达有助于评价病情以及预后.在肝癌细胞系SMMC-7721细胞中,miR-340能够抑制细胞增殖并促进凋亡,这一作用结果可能是通过miR-340对SKP2的抑制而实现的.     

ErbB-3结合蛋白Ebp1 mRNA在肝癌细胞系中的差异表达及其意义

[目的]观察ErBb-3结合蛋白Ebp1mRNA在人肝癌细胞系中的表达.[方法]培养人肝癌细胞系Hep 3B,Hep G2,Huh7和正常人张氏肝细胞,提取总RNA,以P32标记的Ebp1为探针,18S为内参照,采用Northern Blot法检测Ebp1mRNA的表达水平.[结果]Northern Blot法检测结果示,Ebp1mRNA在人肝癌细胞系中的表达水平明显高于正常肝细胞（P〈0.01）.[结论]人肝癌细胞系中Ebp1mRNA呈高表达.     

程序性死亡配体1在索拉非尼耐药肝癌细胞中的表达和功能

目的 探究PD-L1在索拉非尼耐药肝癌细胞中表达及对其功能的影响。方法 采用浓度递增法构建索拉非尼耐药细胞Hep3B-SR和HepG2-SR,CCK-8法检测IC50并计算耐药系数,Western blot 和qPCR检测耐药基因（P-gp和MRP1）和PD-L1的表达变化。转染siRNA沉默耐药细胞PD-L1的表达并检测沉默效率。沉默PD-L1后,CCK-8法检测IC50并计算耐药系数,检测耐药基因的表达变化,细胞增殖实验检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移,平板克隆形成实验检测细胞克隆形成,流式细胞术检测细胞凋亡。结果 Hep3B-SR和HepG2-SR的耐药指数分别为5.4和5.2。耐药细胞中P-gp、MRP1和PD-L1表达较亲本细胞明显上调（P均﹤0.01）。抑制PD-L1表达后,Hep3B-SR和HepG2-SR的耐药指数分别下降为1.8和1.5,P-gp和MRP1的表达明显下调（P均﹤0.01）,显著抑制耐药细胞的增殖、迁移、克隆形成和促进其凋亡（P均﹤0.01）。结论 PD-L1在索拉非尼耐药肝癌细胞中高表达。抑制PD-L1表达可部分逆转索拉非尼耐药肝癌细胞的耐药性使得索拉非尼的抗癌效果明显提高。抑制PD-L1表达后可有效抑制索拉非尼耐药肝癌细胞生长,合用索拉非尼其抗癌效果更强。     

COX-2 siRNA诱导人肝癌Hep3B细胞凋亡实验研究

目的:观察COX-2在人肝癌细胞Hep3B中的表达及小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默COX-2基因对COX-2 mRNA和蛋白表达、细胞增殖及凋亡的影响。方法:将siRNA-COX-2质粒载体转染Hep3B细胞,WST-8法检测细胞增殖抑制情况,透射电镜观察凋亡小体出现情况;筛选单克隆细胞株Hep3B-sh,采用RT-PCR和Western blotting检测COX-2 mRNA和蛋白情况。结果:siRNA-COX-2能抑制Hep3B细胞的增殖,稳定转染pshRNA-COX-2可使Hep3B细胞中COX-2 mRNA及蛋白的表达明显减弱(P<0.01);透射电镜下可见凋亡小体出现,发生凋亡细胞数增加。结论:COX-2siRNA能有效抑制肝癌Hep3B细胞中COX-2的表达和细胞的增殖,促进凋亡发生,为肝细胞癌基因治疗提供实验依据和治疗靶点。     

TINCR靶向microR-544a/FBXW7对人乳腺癌细胞增殖、侵袭的影响

目的 探讨长链非编码RNA（lncRNA）组织分化诱导非蛋白编码RNA（TINCR）靶向microRNA-544a（miR-544a）/FBXW7对人乳腺癌细胞增殖、侵袭的影响。方法 体外培养人乳腺癌MCF7细胞株,设置空白对照组（不转入任何载体）、TINCR NC组（pcDNA3.1空载体）和TINCR上调组（pcDNA3.1-TINCR表达载体）。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测MCF7细胞lncRNA TINCR、miR-544a相对表达量;CCK-8法检测MCF7细胞增殖情况;流式细胞术检测MCF7细胞凋亡情况;Transwell法检测MCF7细胞侵袭情况;Western blotting检测MCF7细胞FBXW7、增殖细胞核抗原（PCNA）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）蛋白相对表达量。取TINCR上调组MCF7细胞,分为miR-544a NC组（转染miR-544a NC）和miR-544a上调组（转染miR-544a mimic）,验证转染效率。结果 空白对照组、TINCR NC组MCF7细胞lncRNA TINCR、miR-544a相对表达量、OD值、细胞凋亡率、穿膜细胞数及FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P >0.05）。与空白对照组、TINCR NC组比较,TINCR上调组MCF7细胞lncRNA TINCR相对表达量、细胞凋亡率及FBXW7、Bax蛋白相对表达量升高（P <0.05）,miR-544a相对表达量、OD值、穿膜细胞数及PCNA、MMP-2蛋白相对表达量降低（P <0.05）。TINCR上调组与miR-544a NC组MCF7细胞OD值、侵袭细胞数及miR-544a、FBXW7蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P >0.05）。与TINCR上调组和miR-544a NC组比较,miR-544a上调组MCF7细胞OD值、侵袭细胞数及miR-544a相对表达量升高（P <0.05）,FBXW7蛋白相对表达量降低（P <0.05）。结论 lncRNA TINCR可能通过靶向miR-544a/FBXW7,抑制人乳腺癌细胞增殖、侵袭,并促进其凋亡。