结核分枝杆菌esat6基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)esat6基因原核表达载体并进行表达。方法：PCR扩增MTbeast6基因，克隆入pQE30质粒，测序正确后，再亚克隆入pET32a( )质粒，构建PQE30—ESAT6和PET32a( )—ESAT6重组体。结果：重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后，经IPTG诱导，pQE30—ESAT6未表达目的蛋白，而PET32α( )—ESAT6表达出19kDA左右重组蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的42％，用Westermblotting证实其有良好的抗原性；经过Ni—NTA柱纯化，获得纯度为92％的重组蛋白。结论：成功构建原核表达载体pET32a( )—ESAT6，并获得重组ESAT6蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定基础。     

铜绿假单胞菌mexA基因原核表达载体的构建

目的 构建mexA基因的原核载体,为进一步表达MexA蛋白奠定基础.方法 从临床分离多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexAl基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再以PUC/mexA1质粒为模板PCR扩增mexA目的 基因,克隆至质粒pQE30中,构建表达质粒pQE30/mexA,构建的表达质粒pQE30/mexA转化大肠杆菌M15,培养后提取纯化重组质粒pQE30/mexA酶切鉴定.结果 获得长约1.5 kbPCR mexA1产物,酶切结果显示所构建的重组质粒PUC/mexA1已成功地克隆了mexA1(1.5 kb)基因,序列分析结果与PA01/mexA1序列相同,构建的表达质粒pQE30/mexA酶切鉴定,与插入pQE30的目的基因mexA(1.2 kb)片段相符.结论 含mexA(1.2 kb)基因的原核表达载体构建成功,为进一步表达MexA蛋白奠定了基础.     

恙虫病东方体Karp株47kDa蛋白成熟肽的克隆与表达

目的 :克隆表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株 4 7kDa表面蛋白的成熟肽 ,探索其作为疫苗及诊断抗原的可能性。方法 :采用PCR方法 ,从 OtKarp株菌种基因组DNA中扩增出 4 7kDa成熟蛋白基因片段 ,将该片段克隆于原核表达载体pQE30 ,构建成重组质粒pQE30 4 7,转化大肠杆菌 (E coli) ,经IPTG诱导表达 ,SDS_PAGE和Western_blotting检测目的蛋白的表达。结果 :①获得长约 12 72bp的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因 ;②SDS_PAGE和免疫印迹显示该重组质粒转化的E coli有一相对分子量约为 4 3× 10 4 的独特蛋白带 ;③重组表达质粒序列分析结果显示pQE30 4 7中插入的基因片段的序列与已报告的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因序列基本一致 ,并与已知序列相同。结论 :获得了OtKarp 4 7kDa蛋白基因 ,并在E coli中实现了表达 ,表达的重组蛋白具有免疫反应性     

杜氏利什曼原虫假定蛋白PA5的原核表达与生物信息学分析

目的扩增杜氏利什曼原虫假定蛋白PA5基因,原核表达该假定蛋白并预测其结构与功能。方法以杜氏利什曼原虫前鞭毛体基因组DNA为模板,巢式PCR法扩增该基因,将其克隆入pQE30质粒构建pQE30-PA5重组质粒,经IPTG诱导表达目的蛋白。采用生物信息学方法对该蛋白进行同源性分析、信号肽及跨膜区预测、蛋白质结构与B细胞抗原肽位点分析。结果成功扩增出PA5基因,序列全长为765 bp,构建的pQE30-PA5重组质粒,经诱导后目的蛋白以包涵体形式表达。所获得的蛋白含254个氨基酸,相对分子质量为27 065,等电点为5.71的亲水性不稳定蛋白,不含信号肽及跨膜区。二级结构以α-螺旋及不规则卷曲为主,共含5个B细胞抗原肽片段。结论成功表达了杜氏利什曼原虫PA5蛋白,该亲水蛋白具有体液免疫刺激潜能,具有利什曼病潜在免疫诊断价值。     

重组原核表达载体pQE30-hALRIP的构建及鉴定

目的:构建人肝再生增强因子相互作用肽(hALR interacting protein,hALRIP)重组原核表达载体并进行鉴定.方法:用聚合酶链反应(PCR)扩增hALRIP编码区基因,将PCR扩增产物克隆至pMD18-T载体中并测序.利用pQE30质粒载体构建重组原核表达载体pQE30-hALRIP,并通过酶切电泳鉴定重组质粒.结果:构建了重组克隆载体pMD18-hALRIP和重组表达载体pQE30-hALRIP,测序及酶切鉴定与预计相同.结论:成功构建了重组原核表达载体pQE30-hALRIP,为进一步研究该多肽奠定基础.     

小鼠原核表达载体pQE30/FGFR-1的构建及表达鉴定

目的构建小鼠FGFR—1胞外段基因重组原核表达载体pQE30／FGFR—1，并在大肠杆菌JM109中表达。方法利用RT—PCR技术．从胚肝中扩增出小鼠的FGFR—1胞外段基因的cDNA，用内切酶消化后插入原核表达质粒pQE30中。经琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定后，体外转化大肠杆菌，用RT—PCR和免疫印迹方法鉴定，同时利用Ni—NTA琼脂柱层析法纯化复性重组蛋白。结果琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定证实PCR扩增的cDNA及构建的重组原核表达质粒pQE30一FGFR—1正确，并在大肠杆菌中正确表达。经纯化后，进行SDS—PAGE电泳显示得到1条分子量约40kDa的蛋白质条带。结论成功构建小鼠原核表达载体pQE30／FGFR—1并在大肠杆菌中有效表达，纯化后获得具有活性的重组蛋白质。     

pQE31-HPV16 L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒以获得ＨＰＶ１６ Ｌ１活性蛋白。为进一步研制ＨＰＶ１６基因工程疫苗打下基础。方法 以克隆质粒pQE３１－ＨＰＶ１６Ｌ１重组质粒,用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检查质闰重组后序列情况。结果 ＰＣＲ结果显示扩增片断大小为１.5Kb,与预期相同。重组质粒酶切后显示其大小约５.0Kb。大小及酶切图谱与预期相同。经测序发现插入片段两端序列无改变。结论 pQE３１－ＨＰＶ１６Ｌ１质粒构建成功。     

重组hEGF-TCS融合蛋白基因表达载体的构建及表达产物的纯化

目的 构建新型人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)和天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)融合蛋白的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化EGF-TCS融合蛋白.方法 利用基因工程技术将人表皮生长因子EGF和天花粉蛋白基因连接起来,克隆到高效表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE30-EGF-TCS.并在大肠杆菌M15中表达该融合蛋白(EGF-TCS).产物经Ni-NTA Agrose亲和层析柱纯化.结果 重组表达质粒pQE30-EGF-TCS在大肠杆菌M15中获得稳定、高效的融合表达.目的蛋白占细胞总蛋白的40%左右,以可溶性形式存在,表达上清柱纯化纯度达95%以上.结论 应用基因工程技术,成功构建了融合蛋白EGF-TCS,为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定了基础.     

结核分枝杆菌1hp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)1hp—esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法：用Gene SOEing法，将1hp基因和esat6基因体外重组，构建融合基因，克隆入pQE30质粒中进行表达。结果：构建的融合基因经测序证实完全正确，重组体转化表达菌DH5α后，经过IPTG诱导，表达出26kDa左右的CFP10-ESAT6融合蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的40％，Western blotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni—NTA柱纯化后，获得了纯度为98%的重组蛋白。结论：成功构建MTb 1hp—esat6融合基因，成功构建原核表达载体pQE30-CFP10-ESAT6，并获得重组CFP10-ESAT6融合蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定了基础。     

人促血小板生成素(TPO)原核表达载体pQE30-TPO的构建

目的：获得人血小板生成素全长cDNA克隆，并构建重组表达载体pQE30-TPO。方法：利用RTPCR技术从人胎肝细胞mRNA中扩增目的基因，将扩增产物克隆至pMD18-T载体，经菌落PCR鉴定后，DNA序列分析重组质粒pMD18－T－TPO。构建并鉴定原核表达载体pQE30-TPO。结果：构建了重组克隆载体pMD18-T-TPO和重组表达载体pQE30-TPO，序列分析表明，获得的TPO cDNA序列与国内外报道的人促血小板生成素核苷酸序列完全一致。结论：成功构建了重组表达载体pQE30-TPO，为TPO的进一步研究奠定了基础。     

表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶的表达、纯化及活性测定

目的:采用原核表达体系对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)受体型酪氨酸激酶(recep-tor tyrosine kinase,RTK)进行体外表达、纯化及活性鉴定.方法:以包含EGFR cDNA的pRK5质粒为模板,PCR选择扩增编码EGFR-RTK的cDNA片段,插入pQE30质粒后转染大肠杆菌M15.IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体蛋白经复性后亲和层析法纯化,ELISA方法测定蛋白活性.结果:成功地将933 bp的EGFR-RTK cDNA片段插入载体pQE30中,构建了表达载体pQE30-RTK.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为37 000的EGFR-RTK融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的65.2%.复性、纯化后的EGFR-RTK蛋白经ELISA检测,结果发现随着加入蛋白量的增加,酶促反应产物磷酸化酪氨酸的量也逐渐增加,两者具有线性关系.结论:本实验成功地利用原核表达系统表达了具有生物学活性的EGFR-RTK,较传统的昆虫细胞表达系统更为简便、经济.     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白原核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因全长cDNA,构建原核表达载体pQE30-Xa-OSCP。方法:利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从大鼠脑组织中扩增出目的基因,先以A-T连接方式克隆到pTA2载体中,再将其克隆到原核表达载体pQE30-Xa中,并进行酶切、测序鉴定。结果:RT-PCR扩增出约700bp特异性片段,重组原核表达载体经酶切鉴定结果同预期相符,经测序鉴定序列同源性与GeneBank报道一致。结论:成功构建了重组原核表达载体pQE30-Xa-OSCP。     

乙型肝炎病毒X基因的克隆与鉴定

目的 构建乙型肝炎病毒X基因原核表达质粒pQE30-HBx,以进一步研究其基因产物的功能及致病机制.方法 以肝炎患者血清DNA为模板,用PCR方法扩增乙型肝炎病毒X基因,构建乙型肝炎病毒X基因原核表达质粒pQE30-HBx,经酶切电泳验证重组质粒的正确性,并对X基因进行测序鉴定.结果 PCR结果显示,扩增片断大小约465 bp,与预期相同.重组质粒经酶切电泳判断有目的片段插入,方向正确,经测序证实插入片段是乙型肝炎病毒X基因,编码框无误.结论 成功构建乙型肝炎病毒X基因重组质粒pQE30-HBx.     

重组人C22orf37融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的：构建人C22orf37基因的原核表达载体,表达并纯化C22orf37重组蛋白．方法：应用PCR方法从人外周血白细胞eDNA文库中获得人C22orf37基因,成功构建人C22orf37融合表达载体,诱导表达His—C22orf37融合表达蛋白并对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blot鉴定．应用镍螯合层析法纯化重组融合蛋白,并对纯化产物进行纯度分析．结果：成功构建了人C22orf37重组融合载体pQE30-C22orf37,工程菌pQE30-C220rf37／DH5α经IPTG诱导后的菌体蛋白经SDS—PAGE电泳分析,在Mr约18000处出现了一条新生的蛋白条带,Western Blot结果显示该条带能够与His抗体特异性结合．应用Ni—NTA层纯化出目的蛋白,纯化后的蛋白经Primer Premier软件分析纯度约80％．结论：成功构建了人C22orf37的融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化了人C22orf37的融合蛋白,为下一步的C22orf37 mAb的制备和C22orf37蛋白表达的组织分布及功能研究奠定了基础．     

rhTPO在大肠杆菌中的表达、纯化及生物活性分析

目的：探讨人促血小板生成素(human thromlbopoietin，hTPO)在大肠杆菌中表达、分离纯化及生物学活性初步鉴定。方法：利用RT-PCR法从人胎肝细胞中扩增目的基因片段，将其定向插入pQE30表达质粒T5启动子下游的多克隆区，转化大肠杆菌M15，得到pQE30-TPO的工程菌，诱导目的蛋白表达、纯化。将表达产物给血小板减少模型小鼠尾静脉注射，观察注射后不同时间血小板量的改变。结果：经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside IPTG)诱导培养，该工程菌可以产生单一特异性的高表达蛋白条带。将纯化后的表达蛋白注射小鼠，结果显示对实验性小鼠血小板减少症具有一定的治疗作用。结论：在大肠杆菌中成功地高效表达了重组hTPO，该产物具有促血小板生成的活性。     

人线粒体肌酸激酶广泛型亚型的原核表达、抗体制备及其临床应用意义

目的:在大肠杆菌中克隆表达人线粒体肌酸激酶广泛型亚型(uMtCK)的蛋白,免疫家兔制备抗uMtCK的多克隆抗体,检测胃肠肿瘤组织中uMtCK的表达.方法:采用RT-PCR从培养的肿瘤细胞(HeLa细胞)中成功扩增出1 062 bp的uMtCK基因片段,构建重组质粒pQE30-uMtCK,转化大肠杆菌表达酶融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE、Western印迹鉴定及酶活性测定.纯化的uMtCK蛋白免疫家兔制备了抗uMtCK多抗.免疫组化法检测59例胃及直肠肿瘤组织切片中uMtCK的表达.结果:RT-PCR扩增出的片段经酶切鉴定和测序证实为uMtCK的基因;在大肠杆菌M15中实现了高效、可溶性的融合表达.免疫家兔制备的抗uMtCK多抗经Western免疫印迹分析适合作uMtCK的进一步分析.免疫组化检测临床病理标本结果显示,59例胃及直结肠肿瘤标本uMtCK的阳性率为76.5%.结论:成功克隆了人uMtCK的编码基因,并将其在大肠杆菌中成功表达;制备了抗uMtCK多抗,免疫组化检测临床病理标本的结果提示uMtCK有助于胃肠肿瘤的诊断.     

流感病毒RNA聚合酶PB1-1亚基片段的克隆及表达

目的 将流感病毒RNA聚合酶PB1-1亚基进行亚克隆、表达，获得重组的亚克隆多肽，为进一步研究PBl亚基功能奠定基础。方法 以FB1亚基cDNA为模板，用PCR方法扩增出PB1-1片段，应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pQE30重组，阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定，IPTG诱导各亚克隆系高效表达；优化表达条件。结果 PCR法扩增出487bp的片段，酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒，在E．coli M15中表达得到相对分子量约为20KD的重组蛋白，获得蚕组多肽。结论 成功地亚克降及表达了流感病毒RNA聚合酶PB1-1亚基。     

pQE32-HPV18L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒获得HPV18 L1活性蛋白，为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒pBR322-HPV18为模板，利用PCR方法扩增HPV18 L1DNA片段，将HPV18 L1DNA与pUC19质粒重组构建pUC19-HPV18 L1重组质粒。用酶切电泳验证重组结果的正确性；并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。再利用pQE32质粒做表达载体构建pQE32-HPV18 L1重组质粒，并用酶切电泳验证。结果 PCR扩增DNA片段约为1.7Kb，与预期结果相同。pUC19-HPV18 L1克隆重组质粒酶切后显示4.39Kb，酶切图谱与预期相同。测序验证插入片段全序列无改变。pQE32-HPV18 L1表达重组质粒酶切后显示其大小约5.16Kb，酶切图谱亦与预期相同。结论 pQE32-HPV18 L1表达重组质粒构建成功。     

人细小病毒B19 NS1片段全长的克隆及表达

目的 :克隆人细小病毒B1 9非结构蛋白 1 (NS1 )全长基因 ,构建重组表达载体并诱导表达。　方法 :利用聚合酶链反应 (PCR)和分子克隆技术 ,从我科保存的B1 9阳性标本XA2 0中扩增NS1片段全长 ,构建NS1 pGEM T easy克隆载体并测序分析 ,测序证实序列正确后亚克隆于pQE30表达载体中 ,并转化至M1 5感受态菌中 ,经IPTG诱导可表达 770 0 0的融合蛋白。　结果 :成功克隆了人细小病毒B1 9NS1全长基因 ,构建了融合蛋白NS1 pQE30的重组表达质粒 ,表达的融合蛋白经 1 2 %SDS PAGE电泳证实为 770 0 0。　结论 :获得人细小病毒B1 9NS1全长基因及原核表达产物 ,对进一步研究NS1的生物学活性及其单克隆抗体的制备有重要意义。