RNA干扰YWHAZ基因对结肠癌HCT-8细胞增殖的影响

目的:探讨中RNA干扰YWHAZ基因对结肠癌HCT-8细胞增殖的影响,阐明其作用机制。方法:构建靶向基因YWHAZ的siRNA载体重组质粒pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-792、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-733、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-612和pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-505作为RNA干扰质粒组,同时设立阴性对照质粒组(pGPU6/GFP/Neo-shNC质粒);采用荧光定量PCR检测YWHAZ mRNA的表达水平和表达抑制率;采用MTT法检测HCT-8细胞的增殖率。结果:倒置荧光显微镜下观察,细胞转染率为60%。荧光定量PCR检测,RNA干扰组YWHAZ mRNA表达水平低于阴性对照组(P<0.01),平均抑制率为52.86%。MTT检测,与阴性对照组比较,RNA干扰质粒组细胞增殖率明显降低(P<0.01),平均细胞增殖率为68.75%。结论:干扰YWHAZ可抑制该基因的转录,并抑制HCT-8细胞的增殖。     

RNA干扰FZD4基因表达对人胶质瘤干细胞自我更新能力的抑制作用

目的: 探讨FZD4在人胶质瘤干细胞自我更新能力中的作用,并阐明其作用机制。方法: 针对人的FZD4设计了2条短发夹RNA(shRNA)序列,利用慢病毒包装后感染人胶质瘤U251细胞(FZD4 shRNA干扰组分为FZD4-shRNA-1#和FZD4-shRNA-2#组),经空病毒感染的U251细胞为对照组。倒置显微镜观察感染的U251细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,通过RT-PCR和免疫印迹法检测各组细胞中FZD4 mRNA和蛋白表达水平。利用干细胞培养基筛选出胶质瘤干细胞,采用极限稀释实验观察FZD4 shRNA对肿瘤干细胞增殖及自我更新的影响。结果: 与对照组比较,FZD4 shRNA干扰组FZD4 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。与对照组比较,FZD4 shRNA干扰组中干细胞形成的神经球直径明显缩小(P<0.01)。极限稀释实验,与对照组比较,FZD4 shRNA干扰组干细胞在每个孔中生成至少1个神经球所需要的细胞数明显增加(P<0.05或P<0.01)。结论: 通过shRNA下调U251细胞中FZD4的表达后可以显著抑制胶质瘤肿瘤干细胞的自我更新能力。     

人乳头瘤病毒16型E5对人宫颈癌SiHa细胞恶性潜能的影响及其机制探讨

目的 通过构建和筛选持续表达HPV16E5的细胞SiHa/16E5,探讨HPV16E5对宫颈癌SiHa细胞的作用及机理.方法 利用pEGFP-C1构建HPV16型E5的正义全长真核表达载体并稳定转染SiHa细胞;利用RT-PCR和Western印迹技术检测转染前后E5和P21基因的mRNA和GFP+E5和P21蛋白的变化;利用MTT法检测SiHa细胞稳定转染后的增殖活性;利用软琼脂克隆形成和裸鼠成瘤实验分别在体内外验证了SiHa/16E5细胞的致瘤情况.结果 稳定转染携带.HPV16全长E5基因的质粒后,SiHa细胞中E5基因的mRNA和相应蛋白表达明显升高,而P21的表达则明显下调;MTT结果 显示稳定转染后细胞的增殖活性与转染空载体细胞和未转染细胞比较明显增高(P<0.05);软琼脂克隆形成结果 示:SiHa/16ES细胞组的可隆形成数为33.4±1.6,与空质粒对照组细胞(15.1±3.1)及未转染组细胞(16.3±2.5)比较差异有统计学意义(P<0.05);裸鼠成瘤实验结果 显示,4个实验组在共20 d的观察中,SiHa/16E5组裸鼠成瘤明显快于其他3个对照组(P<0.05).结论 HPV16 E5可降低宫颈癌SiHa细胞中P21的表达,加强宫颈癌SiHa细胞增殖和成瘤效应.     

小分子活性肽apelin在低氧诱导肺血管内皮细胞损伤中的表达及其意义

目的: 探讨apelin-APJ系统在低氧诱导肺血管内皮细胞(PVECs) 损伤中的表达变化,阐明小分子活性肽apelin对细胞增殖的影响。方法: 体外培养的大鼠PVECs 分为正常对照组、低氧6h组、低氧12h组、低氧24h组、低氧48h组、低氧24h加 apelin组和apelin组,MTT法检测各组细胞增殖率。体外培养的大鼠PVECs 分为正常对照组和低氧6h组、12h组及24h组,免疫荧光染色法检测细胞中apelin蛋白荧光表达,Western blotting法检测apelin-APJ系统蛋白表达水平。结果: 与正常对照组比较,低氧6、12 h组和apelin组细胞增殖率无明显变化(P>0.05),低氧24和48h组细胞增殖率明显降低 (P<0.05或P<0.01);与低氧24和48h组比较,低氧24h加apelin组细胞增殖率明显升高(P<0.05)。与正常对照组比较,低氧6h组细胞中apelin荧光表达强度无明显变化(P>0.05),低氧12和24h组细胞中apelin荧光表达强度明显降低(P<0.01)。与正常对照组比较,低氧6、12和24h组细胞中apelin蛋白表达水平明显下降(P<0.01),而APJ蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)。结论: 低氧可能通过降低小分子活性肽apelin损伤内皮细胞,而外源性给予apelin在一定程度上能够保护低氧对肺血管内皮细胞的损伤作用。     

肝细胞生长因子和血管紧张素Ⅱ对肾小管上皮细胞转分化的影响及其作用机制

目的: 探讨肝细胞生长因子(HGF)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化(TEMT)的影响,并阐明其作用机制。方法: 体外培养人近曲小管上皮HK-2细胞,取Ⅳ期细胞分为对照组、AngⅡ(1×10^-6mol·L^-1)组、HGF(8 μg·L^-1)组和AngⅡ(1×10^-6mol·L^-1)+HGF(8 μg·L^-1)组。采用CCK8法检测HK-2细胞增殖情况,RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA表达水平,Western blotting法检测α-SMA的蛋白表达水平。结果: 与对照组比较,AngⅡ组HK-2细胞增殖活性降低(P<0.01),HGF组HK-2细胞增殖活性升高(P<0.05),AngⅡ+HGF组HK-2细胞增殖活性降低(P<0.05)。与对照组比较,AngⅡ组 HK-2细胞中α-SMA mRNA及蛋白表达水平升高(P<0.05或P<0.01),HGF组HK-2细胞中α-SMA mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01), AngⅡ+HGF组HK-2细胞α-SMA mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05); 与AngⅡ 组比较,AngⅡ+HGF组细胞增殖活性升高(P<0.05),α-SMA mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论: AngⅡ抑制肾小管上皮细胞增生而促进TEMT, HGF促进肾小管上皮细胞增生而抑制TEMT,HGF可能介导AngⅡ抑制HK-2细胞增生及促进TEMT的作用。     

靶向干扰ARTN对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖能力的影响

目的:通过RNA干扰技术靶向抑制ARTN基因在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达,探讨抑制ARTN基因对Ishikawa细胞增殖能力的影响.方法:体外培养子宫内膜癌Ishikawa细胞,以pGPU6/GFP/Neo为载体构建ARTN基因的短发夹RNA(pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA)干扰质粒,利用脂质体法转染人子宫内膜癌Ishikawa细胞,荧光显微镜下观察转染效率,应用Western Blot法检测转染后细胞ARTN蛋白的表达情况,CCK法检测Ishikawa细胞的增殖活性.结果:pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA干扰质粒成功转染Ishikawa细胞,转染效率为80％;转染后48h,干扰组Ishikawa细胞ARTN蛋白的表达水平明显低于阴性对照组和正常组(P<0.05);转染后48h、72h、96h,干扰组Ishikawa细胞的增殖活性明显低于阴性对照组和正常组(P<0.05).结论:靶向干扰ARTN基因可抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖能力.     

人乳头状瘤病毒16型E6基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的以人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）16型E6基因为靶点,构建小发夹状RNA（small hairpin RNA,shRNA）慢病毒载体.方法将HPV 16E6基因的特异性序列,应用基因重组技术插入到包含U6启动子及绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中.重组质粒命名为pGCL-GFP-HPV16-E,测序鉴定后与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0通过lipofectamine 2000共转染293T细胞,病毒液根据绿色荧光蛋白（GFP）表达水平测定滴度.结果 PCR扩增和测序结果证实HPV16 E6 shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液,测定滴度为2×109 TU/mL.结论应用基因重组技术等方法,可成功构建HPV16 E6 shRNA慢病毒载体.     

pEGFP-HPV16 E6重组质粒的构建及其在Hela细胞中的表达定位

目的 构建以绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-HPV16 E6.方法 利用脂质体转染体外培养的Hela细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP～HPV16 E6融合蛋白在细胞中的分布和定位,用Western blot方法验证其蛋白的表达.结果 在空载体pEGFP-C2转染组中,Hela细胞内绿色荧光呈弥散分布;重组质粒pEGFP-HPV16 E6转染组中,绿色荧光集中在细胞核中.结论 pEGFP-HPV16 E6融合基因真核表达载体在真核细胞Hela中获得了表达,细胞所表达的融合蛋白具有HPV16 E6和EGFP的双重活性,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位,为HPV16 E6的功能研究提供了线索.     

Akt联合电离辐射对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡、自噬和增殖的影响

目的: 通过检测Akt联合电离辐射对乳腺癌MCF-7细胞凋亡、自噬和增殖的影响,探讨以Akt为靶点的乳腺癌放射治疗作用。方法: 选择人乳腺癌MCF-7细胞、Akt过表达MCF-7(Akt-MCF-7)细胞和Akt低表达(Akt-RNAi-MCF-7) 细胞,实验分为MCF-7组、MCF-7+4 Gy组、Akt-MCF-7+4 Gy组和Akt-RNAi-MCF-7+ 4 Gy组 。3种细胞经4 Gy照射后,Western blotting法检测Akt蛋白表达,AnnexinⅤ-FITC和PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率,MDC染色荧光显微镜观察细胞自噬百分比,MTT法检测细胞增殖活性。结果: 与MCF-7 细胞比较,Akt-MCF-7细胞中Akt蛋白表达强度增加,Akt-RNAi-MCF-7细胞中Akt蛋白表达强度降低。与MCF-7组比较,MCF-7+4 Gy、Akt-MCF-7+4 Gy和Akt-RNAi-MCF-7+4 Gy组细胞凋亡率和自噬百分比均明显增加(P<0.05或P<0.01),且以Akt-RNAi-MCF-7+4 Gy组增加最明显;与MCF-7+4 Gy组比较,Akt-MCF-7+4 Gy组细胞凋亡率和自噬百分比明显降低(P<0.05或P<0.01),而Akt-RNAi-MCF-7+4 Gy组细胞凋亡率和自噬百分比明显增加(P<0.05或P<0.01)。与MCF-7组比较,MCF-7+4 Gy组、Akt-MCF-7+4 Gy组和Akt-RNAi-MCF-7+4 Gy组细胞增殖活性在不同时间点均明显降低(P<0.05或P<0.01),Akt-RNAi-MCF-7+4 Gy组细胞增殖活性降至最低。与MCF-7+4 Gy组比较,Akt-MCF-7+4 Gy组细胞增殖活性在24 h时明显升高(P<0.05),而Akt-RNAi-MCF-7+4 Gy组细胞增殖活性在不同时间点均明显降低(P<0.01)。结论: Akt过表达可以显著降低电离辐射诱导的MCF-7细胞凋亡、自噬和增殖,而Akt低表达作用则相反。     

siRNA 表达载体抑制宫颈癌SiHa细胞增殖的实验研究

目的 观察HPV16E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响.方法 利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体转染SiHa细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E7 mRNA的变化;流式细胞仪检测E7蛋白的变化和细胞周期的分布;MTT法检测细胞增殖的变化.结果 HPV16E7 siRNA表达载体可明显抑制SiHa细胞E7 mRNA和E7蛋白的表达,抑制率分别为92.15%、84.30%;阻滞SiHa细胞由G1期进入S期;抑制细胞的生长.结论 HPV16E7 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖.     

RNA干涉（RNAi）抑制宫颈癌细胞SiHa中E7基因表达的实验研究

目的探讨HPV16 E7特异性小干涉RNA（siRNA）表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的抑制作用。方法构建HPV16 E7特异性表达载体，利用脂质粒转染SiHa细胞，用RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白的影响。结果两条siRNA均能有效抑制E7mRNA的转录表达，其中以pshRNA-HPV16 E71作用效果最明显,在转染后72h，对E7 mRNA和蛋白的抑制率分剐为78．4％和57．6％。结论HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达有抑制作用。     

稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

目的构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体，感染HPV16阳性宫颈癌细胞，筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆。方法采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16E6基因的pSUPER．retro RNAi逆转录病毒载体，脂质体法将逆转录病毒载体转染人包装细胞PA317，G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，收集病毒上清，感染靶细胞SiHa，G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆，RTPCR检测细胞中E6 mRNA表达，细胞增殖实验检测细胞增殖力。结果获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，病毒感染靶细胞SiHa后，筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆，RTPCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆，特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达，HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。     

RNA干扰HPV16 E6基因表达对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响

目的：探讨HPV16 E6小干扰RNA（siRNA）对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响。方法：利用化学合成的方法,合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染SiHa细胞。应用荧光定量RT—PCR和Western—blot检测HPV16 E6mRNA及其蛋白水平的表达。MTT法绘制细胞生长曲线。流式细胞术评价HPV16 E6siRNA对细胞周期的影响。结果：HPV16 E6siRNA转染细胞48h及72h后,细胞内HPV16 E6mRNA及蛋白表达量明显下调,与HPV16 E6阴性对照组及空白组比较[48h（1．85±0．15）vs（2．14±0．13）,（2．29±0．11）;72h（1．82±0．06）vs（2．32±0．14）,（2．35±0．23）],差异有显著性意义（P〈0．01）;MTT显示细胞生长明显受到抑制;流式细胞术‘检测显示,E6siRNA可将细胞阻滞在G1期。结论：HPV16 E6siRNA能抑制SiHa细胞增殖。     

化学合成siRNA沉默宫颈癌SiHa细胞E6基因表达的进一步研究

目的 探讨靶向HPV16 E6基因特异性siRNA对SiHa细胞E6和E7基因表达的沉默效果,以及沉默作用对pRb、P53、Survivin和VEGF-C蛋白表达的影响.方法 化学合成靶向HPV16 E6基因的siRNA,脂质体法转染SiHa细胞.半定量RT-PCR检测siRNA对SiHa细胞E6和E7基因转录表达的影响;Western Blotting法检测pRb、P53、Survivin和VEGF-C蛋白的表达.结果 RT-PCR检测结果显示,转染siRNA后24、48和72 h组SiHa细胞E6和E7 mRNA表达水平均明显低于对照组(F=80.71、182.18,P<0.05).Western Blotting结果显示,与对照组相比,转染组pRb和P53蛋白表达明显升高(F=59.78、29.00,P<0.05),VEGF-C蛋白表达明显降低(F=7.58,P<0.05),Survivin蛋白的表达则没有发生明显变化(F=2.28,P>0.05).结论 HPV16 E6特异性siRNA能同时抑制SiHa细胞内E6和E7基因的表达,进而引起P53、pRb以及VEGF-C蛋白表达水平的改变.     

载体介导的RNAi技术抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达

目的 探讨HPV16E7特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞E7基因的抑制作用.方法 构建HPV16 E7特异性siRNA表达载体,利用脂质体转染CaSki细胞,以荧光定量RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白表达的影响.结果 3种表达载体P1、P2、P3均能抑制CaSki细胞E7基因mRNA和蛋白的表达,其中载体P1抑制作用最强,在转染后3周,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分别为92.86%和81.0%.结论 HPV16E7 siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达.     

高危型HPV-16E6在小鼠骨髓源性树突细胞的表达

目的探讨高危型HPV-16E6在树突细胞中的定位。方法构建真核表达载体pGFP-16E6,转染小鼠骨髓源性的树突细胞,在荧光显微镜下动态观察高危型HPV-16E6蛋白在树突细胞内的定位和表达水平。结果树突细胞在分别转染pGFP-16E6和pEGFP-C1质粒后,GFP-16E6主要定位于细胞核内,而对照组的只表达GFP的蛋白则均匀分布于树突细胞。蛋白表达水平的检测表明,在转染树突细胞后的12h,GFP-16E6和GFP蛋白开始表达（荧光强度分别为31.29,39.52）,转染后至24h,蛋白表达均到达高峰（荧光强度分别为119.37,134.23）,24h后,蛋白表达逐渐降低。结论 HPV-16E6主要定位于树突细胞核内,随时间其蛋白表达水平不同,这为HPV E6的树突细胞疫苗发挥有效的抗癌作用提供理论依据。     

UL54和UL29基因干扰对HSV-2复制的影响

目的 利用RNAi技术同时沉默Ⅱ型单纯疱疹病毒的UL54和UL29基因,探讨双基因干扰对HSV-2复制的影响.方法 采用pGPU6/GFP/Neo质粒分别构建UL54、UL29基因的shRNA重组表达质粒,单独或同时转染HEK293细胞,通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹方法检测UL54、UL29基因的表达,终点滴定法检测培养细胞上清液中病毒感染滴度;MTT法测定细胞的存活效率.结果 转染后48h后,与空白组相比,各干扰组均可不同程度降低上清液中的病毒滴度,提高细胞存活率,降低目的基因mRNA和蛋白的表达（P＜0.01）.与单干扰组相比,双基因干扰组能更有效降低病毒滴度并提高细胞存活率（P＜0.01）,增加了对UL54和UL29基因mRNA的抑制率,降低了蛋白的表达（P＜0.01）.结论 pG-PU6/GFP/Neo-UL54、pGPU6/GFP/Neo-UL29重组表达质粒同时转染细胞可抑制HSV-2的复制,采用双基因干扰比单独基因干扰具有更高的效率.     

Induction of SiHa Cells Apoptosis by Nanometer Realgar Suspension and Its Mechanism

The effects of nanometer realgar uterine cervix cancer cell line SiHa cells and suspension on proliferation and apoptosis of human oncogenic genes HPV16E6/E7 were investigated. A ＂micro-jet effiux＂ strategy was used for the preparation of nanometer realgar suspension. SiHa cells were treated with nanometer Realgar suspension in various concentrations （6.25, 12.5, 25 and 50 mg/L） for different durations （12, 24, 48 and 72 h）. The inhibitive effect of nanometer realgar suspension on growth of SiHa cells was detected by MTT method. Special morphological changes of apoptosis were observed by transmission electron microscopy （TEM） and DNA fragments electrophoresis. The apoptotic rate was quantified by flow cytometry （FCM）. The expression of HPV 16E6/E7 mRNA and protein was assayed by RT-PCR and Western blot respectively. The results showed after being treated with 25--50 mg/L nanometer realgar suspension for 48 h, the survival rate of SiHa cells was decreased, and apoptotic rate markedly increased in a time- and concentration-dependent manner. TEM and DNA electrophoresis revealed the special morphological changes of apoptosis. The apoptotic rate of SiHa cells treated with nanometer realgar suspension was significantly higher than in the control group （P〈0.01）, and G0/G1 phase arrest appeared following treatment with nanometer realgar suspension in 25 and 50 mg/L for 48 h. RT-PCR and Western blot assay indicated that nanometer realgar suspension reduced the HPV16E6/E7 gene expression. Nanometer realgar suspension could inhibit the proliferation and induce apoptosis of SiHa cells. The mechanism may be related to the down-regulation of the HPV16E6/E7 gene expression.     

Induction of SiHa Cells Cells Apoptosis by Nanometer Realgar Suspension and Its Mechanism

The effects of nanometer realgar suspension on proliferation and apoptosis of human uterine cervix cancer cell line SiHa cells and oncogenic genes HPV16E6/E7 were investigated. A "micro-jet efflux" strategy was used for the preparation of nanometer realgar suspension. SiHa cells were treated with nanometer Realgar suspension in various concentrations (6.25,12.5,25 and 50mg/L) for different durations (12,24,48 and 72h). The inhibitive effect of nanometer realgar suspension on growth of SiHa cells was detected by MIT method. Special morphological changes of apoptosis were observed by transmission electron microscopy (TEM) and DNA fragments electrophoresis. The apoptotic rate was quantified by flow cytometry (FCM). The expression of HPV16E6/E7 mRNA and protein was assayed by RT-PCR and Western blot respectively. The results showed after being treated with 25-50mg/L nanometer realgar suspension for 48h, the survival rate of SiHa cells was decreased, and apoptotic rate markedly increased in a time- and concentration-dependent manner. TEM and DNA electrophoresis revealed the special morphological changes of apoptosis. The apoptotic rate of SiHa cells treated with nanometer realgar suspension was significantly higher than in the control group (P<0.01), and G0/G1 phase arrest appeared following treatment with nanometer realgar suspension in 25 and 50mg/L for 48h.RT-PCR and Western blot assay indicated that nanometer realgar suspension reduced the HPV16E6/E7 gene expression. Nanometer realgar suspension could inhibit the proliferation and induce apoptosis of SiHa cells. The mechanism may be related to the down-regulation of the HPV16E6/E7 gene expression.