人血清清蛋白cDNA克隆的免疫酶法筛选及其鉴定

报道了用免疫酶法从人肝细胞cDNA文库中筛选清蛋白cDNA克隆的过程。所得到的克隆用免疫学方法及内切酶水解法进行鉴定。在7个阳性克隆中,有8个cDNA克隆分子的叠加占据了整个清蛋白cDNA编码区的长度     

人GST-OPGL融合蛋白的原核表达与抗体制备

目的:克隆人骨保护素配体(OPGL)编码区基因,构建融合表达载体,在大肠杆菌中表达,并制备抗体。方法:采用RT-PCR法得到人骨保护素配体(OPGL)编码区cDNA,克隆入原核表达载体pGEX-4T-3,转化大肠杆菌感受态细胞JM 109,0.1mMβ-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白,行SDS-PAGE电泳。将此融合蛋白免疫新西兰兔,W estern b lot鉴定。结果:获得人骨保护素配体编码区cDNA,构建原核表达载体pGEX-OPGL,转化菌株可表达人GST-OPGL蛋白,蛋白分子量约为43KD,蛋白表达量约为菌体总蛋白的21%。W estern b lot检测表明获得了免疫活性强的兔抗人的多克隆抗体。结论:获得人骨保护素配体编码区cDNA,在大肠杆菌中表达了人GST-OPGL融合蛋白,并获得了高效多抗。     

原发型肝癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

目的 构建人原发型肝癌组织cDNA文库,以SEREX方法从cDNA文库中筛选肝癌抗原基因.方法 采用确诊的原发型肝癌患者新鲜手术切除癌组织构建cDNA文库,测定原始文库滴度,进行蓝白筛选以确定文库的重组率.以肝癌患者的血清,采用血清学方法筛选所构建的cDNA文库,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析.结果 成功构建了混合原发型肝癌cDNA文库经测定原始文库滴度为7.42X106pfu/mL,含3.96×106个重组子,重组率为93%,扩增文库滴度为3.92×109pfu/mL,cDNA插入片段大小在0.5～3.0 kb之间.文库经3轮血清学筛选共获得31个阳性克隆,分别代表了24个独立的cDNA插入片段(抗原基因).其中17个与已知基因高度同源,另外7个基因与GenBank中已知基因的部分同源,其中有3个是新基因.利用SMART技术构建了高质量的人原发型肝癌组织cDNA表达文库,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究.结论 应用SEREX技术初步筛选原发型肝癌组织cDNA文库,共得到17个原发型肝癌相关抗原基因,其中有3个是新基因,可能为原发型肝癌的免疫学研究提供新的研究分子.     

湿热证慢性乙型肝炎T7噬菌体cDNA文库的建立

【目的】利用T7噬菌体展示技术建立湿热证乙型肝炎患者肝组织的cDNA噬菌体文库,为淘选治疗湿热证慢性乙型肝炎中草药的作用靶标等工作奠定基础。【方法】选择2例中医诊断为肝胆湿热证的慢性乙型肝炎性肝癌患者,肝移植术后分别取其手术摘除肝脏的癌旁组织,采用RNAiso Plus试剂提取总RNA,用含有dC10T30寡核苷酸的聚腺苷酸序列亲和试剂Oligotex Suspension纯化mRNA,逆转录合成双链cDNA后,加上Hind芋和EcoR I接头,并与酶切后的T7Select 10-3b载体连接,体外包装并扩增得到湿热证慢性乙型肝炎T7噬菌体cDNA文库。【结果】构建了湿热证慢性乙型肝炎T7噬菌体cDNA文库,文库初始滴度为3×105噬菌斑形成单位(pfu)/mL,扩增后文库滴度为1.8×109pfu/mL。随机挑取44个克隆经PCR后,琼脂糖凝胶电泳显示均为阳性克隆,测序结果显示其中1个阳性克隆的插入子为核糖体前体基因,其他均为mRNA。【结论】成功构建了人湿热证慢性乙型肝炎T7噬菌体cDNA文库,为下一步在中医理论指导下淘选和鉴定湿热证乙型肝炎相关中医药物有效成分的直接结合蛋白靶标奠定基础。     

卫氏肺吸虫成虫cDNA文库的多抗筛选

目的：从卫氏肺吸虫成虫cDNA文库中筛选并鉴定可用于免疫诊断和免疫预防的基因克隆。方法：采用预吸收成虫抗原免疫兔血清（IRS,多抗）筛选阳性克隆，经PCR扩增后测定其插入片段的大小。用辅助噬菌体做体内剪切，以抗生素平板筛选含重组质粒的阳性菌落。选取插入片段不同的两个克隆测定其DNA序列，用BLAST软件对所得DNA序列进行同源性比较。结果：得到P.w-2,P.w-4两个阳性克隆，长度分别为801bp和1053bp，分别与卫氏肺吸虫原组织蛋白酶L和卫氏肺吸虫半胱氨酸蛋白酶基因同源，同源程度分别为99％、86％。结论：用卫氏肺吸虫成虫多抗筛选成虫cDNA文库，所获P.w-2和P.w-4阳性克隆可能可用于肺吸虫病的免疫诊断和预防。     

从葎草花粉cDNA表达文库中筛选过敏性哮喘特异性变应原

目的 从葎草花粉cDNA表达文库中筛选过敏性哮喘特异性变应原.方法 应用葎草花粉过敏性哮喘患者血清对自行构建的葎草花粉cDNA λTripIEx2噬菌体表达文库进行免疫学筛选,提取阳性噬菌体DNA,EeoR I和HindⅢ双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后进行DNA序列测定、重复序列分析和同源性分析.结果 经过3轮筛选,从cDNA表达文库中筛选获得3个葎草花粉特异性变应原cDNA克隆,其序列大小分别为868、550和592 bp.测序结果表明这3个克隆代表3个不同的cDNA序列,重复序列分析未发现重复序列,同源性分析表明与现有的基因均无高度同源性.结论 所获得的与过敏性哮喘相关的3个葎草花粉特异性变应原cDNA克隆可能为新基因,此发现为进一步制备重组变应原疫苗或核酸疫苗打下了良好基础.     

美洲大蠊若虫变应原的基因克隆及序列测定

目的　对美洲大蠊若虫cDNA表达文库进行免疫学筛选 ,分离和鉴定美洲大蠊若虫特异性重组变应原克隆 ,并测定其基因序列 ,从而为美洲大蠊若虫重组变应原疫苗候选基因的筛选提供科学依据。方法　选用对美洲大蠊若虫过敏的变态反应疾病患者 (如哮喘、过敏性鼻炎 )阳性血清 ,对美洲大蠊若虫cDNA文库进行免疫学筛选。使用按照重组载体入ExCellNotI/EcoRI/CIP臂插入位点邻近区域的上、下游碱基序列设计的引物 ,扩增阳性噬菌斑中插入的cDNA片段。并对cDNA插入片段进行序列测定。结果　经用阳性血清对 2 3× 10 4 噬菌体斑的免疫学筛选 ,获得了 5个阳性克隆 ,PCR直接序列分析表明这 5个阳性克隆均为美洲大蠊若虫变应原未知基因克隆。结论　该研究发现了美洲大蠊若虫变应原新基因 ,为进一步开展美洲大蠊若虫特异性重组变应原的研究奠定了基础     

日本血吸虫成虫67kD抗原模拟表位的筛选及其免疫原性

目的：筛选日本血吸虫成虫67kD抗原的模拟表位，对其免疫学活性予以鉴定。方法：用粗提日本血吸虫成虫67kD抗原的抗体IgG作配体筛选噬菌体12肽库，随机挑取三轮筛选后的噬菌体克隆，Dot-ELISA检测其特异性：用混和阳性噬菌体克隆免疫小鼠3次，攻击感染后45d剖杀，计数虫荷。结果：经三轮筛选，特异噬菌体得到富集，挑取的11个噬菌体克隆经Dot-ELISA鉴定均与67kD抗原免疫血清呈阳性反应。混合噬菌体克隆的免疫血清可识别67kD抗原，并具有一定的抗血吸虫的免疫保护效果。结论：利用噬菌体随机肽库技术获得了日本血吸虫成虫67kD抗原的模拟表位，这些表位具有良好的免疫原性。     

噬菌体表面展示技术筛选抗血小板GPⅡb/Ⅲa复合物单链抗体

目的 用噬菌体表面展示技术，直接从抗血小板表面蛋白全套单链抗体噬菌体展示文库中筛选能与糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa复合物高亲合力结合的单链抗体克隆，为开发有自主知识产权的抗栓药物奠定基础。方法 从活化血小板免疫的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA后，用抗体可变区混合引物扩增全套轻、重链可变区基因，经重叠延伸反应，装配成单链抗体(ScFv)基因，将其克隆到噬菌体载体pHENl中，构建单链抗体噬菌体抗体库。对抗体库进行亲合筛选后，ELISA法鉴定抗GPⅡb/Ⅲa复合物单链抗体。结果 经过4轮“吸附——竞争性洗脱——扩增”的富集过程，Phage—ELISA得到一个ELISA活性较高的能与GPⅡb/Ⅲa结合的克隆。序列测定符合抗体可变区结构特点。结论 成功构建了全套抗血小板表面蛋白单链抗体噬菌体展示文库，并筛选得到具有GPⅡb/Ⅲa结合能力的单链抗体基因。     

载脂蛋白CⅢcDNA克隆的筛选,鉴定及其探针的制备

Four of positive clones were obtained by three runs of screening the cDNA library of human liver with rabbit antihuman apolipoprotein (apo) CIII IgG. One of them was identified to be the positive clone of apoC III cDNA by restriction endonuclease map studies of the cDNA insert fragment and by Western blot analysis of the expression products. The apoCIII cDNA-gamma gt11 recombinant DNA prepared from the positive clone can be used in RNA-dot blot analysis as apoCIII cDNA probe. And the apoCIII cDNA clone can be also used to produced apoCIII peptide under the induction of isopropyl-beta-D-thiogalactoside. The apoCIII peptide, after purification, has a lot of use in further studies.     

人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:克隆人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因,构建angioarrestin基因的真核表达载体.方法:从人肝cDNA文库中经PCR扩增出angioarrestin基因及其C-端FD domain,经纯化、回收目的片段,将其插入克隆载体pcDNA3.1/His-Myc(-)B,构建重组质粒pcDNA3.1-ARP和 pcDNA3.1-FD,稳定转染大细胞肺癌NCI-H460细胞,RT-PCR和Western印迹法鉴定.结果:从人肝cDNA文库中扩增出1 473 bp的angioarrestin目的片段及其C-端560 bp FD domain,构建的重组质粒pcDNA3.1-ARP和pcDNA3.1-FD 经PCR及酶切鉴定与预期相符,经RT-PCR和Western印迹法确定稳定转染NCI-H460细胞成功.结论:成功构建了angioarrestin 和C-FD基因的真核表达重组质粒并转染NCI-H460细胞,为angioarrestin抗肿瘤血管形成作用机制的研究奠定了初步基础.     

分化抑制因子1相互作用蛋白AGGF1的筛选

目的 利用酵母双杂交方法,筛选成人肺组织文库中与分化抑制因子1(Id1)相互作用的蛋白.方法 PCR方法扩增Id1的编码序列并定向克隆入诱饵质粒pHybLex/Zeo,构建重组诱饵质粒pHybLex/Zeo-Id1,酶切鉴定后转化人酵母株EGY48/pSH18-34,检测重组诱饵质粒有无非特异激活报告基因Leu2、LacZ作用;扩增并提取成人肺组织文库质粒,将文库质粒及重组诱饵质粒转化入酵母细胞,依次筛选Leu2 ,Leu2 LacZ 克隆;设置阴性及阳性对照,重复筛选Leu2 LacZ 克隆并排除假阳性克隆,获取真阳性文库质粒,进行测序和同源性比对.结果 酶切证实,重组诱饵质粒构建成功.重组诱饵质粒转化入酵母细胞后.经检测无非特异激活报告基因作用.扩增并筛选成人肺组织文库.获得198个Leu2 及19个Leu2 LacZ 克隆.经排除假阳性克隆,最终获得1个Leu2 LacZ 真阳性克隆,经测序和同源性比较证实该克隆与蛋白AGGF1高度同源(556/559,99.5%),Westem blotting证实其在酵母细胞中有表达.结论 利用酵母双杂交方法,通过筛选成人肺组织文库,发现Id1与AGGF1存在相互作用.     

人自身抗原SSA/Ro60的基因克隆和原核表达

目的:克隆并表达人自身抗原SSA/Ro60。方法:应用RT-PCR技术,从HL-60细胞株中克隆人自身抗原SSA/Ro60全长基因,将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行SDS-PAGE和Western blot。结果:PCR产物约为1.6 kb,与预期1614 bp接近,测序结果与Genebank报道的完全一致。pGEX-5T-SSA/Ro60重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白分子量为86 KD,具有天然人自身抗原SSA/Ro60的免疫原性。结论:成功克隆表达人自身抗原SSA/Ro60,为下一步工作奠定了基础。     

AchR特异性TsF cDNA文库的构建及筛选

目的　构建 Ach R特异性 Ts F c DNA文库并对该文库进行筛选。方法　从建立的分泌 Ach R- Ts F的特异性 Ts细胞系中直接提取了 Ts F Poly A+ m RNA,反转录合成全长 c DNA,以脱磷酸化的λgt11Eco RI臂为载体 ,体外包装成噬菌体颗粒并转染 E.coli Y 10 90 hsd R,得到 c DNA文库 ,并用 TCR-α单克隆抗体膜上免疫印迹法对该文库进行筛选。结果　重组噬菌体的滴度约为 1.4× 10 7pfu/ m l,阳性重组率为 86 .9% ,重组噬菌体 DNA的酶切电泳分析证实插入片段大小在 0 .8～ 4 .0 kb之间。初步筛到 2 7个阳性重组噬菌体 ,其插入片段大小约为 1kb左右。结论　该文库的建立有望获得持续高效表达 Ach R特异性 Ts F的重组噬菌体     

胃癌相关抗原MG7-Ag模拟肽表位的筛选及测序分析

目的　从噬菌体呈现的随机肽库中筛选胃癌单克隆抗体MG7所识别的胃癌相关抗原的短肽模拟表位 ,为进一步研究胃癌相关抗原与单抗结合的结构基序奠定基础。方法　用胃癌单克隆抗体MG7对呈现于噬菌体衣壳蛋白pⅧ上的 2个九肽库分别进行亲和富集和免疫筛选 ;阳性克隆进一步用荧光标记和硝酸纤维素膜斑点印迹法证实其结合活性 ;经随机抽取部分阳性克隆进行DNA序列分析 ,推导出相应噬菌体呈现肽的氨基酸序列 ,通过序列比较分析相对保守的表位信息 ;运用HLA分子结合分析软件预测已测序短肽与HLA分子结合的可能性。结果　经反复多轮筛选和结合活性检测 ,从pⅧ和pⅧ cys 2个噬菌体肽库中分别得到了 12和 30个阳性克隆 ;通过对部分阳性克隆进行测序分析 ,推导相应的随机肽序列和序列比较分析 ,得到具有相对保守性的表位信息如PLX0 2 S、SAVR、XRMX、YARN等。经计算机预测分析 ,发现它们可与HLA多个分子结合。结论　PLX0 2 S、SAVR、XRMX、YARN等有可能为胃癌单克隆抗体MG7所识别的表位基序。     

短肽库中血管内皮细胞生长因子受体Flt-1拮抗剂筛选条件的改进

目的:改进噬菌体肽库的筛选条件,提高筛选阳性率及阳性克隆重复性.使血管内皮细胞生长因子受体Flt-1拮抗剂的筛选更为有效.方法:通过对血管内皮细胞生长因子受体Flt-1的原核表达产物的变性复性处理,获得相对纯化的可溶性Flt-1受体.将该可溶性受体固相化,对噬菌体表达12肽库进行4 ～ 5轮Bio-panning后,挑取单个噬菌斑制备高滴度噬菌体上清.用ELISA法初步鉴定各噬菌体克隆与sFlt-1的特异性结合并测定阳性克隆的DN A 顺序.在Bio-panning过程中增加非特异性蛋白的预吸附,并减少输入噬菌体数量, 再次筛选短肽库.结果:经过第一次筛选,获得了一系列具有一定重复性与同源性的噬菌体克隆. 改进筛选条件后,筛选阳性率由2%提高到8.3%,阳性克隆的重复性也得到显著提高.该高重复阳性克隆的氨基酸顺序与前一次筛选获得的阳性克隆有较高同源性.结论:Bio-panning 条件的改进提高了筛选效率,为不纯蛋白筛选短肽库积累了经验,并为血管内皮细胞生长因子受体拮抗剂的研制奠定了基础.     

高温致神经管畸形相关基因CDK109克隆及其致畸相关性分析

目的通过筛选高温致畸金黄地鼠胚胎神经管cDNA文库,克隆高温致畸相关基因CDK109。方法利用本室构建的高温致畸胚胎神经管cDNA文库,采用噬菌斑原位杂交方法,用寡核苷酸探针筛选cDNA文库,挑取阳性噬菌斑,将其转化为质粒,再通过限制性酶切鉴定阳性克隆并测序,将该基因标记探针与孕8.5 d高温致畸胚胎神经管组织和正常对照胚胎神经管组织总RNA进行NORTHERN杂交,以便确认该基因在高温致神经管畸形中的异常表达。结果成功地从高温致畸金黄地鼠胚胎神经管cDNA文库中筛选出高温致畸相关基因CDK109全长,其在高温致畸组的表达明显高于对照组。结论 CDK109在神经管中的高表达与高温致神经管畸形密切相关。     

旋毛虫膜蛋白新基因Tmp10的免疫筛选及鉴定

目的免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库,寻找抗旋毛虫病的疫苗候选抗原或诊断抗原。方法应用旋毛虫感染的猪血清免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库,获得阳性克隆。将一阳性克隆与原核表达载体p ET-28a(+)构建重组质粒,异丙醇硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导后,利用亲和层析柱纯化目的蛋白,并通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和Western blotting鉴定其抗原特异性和免疫原性。结果免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库获得42个阳性克隆,选取一个新基因Tmp10,成功构建了重组质粒p ET-28a(+)/Tmp10,诱导表达后获得的重组蛋白(r Tmp10)的相对分子质量约为40 000。Western blotting检测结果显示,该重组蛋白可被旋毛虫感染小鼠和猪血清所识别,具有抗原特异性。r Tmp10免疫小鼠可诱导产生高滴度的抗体,显示其具有较好的免疫原性。结论免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库获得一个新基因Tmp10,生物信息学分析预测其为膜蛋白,其重组蛋白(r Tmp10)具有较好的抗原特异性和免疫原性。     

血管内皮细胞生长因子在哺乳动物细胞的表达

目的：本实验试图构建具有生物学活性的ＶＥＧＦ真核表达载体,为ＶＥＧＦ基因治疗提供载体。方法：将已获得的ｈＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ克隆到ＧＳＴ融合表达载体,构建原核表达质粒,转染大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定表达产物。在此基础上构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ ／ｈＶＥＧＦ１６５,脂质体介导转染ＣＨＯ－Ｋ１细胞,Ｇ－４１８筛选,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ,Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ分别检测其在细胞内的转录和表达情况,３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测表达蛋白的活性。结果：实验组的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ出现特异性条带,而对照组在相应部位未出现条带。实验组的大鼠心肌血管内皮细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率明显高于对照组（Ｐ＜ ０．００１）。结论：本实验所构建的ＶＥＧＦ真核表达质粒能够在真核细胞内获得表达,其表达产物具有血管内皮细胞增殖刺激活性。