结直肠癌人体肿瘤移植小鼠模型的研究进展

 人体肿瘤移植( patient-derived tumor xenograft, PDX) 模型通过将患者新鲜的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠, 可以较好地保持原发肿瘤的生物学特性及与患者相似的遗传特性和肿瘤异质性, 在临床肿瘤的精准治疗研究中可起到不可替代的作用, 但在其模型建立成功率、时效性和成本控制等方面仍存在不足。本文就人结直肠癌PDX模型构建的实验动物及移植组织类型和方式的选择、最新应用进展和面临的挑战进行综述。     

肿瘤患者来源的异种移植(PDX)模型

将患者新鲜肿瘤组织移植于免疫缺陷小鼠建立的患者来源异种移植(patient-derived xenograft,PDX)模型较好地保持了原发肿瘤的遗传特性和异质性,在肿瘤的个体化治疗研究中具有独特的优势。常用PDX模型的移植方法主要有皮下移植、肾包膜移植和原位移植。移植瘤的溯源方法包括组织形态学比较、肿瘤特异性标志物分析、短片段重复序列分型和测序分析。在PDX模型研究中,需要重点关注影响模型成功率的因素、人源化问题、淋巴瘤的发生和药物评价中治疗策略的选择。虽然从目前临床数据来看,基于PDX模型的个体化治疗还没有显示出实质性疗效,仍处于临床验证阶段,但PDX模型的建立和应用为肿瘤学研究,特别是肿瘤的个体化治疗提供了良好的实验平台。我们在强调PDX模型个体化的同时,要善于应用共性思维,开展基于PDX模型基因组学的肿瘤靶向药物筛选。     

经体外培养的肝癌组织人源性异种移植小鼠模型的建立

目的通过添加人工基质胶,对原代肝癌组织进行体外培养,进而建立肝癌组织人源性异种移植(PDX)小鼠模型。方法收集中山大学肿瘤防治中心肝胆科共5份肝癌组织,经清洗、冻存、复苏等处理,添加人工基质胶,进行为期50～80 d的体外培养;免疫缺陷小鼠肾包膜下接种建立肝癌组织人源性异种移植模型;建模小鼠饲养80～120 d后,取移植瘤进行病理学检测,苏木精-伊红(HE)染色观察组织形态,免疫组化染色检测甲胎蛋白(AFP)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的表达情况,每张玻片取3个视野统计阳性细胞,计算阳性率。结果 5例PDX模型中成功2例,建模成功率为40%。其中001号建模小鼠移植侧肾脏萎缩、质地变硬,移植瘤生长,肾脏周围附着大量附属物;004号建模小鼠腹腔大量腹水,且移植侧肾脏可见黄色肝癌病灶。病理HE染色可见移植瘤组织细胞异型性明显,核分裂增多,失去正常的结构;免疫组化法检测移植瘤组织AFP和GPC3,均呈阳性表达,平均阳性率分别为88%、93%;表明移植瘤组织均保留了原代肝癌组织特性及相应蛋白表达。结论经长期体外培养的原代肝癌组织成功构建人源性异种移植小鼠模型,实现PDX模型构建技术的突破,为进一步的肝癌药物筛选奠定基础。     

瘤内注射慢病毒载体介导的Bmi1-shRNA对A549皮下移植瘤的抑制作用

目的探讨瘤内注射慢病毒介导的原癌基因Bmi1的特异性短发夹RNA(Bmi1-shRNA)对人非小细胞肺癌免疫缺陷鼠皮下种植瘤生长的抑制作用。方法建立NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠人肺癌A549荷瘤模型,共27只,分为3组。其中治疗组移植瘤内注射含有Bmi1-shRNA的慢病毒载体,阴性对照组注射含有NC-shRNA的慢病毒载体,空白对照注射同剂量PBS。通过激光共聚焦观察移植瘤内绿色荧光蛋白(GFP)表达,RT-PCR、Western blot检测Bmi1mRNA、蛋白水平的表达,观察RNA干扰效果,测量肿瘤体积,计算肿瘤抑制率。结果将A549细胞移植到NOD/SCID鼠背部皮下,成瘤率为100%。激光共聚焦观察治疗组及阴性对照组皮下移植肿瘤组织中有GFP表达,而空白对照组未见GFP表达。治疗组NOD/SCID小鼠的肿瘤体积较阴性对照组和空白对照组显著缩小(P<0.05),肿瘤抑制率分别为52.9%和57.9%。Bmi1-shRNA治疗组中的Bmi1蛋白明显降低,相对空白对照组和阴性对照组,蛋白表达抑制率分别为51.1%、50.3%,差异有显著性(P<0.05)。结论利用慢病毒载体成功...     

具有人免疫系统和异体人黑色素瘤生长的人源化小鼠 模型的构建和鉴定

目的：构建同时具有人免疫系统和人肿瘤生长的人源化小鼠模型,为人肿瘤免疫研究和临床肿瘤免疫药物药效评估提供依据。方法：通过给予重度免疫缺陷NOD/SCID IL2rg-/-小鼠亚致死剂量辐照,联合小鼠肾被膜下移植人胚胎胸腺组织和静脉输注CD34⁺胎肝细胞,构建具有人免疫系统重建的人源化小鼠。构建人源化小鼠模型后3周开始,每3周采集外周血监测人免疫细胞重建情况,包括CD45⁺、CD33⁺、CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺、CD56⁺细胞比例。构建人源化小鼠模型后,第15周给予小鼠皮下接种人A375黑色素瘤细胞,每5 d测量肿瘤体积。接种6周后处死小鼠,流式细胞术检测人源化小鼠外周血、骨髓、淋巴结、脾脏及肿瘤组织中人免疫细胞的组成和表型。免疫组织化学法检测人源化小鼠肿瘤组织中人免疫细胞的组成和表型。结果：在人源化15周时,人源化小鼠模型外周血中人T细胞比例为（33.53±8.57）%、B细胞比例为（43.33±10.05）%。在A375细胞接种后前3周,人黑色素瘤生长较慢,其后加速生长,6周时肿瘤体积达（1 564±334.3） mm³。免疫组织化学和流式细胞术检测,人黑色素瘤内有大量以CD8⁺ T细胞为主的人T细胞浸润;肿瘤组织中CD8⁺/CD4⁺比值明显高于外周血、骨髓、淋巴结和脾脏（P<0.01）。PD-1分子在肿瘤浸润人CD4⁺ T和CD8⁺ T细胞中的表达水平明显高于其在外周血和免疫器官中的水平。结论：成功建立了具有人类免疫系统和异体人黑色素瘤生长的人源化小鼠模型,并在其外周血、淋巴器官以及人肿瘤组织中均检测到包括人T细胞和人B细胞在内的高水平人CD45⁺免疫细胞。     

人脐血CD34~+细胞在NOD/SCID小鼠上有效重建造血系统

目的探讨人脐血CD34+造血干细胞在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(no obese diabetic/severecombined Immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠模型上造血重建的作用。方法利用密度梯度离心法,从新鲜脐血中分离出单个核细胞,利用免疫磁珠分选法筛选CD34+造血干细胞,经尾静脉输注入经亚致死剂量照射后的NOD/SCID小鼠体内,移植后3、7、10、14 d分别用断尾法取小鼠外周血,血常规计数外周血动态变化情况;移植后4、6、8、10周,取其外周血,运用PCR法检测外周血中人特异性Alu基因的表达情况。结果免疫磁珠分选得到的CD34+细胞浓度达91.2%,照射后小鼠骨髓腔内有核细胞和巨细胞数量明显减少或消失,达到清髓目的。移植后第3天移植组小鼠外周血各系细胞均明显低于正常组(P<0.01),移植后第7天,移植组小鼠外周血象开始恢复,明显高于阴性对照组[白细胞:(3.90±0.53)×109/L vs(1.30±0.18)×109/L,血红蛋:(139.8±5.0)g/L vs(79.8±11.0)g/L,白血小板:(253.0±17.5)×109/L vs(52.0±6.9)×109/L,(P<0.01)],移植后第10天,移植组小鼠外周血象恢复到辐照前水平,与正常组无差别。移植4周后,PCR方法在小鼠外周血中可检测到人特异Alu基因序列,未移植组小鼠照射后2周内全部死亡。结论经照射后的NOD/SCID小鼠通过人脐血CD34+细胞植入可建立起人鼠嵌合模型。NOD/SCID小鼠经照射后,不破坏骨髓造血微环境及造血基质,可用于异基因细胞移植模型。人脐血CD34+细胞移植入NOD/SCID小鼠,其造血系统能有效重建。     

利用CRISPR/Cas9技术建立NOD/SCID/IL2Rγ-/-免疫缺陷小鼠

目的NOD/SCID/IL2Rγ-（/- NSG）小鼠品系是最严重的免疫缺陷品系,广泛应用于异种移植的研究。然而,SCID突变是 Prkdc 基因的一个自发性突变,会导致T细胞发育阻滞后渗漏而且很难进行基因型鉴定。因此,开发一个敲除Prkdc和IL2Rγ基 因的新品系NSG小鼠非常重要。方法使用CRISPR/Cas9系统实现Prkdc和IL2Rγ基因的靶向敲除。将基因敲除小鼠与NOD 背景小鼠杂交,我们产生了新品系NOD/SCID/IL2Rγ-（/- NSG）小鼠,称为cNSG（中国NSG）小鼠。结果cNSG 小鼠完全缺乏T 细胞,B细胞以及NK细胞而且表达NOD突变。体内成瘤实验证实cNSG鼠是一种比免疫缺陷裸鼠更有效的异种移植模型。 结论cNSG 小鼠与Jackson实验室的NSG鼠的免疫缺陷一致,有望成为中国生物医学研究的重要异种移植模型。     

NOD/SCID小鼠模型在实验血液学研究中的应用

NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠是在SCID(重症联合免疫缺陷)小鼠的基础上与非肥胖性糖尿病小鼠(NOD/Lt)品系回交的免疫缺陷鼠.NODISCID小鼠既有先天免疫缺陷,又有T和B淋巴细胞缺乏,各种肿瘤细胞可以植入,且较少发生排斥反应及移植物抗宿主病(GVHD).所以NOD/SCID小鼠逐渐成为血液学实验研究的有用工具.本文从NOD/SCID小鼠的生物学特性、建立人类白血病模型、干细胞移植、药物研究及NOD/SCID小鼠应用中存在的不足和改良等方面综合述评.     

人脑胶质母细胞瘤PDX模型的建立

目的：探讨患者来源的异种移植（patient derived xenograft,PDX）胶质母细胞瘤模型的建立方法,为临床和生物学研究提供重要的理论依据和技术支持。方法：收集胶质母细胞瘤组织,建立皮下肿瘤模型,待皮下肿瘤生长取出肿瘤,分散肿瘤细胞并种于小鼠颅内。HE染色比较原发肿瘤组织与PDX肿瘤形态学特点,免疫组织化学染色方法检测Ki?67的表达,比较肿瘤增殖能力。结果：成功建立人脑胶质母细胞PDX模型,原发肿瘤和PDX肿瘤形态学特点相似,PDX肿瘤保留了原发肿瘤的增殖能力。结论：通过建立PDX模型,可以将PDX作为胶质母细胞瘤患者个体化治疗的重要临床前研究工具。     

人源性结肠癌组织异种移植模型在个体化药物治疗中的应用研究

目的 建立结肠癌人源性肿瘤组织异种移植(patient-derived xenograft,PDX)模型并研究其在化疗药物筛选中的应用价值.方法 将新鲜的人结肠癌手术标本移植于BAIB/c裸小鼠皮下建立结肠癌PDX模型,稳定传至第3代;将PDX模型肿瘤组织与人肿瘤组织H&E染色,比较其组织形态特征;免疫组织化学检测肿瘤...     

患者来源肿瘤异种移植模型的建立与应用

癌症是世界范围内重大的公共卫生问题之一,需要不断进行深入研究。建立合适的临床前模型对于肿瘤学转化研究至关重要。通过肿瘤细胞系建立的异种移植模型方便易用,广泛应用于肿瘤研究中,但在临床前药物的研发过程中存在明显局限性。而患者来源异种移植(PDX)模型直接将患者的肿瘤组织或细胞植入免疫缺陷小鼠体内,根据植入部位可分为异位植入和原位植入两类,从而保留其供体肿瘤的主要组织学和遗传特征,在肿瘤研究领域中显示出优势。本文介绍PDX模型的建立方法和特征,并就其在筛选抗肿瘤药物、鉴定生物标志物、共临床试验、个性化治疗等方面的应用及其局限性进行综述。     

食管鳞癌患者来源移植瘤模型：B-NDG®小鼠与BALB/c裸鼠的比较

目的 探讨不同品系的小鼠对于食管鳞癌患者来源的异种移植瘤（ESCC PDX）成瘤率的影响,为ESCC的临床个体化治疗建立更优势的临床前动物模型。方法 收集22例ESCC患者手术切除的肿瘤组织,分别利用B-NDG®（NSG）鼠和BALB/c裸鼠来建立ESCC PDX模型。通过观察移植瘤成瘤情况,测量移植瘤体积,绘制生长曲线图,计算成瘤率和成瘤时间,HE染色、免疫组化及基因组测序等实验,比较移植瘤组织与原患者肿瘤组织的一致性。结果 22例标本的PDX模型移植结束,发现NSG小鼠ESCC肿瘤发生率（50%,11/22）高于BALB/c裸鼠（18.18%,4/22）（P=0.027）。NSG小鼠的平均肿瘤成瘤时间为75.95 d短于BALB/c小鼠的91.67 d,差异具有统计学意义（P<0.001）。在NSG小鼠和BALB/c小鼠异种移植模型中,肿瘤均能保持病人ESCC肿瘤组织的形态学特征。基因分析结果显示,与BALB/c裸鼠相比,NSG小鼠肿瘤与亲代患者肿瘤样本间的基因相似度更高（P<0.0001）。结论 成功构建了NSG小鼠和BALB/c裸鼠ESCC皮下移植瘤模型,并发现NSG小鼠对于模型成功的建立更具有优势。     

尼美舒利对人胃癌原位移植模型作用的研究

目的研究尼美舒利(环氧化酶2抑制剂)对人胃癌组织原位移植非肥胖性糖尿病(non-obesitydiabetes,NOD)重度联合免疫缺陷(severe combined immune deficiency,SCID)小鼠模型的肿瘤转移抑制、血管生成和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法建立人胃癌细胞原位移植NOD SCID小鼠胃癌模型,40只小鼠均分成2组。移植后1周,分别静脉注射0.9%氯化钠溶液(0.9%氯化钠溶液组)和50 mg/kg.d-1尼美舒利(尼美舒利组),每周2次,共2周。第5周处死动物,观察肿瘤转移情况,免疫组织化学法检测肿瘤组织微血管密度及VEGF表达。结果0.9%氯化钠溶液组20只小鼠中肿瘤转移18只,尼美舒利组20只小鼠中转移5只,两组间差异有统计学意义(P<0.05)。0.9%氯化钠溶液组平均微血管密度为(9.5±2.9),尼美舒利组为(3.9±2.1),两组间差异有统计学意义(P<0.05)。0.9%氯化钠溶液组18只小鼠VEGF阳性表达,明显高于尼美舒利组的5只,两组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论尼美舒利通过抑制肿瘤组织VEGF表达和血管生成,抑制肿瘤转移。尼美舒利无明显出血等不良反应。     

小剂量K562细胞NOD/SCID小鼠动物模型的建立

[目的]探索建立小剂量(1×106)人急性红白血病K562细胞株的NOD/SCID小鼠动物模型及通过流式细胞仪对NOD/SCID小鼠的肿瘤负荷情况进行评价的可行性.[方法]实验组NOD/SCID小鼠分别经尾静脉接种K562细胞1×106、5×106,比较不同剂量接种实验组小鼠的生存时间、组织病理改变及通过流式细胞术对NOD/SCID小鼠体内的肿瘤标记进行检测.[结果]1×106及5×106 K562细胞接种的NOD/SCID小鼠的生存时间分别为(30.3±4.3)d和(22.2±3.7)d;其外周血、骨髓及肝、肺组织匀浆中均可发现不同比例的肿瘤细胞;通过流式细胞术检测5×106 K562细胞接种组NOD/SCID小鼠外周血、肝匀浆中人CD13表达水平显著高于1×10s接种组,而肺匀浆的CD13表达水平两组无显著性差异.[结论]小剂量(1×106)K562细胞NOD/SCID小鼠动物模型的建立是完全可行的,这有助于降低实验成本.     

建立非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠人白血病模型的实验研究

目的:建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的人白血病细胞株K562,并以此移植非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠,建立白血病研究的新动物模型.方法:用含GFP的逆病毒载体将标记基因GFP转入人白血病细胞株K562.NOD/SCID小鼠经2.5Gy的γ射线照射后,从尾静脉注射0.5×106个K562-GFP细胞(n=3;第1组);或1×106个K562-GFP细胞(n=3;第2组);或生理盐水作为对照组(n=2).移植后第6周用流式细胞术和PCR检测受鼠体内白血病细胞.结果:外源性GFP基因在K562细胞中稳定表达.移植后6周FCM检测,受鼠骨髓中的人源细胞比例均数分别为12.3%(第1组)和22.6%(第2组),并且外周血和脾脏也可检测白血病细胞.结论:用GFP标记的K562细胞移植NOD/SCID小鼠,成功建立了白血病动物模型.     

HD转基因大鼠兴奋毒性的敏感性

目的观察BNX小鼠生物学特性及肿瘤生长转移情况,为BNX小鼠的推广与应用提供基础资料。方法应用定期测定BNX小鼠体重、统计繁殖特性和检测BNX小鼠血液生理与生化指标的方法,初步探索BNX小鼠的生物学特性;应用原位移植和皮下移植的方法分别研究BNX小鼠在人胃癌(MKN-45)和人黑色素瘤(SCI-375)肿瘤动物模型研究中的应用。结果4～30周龄BNX小鼠的体重性别间差异有统计学意义(P<0.05);外周血常规指标中BNX小鼠的白细胞数只及正常小鼠的25%,而外周血清生化指标与正常小鼠相比没有明显的差异;人胃癌(MKN-45)BNX小鼠原位移植瘤模型和人黑色素瘤(SCI-375)BNX小鼠皮下移植瘤模型的转移率分别高于T细胞免疫缺陷的裸小鼠和T、B细胞联合免疫缺陷的SCID小鼠。结论BNX小鼠比一般的免疫缺陷动物更适合应用于肿瘤转移模型的研究。     

人源肿瘤异种移植模型在精准肿瘤医学中的研究进展

癌症是由于物理、化学、病毒等致癌因子导致的原癌基因和抑癌基因突变从而引发的一系列异质性疾病的统称。尽管近年来高通量测序技术与靶向治疗取得了突破性的进展,但是临床转化研究的高失败率使得抗肿瘤药物的创新发展十分有限。人源肿瘤异种移植模型(patient-derived xenograft model,PDX模型)是指直接将病人的新鲜肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠上,依靠小鼠提供的环境生长的一种异种移植模型。这种模型保留了原代肿瘤的基质异质性、组织学特性、分子多样性以及微环境,为临床前药效的个性化筛选评估以及生物标志物的鉴定提供了有效的研发资源。PDX模型结合临床数据,基因组图谱以及药效数据可以增加药物特异性,应用于肿瘤患者个体化治疗,提高临床治疗成功率。本文就PDX模型研究进展进行综述,包括其在肿瘤新疗法中的应用、挑战性与局限性、以及在精准肿瘤医学中的应用前景。     

肝癌人源肿瘤异种移植模型构建及初步应用

目的建立肝癌人源肿瘤异种移植(patient-derived xenografts,PDX)模型,探讨其在肝癌精准医疗中的作用。方法取临床肝癌新鲜手术切除标本,NCG小鼠皮下接种肿瘤组织建立PDX模型,HE染色比较移植肿瘤组织与患者肿瘤组织形态结构的一致性。将成功传至第三代的PDX模型制备肿瘤细胞悬液,BALB/c裸鼠皮下接种制作肝癌移植瘤模型15只,成瘤后随机分为5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)组、索拉非尼(sorafenib)组和阴性对照组,每组5只。定期监测各组荷瘤小鼠肿瘤体积和重量,根据瘤重计算抑瘤率,评估疗效。结果本研究共建成肝癌PDX模型6例,成功率为33.3%(6/18),模型较好的保持了原发肿瘤的特征。1例PDX模型中,5-FU与索拉非尼组肿瘤抑瘤率分别为63.7%和29.6%,5-FU组抑瘤率比较差异有显著性(P0.05),索拉非尼组抑瘤率比较差异无统计学意义,与临床结果相符。结论肝癌PDX模型保持了患者肿瘤组织的组织形态,可以适用于肝癌患者的精准医疗。     

人源非小细胞肺癌异种移植模型的建立和鉴定

目的建立人源非小细胞肺癌(NSCLC)异种移植模型,鉴定移植模型与原代肿瘤组织间组织形态结构、病理结构的一致性。方法取临床肺癌新鲜手术切除组织块26例,12 h内移植于裸小鼠背部皮下组织内,肿瘤长至500mm~3取出再传至下一批裸小鼠背部,如此重复,稳定传代至第4代,分别采用HE染色和免疫组织化学比较原代患者肿瘤组织与移植瘤组织结构和病理结构是否具有一致性。结果成功建立并稳定传至第4代的患者来源的移植瘤(PDX)模型共9例,6例肺鳞癌,3例肺腺癌。PDX模型保留了原代患者肺癌细胞的异型性和原有排列结构。病理学特性有些变化,但没有统计学意义上的差异。结论建立的NSCLCPDX模型保留了原代患者肺癌细胞的异型性、原有排列结构和病理学特性,为临床前药效的个性化筛选评估以及肺癌的研究提供了有效工具。     

人源肿瘤异种移植模型（PDX）在精准肿瘤医学中的研究进展

癌症是由于物理、化学、病毒等致癌因子导致的原癌基因和抑癌基因突变从而引发的一系列异质性疾病的统称。尽管近年来高通量测序技术与靶向治疗取得了突破性的进展,但是临床转化研究的高失败率使得抗肿瘤药物的创新发展十分有限。人源肿瘤异种移植模型（patient-derived xenograft model,PDX模型）是指直接将病人的新鲜肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠上,依靠小鼠提供的环境生长的一种异种移植模型。这种模型保留了原代肿瘤的基质异质性、组织学特性、分子多样性以及微环境,为临床前药效的个性化筛选评估以及生物标志物的鉴定提供了有效的研发资源。PDX模型结合临床数据,基因组图谱以及药效数据可以增加药物特异性,应用于肿瘤患者个体化治疗,提高临床治疗成功率。本文就PDX模型研究进展进行综述,包括其在肿瘤新疗法中的应用、挑战性与局限性、以及在精准肿瘤医学中的应用前景。