shRNA-Bmi1重组载体构建及其对胆囊癌裸鼠移植瘤hTERT表达的影响

目的体外构建及鉴定sh RNA-Bmi1重组载体,探讨靶向沉默原癌基因Bmi1对人胆囊癌细胞Bmi1m RNA表达、蛋白表达及对裸鼠皮下移植瘤h TERT表达的影响.方法针对Bmi1不同位点构建4个sh RNABmi1重组质粒,采用倒置荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR和Western blot检测各组Bmi1m RNA和蛋白表达,选择有效干扰组进行体内实验.构建GBC-SD裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为sh RNA-Bmi-4组(实验组)、sh RNA-Scramble(错配组),Lipofectamine(阴性对照组),GBC-SD(空白对照组).成瘤后进行移植瘤治疗,治疗6周后处死裸鼠,免疫组化检测裸鼠移植瘤h TERT蛋白表达水平.结果成功构建了sh RNA-Bmi1重组载体.转染胆囊癌48 h后倒置荧光显微镜观察发现sh RNA-Bmi1-4组GBC-SD绿色荧光强度增强、转染效率最高,RT-PCR及Western blot结果显示sh RNA-Bmi1-4组m RNA及蛋白表达量均明显低于各对照组(P<0.05),对照组间表达量差异无统计学意义(P>0.05).选取sh RNA-Bmi1-4组作为有效干扰序列作后续体内实验.免疫组化检测sh RNA-Bmi-4组裸鼠移植瘤h TERT蛋白表达水平明显低于各对照组(P<0.05),对照组间蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05).结论体外成功构建了sh RNA-Bmi1重组载体,顺利进行重组载体的转化和转染实验。靶向沉默Bmi1基因可有效促进胆囊癌细胞Bmi1m RNA降解、抑制其蛋白的表达,同时有效抑制GBC-SD裸鼠移植瘤h TERT蛋白表达.     

LAMβ1基因下调VEGF表达抑制人胆管癌裸鼠移植瘤生长

【摘要】 目的 探讨LAMβ1基因对人胆管癌细胞QBC939裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法 构建重组慢病毒LAMβ1过表达载体;将24只裸鼠按随机数字表分为3组,分别为实验组（转染LV LAMβ1）、阴性对照组（空载慢病毒）以及空白对照组,每组8只。制备密度为1×107/ml胆管癌QBC939细胞悬液,取02ml分别注入裸鼠皮下,每3d测量瘤体大小,4周后处死裸鼠取出裸鼠皮下瘤体。采用RT PCR、免疫组化检测瘤组织LAMβ1及VEGF表达。结果 成功构建过表达慢病毒LAMβ1载体;与阴性对照组和空白对照组比较,实验组裸鼠皮下移植瘤生长受到抑制,重量与体积明显减小（F体积=1804,P＜001;F重量=4287,P＜001）;实验组裸鼠瘤组织中LAMβ1 mRNA和蛋白水平较阴性对照组及空白对照组增高,转移因子VEGF mRNA和蛋白水平下降（P＜005）。结论LAMβ1基因过表达通过下调转移因子VEGF表达抑制胆管癌裸鼠皮下移植瘤的生长。     

靶向沉默RACK1基因对肺腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的:研究沉默RACK1基因对人肺腺癌细胞株A549裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法:使用人肺腺癌细胞株A549建立裸鼠皮下移植瘤模型。待肿瘤直径为0.3~0.5 cm时将荷瘤裸鼠随机分成3组,每组6只,分别于瘤内注射生理盐水(空白组)、空载质粒-脂质体复合物(空载组)及shRNARACK1质粒-脂质体复合物(实验组)。观察三组裸鼠的皮下移植瘤体积变化,绘制肿瘤生长曲线,并用Western blot检测各组肿瘤组织中RACK1蛋白的表达。结果:移植瘤形成后第28天,与空白组和空载组比较,实验组移植瘤生长速率、肿瘤体积和重量均明显降低(P0.05)。转染干扰载体RACK1-shRNA对裸鼠肺腺癌移植瘤的的抑瘤率为39%。Western blot结果显示,实验组移植瘤组织中RACK1蛋白的表达明显低于空白组和空载组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:沉默RACK1基因对肺腺癌裸鼠移植瘤生长有明显抑制作用。     

慢病毒载体介导siRNA沉默Id-1通过ERK1/2信号通路抑制裸鼠人肝癌移植瘤生长

目的 构建慢病毒表达载体介导siRNA沉默Id-1,观察其对人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及其对ERK1/2信号通路的影响。 方法 构建合成特异性针对Id-1基因的siRNA慢病毒载体,转染肝癌HepG2细胞系,经半定量RT-PCR鉴定筛选沉默效果最佳的细胞系,于倒置荧光显微镜(×400)下观察转染前后细胞的形态学变化。取细胞浓度为5×10⁶ mL^-1的干扰效率最佳的稳定转染细胞系、稳定转染空载体病毒细胞系及正常HepG2细胞系悬液各0.2 mL,分别注射到转染实验组、阴性对照组及空白对照组的裸鼠右腋皮下,每周测量肿瘤体积及裸鼠体质量,绘制肿瘤生长曲线,28 d后处死裸鼠,制作肿瘤组织标本,行常规病理检查,采用半定量RT-PCR及Western-blot方法检测肿瘤组织Id-1,ERK1/2的mRNA和蛋白的表达水平及p-ERK1/2的蛋白表达水平。 结果 倒置荧光显微镜显示,转染前后细胞形态学变化不明显。经半定量RT-PCR筛选出Id-1基因的siRNA慢病毒载体的最佳细胞系为sh31,与稳定转染空载体病毒细胞系相比,目的基因Id-1的表达降低了80%以上,与未干扰的HepG2细胞相比降低了60%; 转染细胞皮下接种后,转染组最终瘤体大小明显小于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。半定量RT-PCR显示,转染组肿瘤组织的Id-1及ERK1/2 mRNA分别为(0.389±0.058)及(0.475±0.079),均明显低于阴性对照组[(0.845±0.113),(0.977±0.082)]和空白对照组[(0.917±0.083),(0.978±0.056)](均为P<0.05)。Western-blot检测显示,转染组的Id-1及p-ERK1/2蛋白均明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。 结论 Id-1基因特异性siRNA的慢病毒表达载体通过靶向抑制Id-1的表达,明显抑制人肝癌细胞HepG2裸鼠皮下移植瘤的生长,推测Id-1可能通过调节ERK1/2 MAPK信号通路参与肝癌的发生发展。     

建立非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠人白血病模型的实验研究

目的:建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的人白血病细胞株K562,并以此移植非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠,建立白血病研究的新动物模型.方法:用含GFP的逆病毒载体将标记基因GFP转入人白血病细胞株K562.NOD/SCID小鼠经2.5Gy的γ射线照射后,从尾静脉注射0.5×106个K562-GFP细胞(n=3;第1组);或1×106个K562-GFP细胞(n=3;第2组);或生理盐水作为对照组(n=2).移植后第6周用流式细胞术和PCR检测受鼠体内白血病细胞.结果:外源性GFP基因在K562细胞中稳定表达.移植后6周FCM检测,受鼠骨髓中的人源细胞比例均数分别为12.3%(第1组)和22.6%(第2组),并且外周血和脾脏也可检测白血病细胞.结论:用GFP标记的K562细胞移植NOD/SCID小鼠,成功建立了白血病动物模型.     

PHF8基因对食管鳞状细胞癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的 利用慢病毒(lentivirus)介导的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)建立人食管鳞状细胞癌(esophageal squamous-cell carcinoma,ESCC,以下简称食管鳞癌)裸鼠移植瘤模型,观察锌指蛋白8(plant homeodomain finger protein 8,PHF8)对移植瘤生长的影响。方法 分别将未感染慢病毒(空白对照组)、感染Nonsilencing-shRNA慢病毒(阴性对照shRNA组)和PHF8 shRNA慢病毒(PHF8 shRNA组)的人食管鳞癌细胞系TE-1接种于裸鼠背部皮下,建立食管鳞癌裸鼠移植瘤模型。定期测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。4周后处死裸鼠,定量PCR及Western blotting法检测肿瘤组织中PHF8的表达。结果 PHF8 shRNA组较阴性对照shRNA组、空白对照组的裸鼠致瘤能力明显减弱,PHF8 mRNA和蛋白的表达水平显著降低。结论 慢病毒介导的shRNA干扰能有效减少食管鳞癌裸鼠移植瘤中PHF8的表达,而降低PHF8的表达能抑制食管鳞癌移植瘤的生长。     

KIAA1456抑制人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的生长

目的：探讨KIAA1456对人卵巢癌细胞株HO-8910PM裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法：将15只裸鼠随机分成3组：空白组（PM组）,阴性对照组[PM（NC）组],实验组[PM（KIAA1456）组]。利用人卵巢癌细胞株HO8910PM及本课题组前期通过慢病毒介导建立的阴性对照组细胞株HO8910PM（NC）和过表达KIAA1456的细胞株HO8910PM（KIAA1456）分别在空白组、阴性对照组、实验组建立裸鼠皮下移植瘤,待成瘤成功后,分别用PBS缓冲液和携带针对随机无关序列（NC）的慢病毒液Lentivirus-NC（作为阴性对照,LV-NC）,携带KIAA1456病毒液Lentivirus-KIAA1456（LV-KIAA1456）每隔4 d进行一次瘤内定点注射治疗至28 d处死裸鼠,绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率;采用实时荧光定量PCR和Western blot检测移植瘤组织中KI－AA1456的表达情况;免疫组化检测移植瘤中ki-67和PCNA的表达情况。结果：HO8910PM（KIAA1456）移植瘤组KIAA1456表达量明显高于阴性对照组和空白对照组（P=0.000）;28 d后处死裸鼠,HO8910PM（KIAA1456）组皮下移植瘤的体积明显小于阴性对照组和空白对照组（P=0.000）,抑瘤效果明显;移植瘤组织中KIAA1456的表达上调,ki-67和PCNA表达明显下调。HO8910PM（KIAA1456）组移植瘤组织中ki-67和PCNA的表达明显低于阴性对照组和空白对照组,差异具有统计学意义（P=0.000）。结论：过表达KIAA1456基因对人上皮性卵巢癌细胞HO8910PM裸鼠皮下成瘤的生长具有抑制作用,有望成为卵巢癌基因治疗的新靶点。     

hTERT启动子驱动的TRAIL联合放化疗对HeLa裸鼠移植瘤生长抑制的作用

目的:探讨hTERT启动子驱动的TRAIL联合放化疗对宫颈癌HeLa裸鼠皮下移植瘤生长抑制的作用. 方法:将含有hTERT启动子的TRAIL基因载体转染宫颈癌细胞HeLa,检测稳定转染细胞中GFP/TRAIL的表达;实验裸鼠分为基因组,化疗组,放疗组,综合组(基因 放化疗),对照组,每组5只,未转染HeLa组为对照组,不作任何处理;将稳定转染基因载体及未转染的HeLa细胞种植于裸鼠背部皮下,联合放化疗,来观察移植瘤成瘤情况,移植瘤的体积、质量以及质量抑制率的变化. 结果:转染hTERT-TRAIL细胞中GFP/TRAIL(绿色荧光蛋白)表达率高于对照组,有统计学意义 (P＜0.01);各组裸鼠在接种细胞第5～7日全部长出肿瘤小结节,结节出现的时间差异无统计学意义(P＞0.05);转染hTERT -TRAIL细胞与对照组HeLa细胞裸鼠的移植瘤质量相比差异有统计学意义(P＜0.05); hTERT -TRAIL细胞在裸鼠体内所形成的移植瘤生长较慢, 4 wk后肿瘤质量抑制率为43.08%,联合放化疗后肿瘤质量抑制率为61.63%,有统计学意义(P＜0.01). 结论:hTERT启动子驱动的TRAIL对人宫颈癌裸鼠移植瘤有明显的抑制作用,联合放化疗能抑制裸鼠移植瘤的生长. 基因治疗联合放化疗等多途径综合治疗为以后的肿瘤研究和临床治疗提供思路.     

131Ⅰ-KDR单克隆抗体抑制荷人膀胱癌SCID小鼠瘤体生长的实验研究

目的探讨131Ⅰ标记抗KDR单抗对SCID小鼠人膀胱癌皮下移植瘤模型瘤体生长的抑制作用.方法在复制SCID小鼠人膀胱癌皮下移植瘤模型的基础上,用131Ⅰ标记抗KDR单抗3G9,尾静脉注射荷瘤SCID小鼠作为实验组,以非标记抗KDR单抗3G9及生理盐水尾静脉注射荷瘤SCID小鼠作为对照组及空白组,观察131Ⅰ标记抗KDR单抗对SCID小鼠人膀胱癌皮下移植瘤模型瘤体生长的抑制作用.结果131Ⅰ-3G9尾静脉注射荷瘤SCID小鼠后3周,移植瘤瘤体内癌组织可见大片坏死,对照组移植瘤瘤体内癌组织也可见部分坏死,与空白组相比实验组与对照组对瘤体生长大小的抑制率分别为96.8%和87.7%.结论131Ⅰ-抗KDR单抗对肿瘤的抗血管生成治疗有潜在的临床应用前景.     

稳定靶向干扰候选抗药基因UGT1A9鼻咽癌细胞株建立

目的构建针对UGT1A9基因的shRNA慢病毒干扰表达载体;建立稳定UGT1A9干扰鼻咽癌细胞株,测定干扰效率。方法应用荧光定量PCR法检测UGT1A9 mRNA在鼻咽癌成瘤高转移细胞株5-8F和成瘤非转移细胞株6-10B之间的差异表达水平。构建重组UGT1A9 shRNA表达质粒pLentiU6/UGT1A9,经293FT细胞包装后,产生的慢病毒感染5-8F细胞,荧光定量PCR检测干扰效率。结果 UGT1A9在鼻咽癌细胞株中明显高表达。PCR、测序验证pLentiU6/UGT1A9-shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未干扰组相比,可明显抑制UGT1A9 mRNA水平。结论成功构建了稳定靶向干扰候选抗药基因UGT1A9的鼻咽癌细胞株,为研究UGT1A9可能参与介导鼻咽癌抗药的分子机理奠定了基础。     

靶向沉默人基因MDC1 表达对食管癌细胞放射增敏作用的实验研究

目的 利用RNA干扰技术抑制食管癌细胞ECA109细胞MDC1基因表达,观察其对细胞周期和放射敏感性的影响.方法 构建MDC1基因的干扰质粒pMDC1-shRNA,与慢病毒包装质粒混合物共同转染293T细胞,收集病毒液,感染ECA109细胞,采用Real-Time PCR和western blotting测定MDC1在mRNA水平和蛋白水平的表达.采用流式细胞术和克隆形成实验,检测RNA干扰对ECA109细胞放射敏感性的影响.结果 成功构建pMDC1-shRNA质粒,转染ECA109细胞.获得稳定转染细胞株ECA109/MDC1,基因MDC1在mRNA水平和蛋白水平的表达均明显降低;5 Gy射线照射后12 h、24 h、48 h,ECA109/MDC1的G2M期比例明显低于阴性对照组和空白对照组;ECA109、ECA109/NEGATIVE、ECA109/MDC1细胞的D0值分别为3.06 Gy、2.90 Gy、1.88 Gy;SF2值分别为0.91、0.89、0.84;Dq值分别为1159、1.47、1.20,显示ECA109/MDC1的D0值、SF2值、Dq值均明显降低.结论 RNAi技术可以有效地抑制食管癌细胞ECA109中基因MDC1的表达,从而增强ECA109细胞对放射线的敏感性.     

下调乙酰辅酶A合成酶2通过诱导自噬抑制非小细胞肺癌细胞增殖

目的：探讨乙酰辅酶A合成酶2（ACSS2）在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中的表达及其对细胞增殖、侵袭的调控机制。方法：采用蛋白质印迹（Western blot）实验检测并分析NSCLC细胞系A549和H1299与人成纤维细胞HFF-1中ACSS2表达的差异。利用慢病毒在NSCLC细胞系中构建ACSS2敲低（ACSS2 KD组）和对照细胞系（NC组）。采用MTT实验及细胞克隆形成实验分析ACSS2 对NSCLC细胞增殖的影响。采用划痕实验和Transwell实验分析ACSS2对NSCLC细胞的迁移和侵袭能力的影响。Western blot及免疫荧光实验分析敲低ACSS2 对细胞自噬的影响。结果：与人成纤维细胞HFF-1相比,NSCLC细胞中ACSS2 的蛋白表达水平明显升高（P ＜0.05）。与NC组相比,ACSS2 KD组细胞增殖能力和细胞活力显著降低,ACSS2 KD组细胞的迁移和侵袭能力均明显降低（均P ＜0.01）。Western blot和免疫荧光实验显示,敲低ACSS2 细胞自噬活性明显增加,自噬小体增多（P ＜0.01）。但是,敲低ACSS2几乎不影响caspase3和caspase8的蛋白表达水平（P ＞0.05）。ACSS2 shRNA+Beclin1/Atg7-shRNA共转染A549细胞（ACSS2+Beclin1/Atg7 KD组）,结果显示与ACSS2KD组比,ACSS2 KD+Beclin1/Atg7 KD组细胞增殖能力有所增强,克隆形成数目明显增多（P ＜0.05）。结论：ACSS2在NSCLC细胞中高表达,促进细胞的增殖、侵袭。下调ACSS2可诱导NSCLC细胞发生自噬性细胞死亡,抑制细胞增殖。     

小鼠Mmp-9 shRNA重组慢病毒包装、筛选及干扰效果检测

目的:设计、筛选、构建并鉴定Mmp-9小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),并构建其慢病毒表达载体,为血管化疾病的防治提供理论依据及实验室数据。方法:针对基质金属蛋白酶9靶基因设计siRNA序列,并合成小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)结构的DNA,与经AgeΙ和EcoRΙ酶切的pSIL-RFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,构建成携带Mmp9-shRNA慢病毒质粒载体(pSIL-RFP/MMP9-shRNA),PCR及测序鉴定后,Western blot筛选出携带最佳siRNA的慢病毒质粒载体,并利用慢病毒包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)将其制备成MMP9-shRNA慢病毒,并测定病毒滴度为1×1010pfu/l。结果:PCR和DNA测序证实合成的含基质金属蛋白酶9短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pSIL-RFP载体,表明实验成功构建基质金属蛋白酶9RNA干扰慢病毒表达载体。结论:成功的构建并筛选出针对小鼠Mmp9基因沉默的特异性shRNA重组慢病毒,为血管化性疾病的防治研究提供基础。     

携带GFAP启动子的慢病毒载体介导外源基因在肝星状细胞的特异表达

 目的  旨在构建包含由GFAP启动子介导的荧光素酶的慢病毒载体,检测体内外靶向肝星状细胞的外源基因表达的特异性和效率。方法  通过报告基因实验筛选介导效率较高的GFAP启动子,以CMV 启动子作为阳性对照分别介导荧光素酶在小鼠肝星状细胞(JS1)、人肝星状细胞(LX-2)及人肝细胞(L-02)中的表达。通过尾静脉注射将包装的慢病毒注射到四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠体内,通过活体成像和Western blot检测慢病毒颗粒在小鼠体内的分布,并通过免疫双荧光染色检测肝星状细胞的特异表达。结果  人GFAP启动子比小鼠GFAP启动子驱动基因表达的效率高,而且在LX-2和JS1细胞中,人GFAP启动子介导的荧光素酶的活性及表达显著高于L-02细胞。活体成像显示小鼠腹部有荧光素酶的表达。GFAP启动子介导的荧光素酶可以与肝星状细胞的特异性生物标记蛋白GFAP、Desmin和α Sma共定位。结论  成功构建包含由GFAP启动子介导的荧光素酶的慢病毒载体,在体外细胞系以及小鼠体内肝中均可以实现荧光素酶在肝星状细胞中特异性表达。     

RHBDF2-shRNA慢病毒载体的构建和Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系的建立

目的：构建RHBDF2-shRNA慢病毒载体,建立Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,并检测稳转细胞株中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。方法：根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成针对RHBDF2基因干扰靶点的shRNA-oligo,退火后将其连接到经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒载体FV067-RNAi-EGFP-Puro中,构建FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒,通过PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。使用HEK293T细胞和Neuro-2a细胞作为实验材料,FV067 Vector作为对照组,FV067-RHBDF2-shRNA作为实验组。通过Lipofectamine 2000将FV067 Vector和FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒分别与慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2G共转染至HEK293T细胞中,转染48 h收集并纯化慢病毒,分别将对照组FV067 Vector和实验组FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒在感染复数（MOI）为50时感染Neuro-2a细胞,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,采用2 mg·L^-1嘌呤霉素筛选出RHBDF2基因稳定沉默的细胞系。实时荧光定量PCR法检测2组细胞中RHBDF2 mRNA表达水平,免疫印迹法检测2组细胞中RHBDF2蛋白表达水平。结果：PCR和测序,RHBDF2-shRNA慢病毒载体中的干扰序列与设计合成的RHBDF2-shRNA-oligo序列完全一致。FV067 Vector慢病毒的滴度为5×10⁸ TU·mL^-1,FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒的滴度为3×10⁸ TU·mL^-1。实时荧光定量PCR检测,实验组稳转细胞株中RHBDF2 mRNA表达水平比对照组降低了52.26%（t=11.44,P=0.0076）。免疫印迹法检测,与对照组比较,实验组RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2蛋白表达水平降低了47%（t=6.374,P=0.0078）。结论：成功构建了FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒载体并建立了Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,且Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2mRNA和蛋白表达水平明显降低。     

RNA干扰抑制ERCC1对非小细胞肺癌化疗敏感性的影响

目的 探讨利用RNA干扰技术沉默切除修复交叉互补基因组1(ERCC1)表达对非小细胞肺癌耐药细胞株顺铂化疗敏感性的影响.方法 设计并合成3段靶向人的ERCC1基因的小分子干扰RNA(siRNA),构建携带ERCC1-shRNA的重组质粒表达载体,采用脂质体Lipofectamine 2000转染入人肺癌细胞株A549/...     

PKM2基因沉默对人肺癌细胞生物学特性的影响

目的 探讨M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2,PKM2）下调对人肺癌A549细胞生物学特性的影响。方法 采用免疫荧光技术检测A549细胞中PKM2蛋白的表达;将构建有PKM2-shRNA的重组质粒转入A549细胞;分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测PKM2 mRNA和蛋白表达水平;CCK-8法检测PKM2基因沉默对A549细胞增殖能力的影响;采用葡萄糖测定试剂盒测定细胞对葡萄糖的消耗量;Transwell实验检测细胞穿过人工基膜的能力。结果 肺癌A549细胞的细胞质及细胞核中均有PKM2表达;PKM2-shRNA质粒转染A549细胞48h后,可明显下调A549细胞中PKM2 mRNA及蛋白的表达水平,并且明显抑制A549细胞增殖;PKM2 shRNA可减少A549细胞葡萄糖的消耗,还可抑制细胞侵袭能力。结论 在肺癌细胞A549中,抑制PKM2表达可显著抑制细胞增殖、侵袭和糖代谢能力。     

Bmi1基因沉默对人舌鳞癌细胞生物学功能的影响

目的:检测Bmi1(B lymphoma Mo-MLV insertion region 1)在舌鳞癌细胞与正常舌黏膜中的表达差异,探讨Bmi1基因沉默后对口腔舌鳞癌细胞生物学功能的影响?方法:实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测Bmi1蛋白和mRNA在舌鳞癌细胞系和正常舌黏膜组织中的表达情况;采用免疫荧光染色检测Bmi1在舌鳞癌细胞中的分布情况;通过短发夹shRNA有效抑制Bmi1表达后,MTT实验检测其对舌鳞癌细胞增殖能力的影响;划痕实验检测其对舌鳞癌细胞迁移能力的影响;Transwell实验检测其对舌鳞癌细胞侵袭的影响;克隆形成实验检测其对舌鳞癌细胞克隆形成率的影响;构建移植瘤实验观察其对移植瘤生长的影响?结果:Bmi1在舌鳞癌细胞中高表达,而在正常舌黏膜中低表达(P < 0.05);Bmi1基因沉默后显著抑制舌鳞癌细胞的增殖?侵袭?迁移能力以及抑制体内移植瘤的生长(P < 0.05),这与Bmi1对下游靶基因P16?P14和E-cadherin的调控有关?结论:Bmi1与舌鳞癌多种恶性生物学功能的调控密切相关,可能是舌鳞癌潜在的治疗靶点?     

水通道蛋白3介导过氧化氢转运对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移的作用研究*

目的 探讨水通道蛋白3（AQP3）介导肿瘤微环境中过氧化氢（H2O2）转运对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移的作用。方法 应用宫颈癌HeLa细胞,构建AQP3 shRNA慢病毒稳定转染宫颈癌细胞系,通过克隆形成、CCK-8、细胞平板克隆形成、Western blotting等比较H2O2处理前后细胞表型的差异。结果 成功构建AQP3-464- shRNA慢病毒稳定转染HeLa细胞系,AQP3 shRNA抑制肿瘤微环境中H2O2转运,抑制宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移,AQP3 shRNA抑制肿瘤微环境中H2O2转运调控下游信号蛋白激酶B（PKB）。结论 AQP3介导宫颈癌HeLa细胞中H2O2跨膜转运,激发细胞内依赖第二信使H2O2的下游信号PKB,促进HeLa细胞的增殖、迁移。