重组幽门螺杆菌粘附素工程菌高密度发酵条件的研究

目的研究重组幽门螺杆菌粘附素基因工程菌的发酵工艺.方法采用德国B.Brau公司C-10型15 L发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行了优化.结果在优化的条件下,15 L发酵罐发酵工程菌,菌体收获量可达48.2g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的31.5%.结论此发酵工艺可以提高工程菌收获和目的蛋白的表达.     

重组人血管内皮细胞生长因子工程菌高密度发酵工艺研究

目的建立人血管内皮细胞生长因子(BL21/pET-24a/hVEGF121)工程菌的高密度发酵工艺.方法采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、诱导时间及补料进行优化.结果采用M9复合培养基、活化至对数生长期时诱导4 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,可使菌体量提高至68 g/L,rhVEGF121的表达量达菌体蛋白总量的23%.结论该发酵工艺提高了工程菌的产量和rhVEGF121的表达水平.     

重组SRH融合蛋白工程菌发酵的工艺研究

目的通过对影响表达SRH融合蛋白工程菌发酵的主要因素的研究,建立适宜SRH融合蛋白工程菌的发酵工艺。方法通过对发酵过程中的pH、溶氧调控、诱导温度、诱导时机及诱导时间进行优化建立SRH蛋白的发酵工艺,利用SDS-PAGE电泳分析表达情况。进一步利用离子交换和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,并对纯化后目的蛋白的溶栓活性和抗凝活性进行检测。结果优化后发酵条件为:发酵pH为7.0、溶氧为45%、菌体浓度达到OD600=8时开始诱导,诱导温度为41℃,诱导时间为4.5h。该发酵条件下得菌量为25g/L。SRH蛋白表达量为45%,并且90%以上为可溶性表达,纯化后蛋白纯度达95%以上,纯品SRH蛋白溶栓活性为1.80×104AU/mg,抗凝活性为100AU/mg。结论建立了SRH融合蛋白工程菌稳定的发酵工艺,该条件下SRH工程菌发酵蛋白表达量较高,多为可溶性表达,且杂蛋白较少,发酵产物具有生物学活性。     

溶氧反馈-补料分批技术高密度培养基因重组MAGE1/HSP70/MAGE3工程菌

目的 建立人黑色素瘤抗原MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白基因重组工程菌E.coli.BL21/pET-MHM的高密度发酵工艺.方法 以摇瓶发酵结果为基础,扩大至NBS Bioflo Ⅳ 20 L发酵罐发酵,利用溶氧反馈-补料分批培养技术,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、活化时间、诱导浓度及时间、pH值及分批补加营养物质等进行优化.结果 保持培养过程中40%的溶解氧,采用半合成培养基、活化至对数生长期时0.2 mmol/L IPTG诱导5 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,连续3批重复发酵,最终菌密度D(600)均达45～50时,菌体量可提高至70 g/L以上,目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38%以上.结论 确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺.     

HSPC016基因重组工程菌发酵研究

目的研究人毛乳头细胞HSPC016基因重组工程菌的发酵工艺.方法采用德国B.Brau公司C-10型5 L发酵罐批次发酵,通过对能影响工程菌生长和目的蛋白表达的条件如不同培养基、不同葡萄糖浓度、营养物补充、pH及溶氧调节等进行优化,确定合适的培养条件和发酵工艺.结果在优化条件下,菌体单产可达45 g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的18%.结论此发酵工艺可以提高人毛乳头细胞HSPC016/pET-28a( )基因重组工程菌的收获和目的蛋白表达.     

重组LTB-UreB融合基因工程菌发酵工艺研究

目的：研究大肠杆菌表达重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB－UreB)融合基因工程菌BL21的发酵工艺，方法：采用德国B.Brau公司C－10型15L发酵罐发酵，对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行了优化，结果：在优化的条件下，15L发酵罐发酵工程菌，菌体收获量可达52．2g/L，目的蛋白表达量约占总蛋白的27％，结论：此发酵工艺可以提高工程菌收获和目的蛋白的表达。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因工程菌发酵工艺的研究

目的研究建立大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因工程菌的发酵工艺.方法先通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件,然后以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件,并进一步对发酵工艺进行改良优化.结果经试验确定了rLTB基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合,优化后工程菌菌体产量平均可达40.5 g/L,目的蛋白的表达率平均为30.6%.结论建立了稳定、高效的工程菌发酵工艺.     

重组人血管内皮细胞生长因子工程菌高密度发酵工艺研究

目的 建立人血管内皮细胞生长因子(BL21/pET-24a/hVEGF₁₂₁)工程菌的高密度发酵工艺。方法 采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、诱导时间及补料进行优化。结果 采用M9复合培养基、活化至对数生长期时诱导4 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,可使菌体量提高至68 g/L,rhVEGF₁₂₁的表达量达菌体蛋白总量的23%。结论 该发酵工艺提高了工程菌的产量和rhVEGF₁₂₁的表达水平。     

重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)高密度发酵工艺研究

目的建立重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)的高密度发酵工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,扩大至发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、培养温度、pH值、活化时间、诱导时间及分批补加营养物质等条件进行优化。结果采用改良M9-CA培养基、37℃活化4 h后以0.2 mmol/L IPTG诱导表达4 h,以甘油为碳源,在生长期和诱导期分别以40 ml/h和70 ml/h的速率连续流加补料,全程滴加氨水保持培养基pH值保持在7.5,调节转速控制溶解氧在40%左右。最终菌体产量提高至40 g/L以上,CR1-SCR15-18蛋白表达率达28%以上。结论高密度发酵工艺显著提高了工程菌的产量和CR1-SCR15-18蛋白的表达水平。     

重组呼吸道合胞病毒G蛋白基因工程菌的发酵条件研究

目的研究呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）G蛋白基因工程菌的发酵工艺。方法通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件和表达条件，以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件，对发酵丁艺进行改良优化。结果确定了RSVG蛋白基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合：在LB＋葡萄糖的培养基中，搅拌速度为200r／min，培养温度为37℃，pH值为7．0，诱导时温度为25℃，IPTG浓度为0．01mmol／L，优化后T程菌菌体的产量可以达到39．20g／L，目的蛋白表达率平均为18．1％。结论建立了稳定高效的重组RSVGT程菌发酵工艺。     

重组人肝细胞生长因子β链工程菌的高密度发酵

目的　实现重组人肝细胞生长因子 β链 (rhHGFβ)工程菌的高密度高表达发酵。 方法　首先在摇瓶中进行了培养条件的摸索 ,确定了该工程菌的培养条件、诱导起始时间和诱导时间 ,然后用 15L自控发酵罐进行分批补料培养 ,发酵中分阶段限制性流加氮、碳源 ,保持溶氧在 30 %以上。结果　菌体发酵密度达到 39g/L(湿菌重 ) ,达到并超过了重组蛋白在摇瓶中的表达水平 ,重组蛋白的表达占菌体总蛋白的 30 %左右。结论　本研究为rhHGFβ进一步下游纯化及功能研究奠定了基础。     

用重组大肠杆菌生产rhG-CSF高密度发酵的方法

目的 :优化重组人粒细胞集落刺激因子 (recombinanthumangranulocytecolony stimulatingfactor,rhG CSF)的生产工艺 ,了解菌体生长和产物合成规律 ,为rhG CSF的工业化生产提供依据 .方法 :以摇瓶发酵的研究结果为基础 ,在 5L发酵罐中 ,测定工程菌rhG CSF的生长曲线 ,根据在不同pH值、溶氧和诱导时机时工程菌生长的情况 ,研究重组大肠杆菌DH5(/pBV2 2 0生产rhG CSF分批补料培养的工艺条件 ,确定 5L发酵罐稳定的发酵工艺参数 .结果 :培养工程菌的优化条件为 :发酵前期流加 2mol/L的氢氧化钠控制pH值为 7.2 ,当开始诱导表达时 ,控制pH为 6 .8;溶氧水平控制在 5 0 %以上 ;选择菌体在对数生长中期A60 0nm值为 1 2 .0进行诱导表达 .在此优化的培养条件下 ,菌体A60 0nm值达到 (2 1 .3± 0 .9) ,细胞干质量可达 (1 2 .3± 0 .7)g/L ,细胞湿体积质量为 (4 3.8± 0 .9)g/L ,rhG CSF的表达量为 (4 1 .9± 1 .6 ) % .结论 :pH值、溶氧和诱导时机等培养条件对工程菌生长和表达有显著影响     

重组复合干扰素基因工程菌发酵培养条件的研究

目的:研究表达重组复合干扰素(con-IFN)的工程菌E.coliDH5α(pBV220/con-IFN)的发酵条件。方法:在摇瓶实验中,采用正交设计法和均匀设计法确定较佳培养基组分;使用20 L发酵罐进行补料分批发酵实验,研究影响菌体生长和con-IFN表达的因素(如溶氧、补料、温度和诱导时间)。结果:发酵培养基配方为蛋白胨10 g/L,酵母膏7.5 g/L,甘油0.5%,Na2HPO4.12H2O 20.13 g/L,KH2PO410.37 g/L,NaCl 9.31 g/L。确定了高密度发酵工艺,即优化的发酵培养基,初始pH7.2,接种量5%,溶氧15%,先经35℃培养4 h,后降温至30℃培养2 h,再以42℃诱导7 h,诱导的同时补料酵母膏0.5%。在此条件下,发酵液可得15.2 g/L湿菌体,con-IFN的表达量占菌体总蛋白的49.60%,每毫升发酵液的抗病毒活性为9.69×108IU。结论:获得了较满意的优化培养基配方和发酵条件,为下游纯化和进一步大规模生产奠定了基础。     

幽门螺杆菌Omp22-HpaA融合基因工程菌蛋白的表达

目的:优化幽门螺杆菌Omp22-HpaA基因工程菌pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1的表达条件,并对其表达产物进行纯化和鉴定.方法:在不同诱导时机、不同诱导剂(IPTG)浓度和不同诱导时间条件下诱导pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1的表达,测定目的蛋白的表达量.在优化条件下诱导工程菌表达,并应用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,采用Amyloss树脂预装柱对可溶性Omp22-HpaA蛋白进行分离、纯化,对纯化后的蛋白行Western blot分析.结果:工程菌培养2 h时加入IPTG(终浓度为0.4 mmol/L)诱导7 h,目的蛋白Omp22-HpaA表达量达到菌体总蛋白的20%以上.经纯化得到了较高纯度(＞90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫原性.结论:建立了从pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1可溶性表达产物中纯化较高纯度Omp22-HpaA融合蛋白的方法.     

利用恒溶氧-补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组肿瘤导向多肽LTL-TNF

目的　探讨重组肿瘤导向多肽 L TL - TNF工程菌的大规模培养与表达方法以获取重组 L TL TNF.方法　首先在试管和三角瓶中探讨工程菌的生长和表达规律 ,筛选其最适宿主菌、最佳培养及诱导表达条件 ,然后在 5 L 自控发酵罐中进行分批补料培养 .结果　保持培养过程中 30 %～ 40 %的溶解氧和限制性流加葡萄糖 ,工程菌 DH5 α/ p BV- L TL TNF在5 L 发酵罐中培养至终密度 A6 0 0 nm 40～ 5 0时 ,目的蛋白的表达最高 ,可达菌体总蛋白的 5 0 % ,L TL - TNF的含量达到5 .12 g· L- 1 ,发酵总时间在 12 h左右 .结论　确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺 ,为重组肿瘤导向多肽L TL TNF工程菌的工业化生产奠定了基础 .     

幽门螺杆菌hpaA基因工程菌蛋白表达条件优化、纯化及其活性鉴定

目的:优化幽门螺杆菌hpaA基因工程菌(pMAL-c2X-hpaA-TB1)的表达条件,并对其表达产物进行纯化和免疫活性鉴定.方法:通过诱导表达实验了解不同诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间对蛋白表达量的影响, 并应用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析;Amyloss树脂预装柱对可溶性HpaA蛋白进行分离、纯化;对纯化后蛋白做Western blot实验鉴定免疫活性.结果:该工程菌培养2 h时加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.3 mmol/L进行诱导4 h,目的蛋白表达量达到菌体总蛋白的30%以上;经纯化得到了较高纯度(＞90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫活性.结论:建立了从TB1(pMAL-c2X-hpaA)可溶性表达产物中纯化高纯度rHpaA融合蛋白的方法,为进一步的动物实验和诊断性抗原的研制以及工程菌发酵、高效表达生产工艺的研究打下了基础.     

重组胸腺素α1 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌三角摇瓶培养条件的优化

目的对重组胸腺素α1pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌的培养条件进行优化。方法在摇瓶培养条件下探讨工程菌的生长和表达规律,对pMAL-C2x-Tα1/TB1菌种的培养基装量、接种量、诱导剂异丙基硫化半乳糖苷(IPTG)加入时间和浓度、诱导时间进行了实验和优化。结果由摇瓶培养获得的数据表明pMAL-C2x-Tα1/TB1最优培养条件为:10%接种量、100 mL LB培养基、37℃培养,接种后3 h,入终浓度为0.75 mmol/L的IPTG,诱导4 h后目的蛋白表达量最高。结论优化的培养条件为菌种的发酵工艺奠定了基础。     

幽门螺杆菌多靶点疫苗工程菌BIB发酵及纯化工艺研究

目的初步建立重组幽门螺杆菌多靶点疫苗工程菌（BIB）的高密度发酵及其蛋白纯化工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,放大工艺至50L发酵罐中,对影响目的蛋白收率的因素如发酵培养基、工作种子接种量、诱导剂浓度、诱导起始时间、诱导持续时间及诱导剂添加方式等进行优化验证;并利用rBIB蛋白高等电点特性（pI=9.05）,在pH 7.0-7.5的磷酸盐缓冲液中目的蛋白带正电荷,采用阳离子交换层析进行纯化,对阳离子交换层析填料及纯化缓冲液的pH进行优化。结果经高密度发酵后BIB菌体产量为70g/L,蛋白表达量为32%;rBIB蛋白经阳离子交换层析纯化后其纯度为91.8%。结论该工艺的初步建立为深入研究rBIB蛋白性质及其规模化生产奠定了基础。     

诱导重组人生长激素工程菌高效表达的研究

目的 筛选诱导重组人生长激素（rhGH)工程菌高效表达的最佳条件，为中试及工业化发酵培养提供依据。方法 质粒PBV－GH转化4种不同宿主菌，比较6种不同培养基在不同pH值、氧含量改变情况下，rhGH工程菌的生长和表达差异，筛选并确定最适宿主菌、最佳培养基及最佳诱导表达条件。结果 ①E.coli DH5α为最适宿主菌；②TB培养基为最佳培养基；③培养基pH7.5-7.8有利于目的蛋白的表达。④在半对数生长期（培养4－5h)迅速升温，且菌密度控制在D600nm3.0之前诱导可获得较高的重组蛋白表达量，rhGH表达量占菌体总蛋白的40％。发酵时间为10h。结论 E.coli DH5α为rhGH高效表达的最适工程菌，E.coli DH5α/PBV-GH在pH7.5-7.8的TB培养基中发酵生长10h，可使菌量最佳扩增，目的产物rhGH表达效率最高。     

人源抗HBS-Fab-IFN-α融合蛋白制备和纯化

目的:用生物发酵方法大量制备含重组质粒pBAD/HBs-Fab-IFN-α的Topl0大肠杆菌,用金属亲和层析方法纯化大肠杆菌表达产物,获得大量高纯度的人源抗HBS-Fab-IFN-α融合蛋白。方法:选取含重组质粒pBAD/HBs-Fab-IFN-α的Topl0大肠杆菌单克隆菌落,通过制备一级及二级种液,按比例加入5L发酵罐中进行发酵,发酵过程中在菌体起始密度、诱导剂加入时机、诱导时间以及诱导温度等条件探索成熟的基础上,采用50L大型发酵罐进行批量发酵。所获菌体蛋白通过饱和硫酸铵粗提和Ni-NTA金属螯和层析获得较纯的表达产物,比较表达量,鉴定纯化后蛋白的抗原活性及生物学活性。结果:用5L及50L发酵罐能获得较高蛋白产量的大肠杆菌,经饱和硫酸铵粗提及Ni-NTA金属螯和层析纯化后可获得抗原性及生物学活性较好的抗体片段。结论:发酵罐发酵大肠杆菌,产量高,所获蛋白含量活性较稳定,为批量生产作了准备。