上调NDRG1基因表达对肺腺癌细胞增殖与凋亡的影响

［摘要］目的: 建立稳定转染N myc下游调节基因1（N-myc downstream regulated gene 1,NDRG1）的A549细胞株,探讨NDRG1对A549细胞增殖与凋亡的影响及其可能的分子机制。方法: 经脂质体介导将含有NDRG1的重组表达质粒转染人肺腺癌A549细胞株,采用G418筛选阳性细胞克隆并进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白质印迹鉴定;qRT-PCR和蛋白质印迹检测阳性细胞克隆P21及鼠双微体基因2（murine doubleminute 2,MDM2）的表达;MTT比色法检测阳性细胞克隆的增殖活性;流式细胞仪检测阳性细胞克隆凋亡率。结果: 成功建立高表达NDRG1的阳性A549细胞克隆（N11）;N11细胞P21表达及细胞凋亡率显著增高（P<0.05）,而MDM2表达及细胞增殖显著降低（P<0.05）。结论: 上调A549细胞NDRG1表达后,细胞凋亡增加而细胞增殖降低,其作用机制可能与P21表达增高而MDM2表达降低有关。     

CTGF基因转染对宫颈癌细胞MMP-2、MMP-9表达及细胞增殖的影响

目的:研究结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)基因对人宫颈癌Hela细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达及细胞增殖的影响,探讨CTGF在宫颈癌侵袭和转移中的作用机制。方法:经脂质体介导将含有CTGF重组表达质粒转染人宫颈癌Hela细胞株,用G418筛选阳性细胞克隆及实时荧光定量PCR、蛋白质印迹鉴定;采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测阳性克隆细胞MMP-2及MMP-9的表达;噻唑盐(MTT)比色法检测阳性细胞克隆的增殖活性。结果:成功建立稳定高表达CTGF的阳性Hela细胞克隆,证实其MMP-2、MMP-9表达及细胞增殖活性均显著增高。结论:CTGF转染可显著增加宫颈癌细胞MMP-2及MMP-9的表达并促进其细胞增殖,CTGF可能是宫颈癌基因治疗的潜在靶点。     

CTGF基因转染对胰腺癌细胞MMP-9、VEGF表达及增殖的影响

目的：通过研究结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）基因对人胰腺癌SW1990细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、血管内皮生长因子（VEGF）表达及细胞增殖的影响,深入探讨CTGF在胰腺癌侵袭和转移中的作用机制。方法：经脂质体介导将含有CTGF重组表达质粒转染人胰腺癌SW1990细胞株,用G418筛选阳性细胞克隆及RT-PCR、蛋白质印迹法鉴定;采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测阳性细胞克隆MMP-9及VEGF表达的改变;噻唑盐（MTT）比色法检测阳性细胞克隆的增殖活性。结果：成功建立稳定高表达CTGF的阳性SW1990细胞克隆,与对照组相比,阳性克隆MMP-9、VEGF mRNA及蛋白表达显著增高,细胞增殖活性也显著增加。结论：CTGF转染可显著增加胰腺癌细胞MMP-9、VEGF的表达并促进其细胞增殖,CTGF可能是胰腺癌基因治疗的潜在靶点。     

宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1、COX-2、VEGF的表达及其临床意义

目的: 观察N-myc下游调节基因-1(N-myc downstream regulated gene-1,NDRG-1)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达,分析其在宫颈鳞状细胞癌发生发展中的作用及意义。方法: 采用免疫组织化学法检测80例宫颈鳞状细胞癌患者癌组织和15例正常宫颈组织中NDRG-1、COX-2及VEGF蛋白表达情况;分析宫颈鳞状细胞癌组织中3种蛋白表达的相关性,并分析其表达与临床病理因素及患者预后的关系。结果： 与正常宫颈组织比较,宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1阳性表达率明显降低(P＜0.01);COX-2与VEGF阳性表达率明显升高(P＜0.01)。NDRG-1、COX-2及VEGF蛋白的阳性表达与宫颈鳞状细胞癌患者的年龄及肿瘤大小无关(P＞0.05),而与肿瘤组织病理学分级、FIGO分期及淋巴结转移密切相关(P<0.01)。Kaplan-Meier生存分析显示,宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1表达阳性者生存期较长,COX-2及VEGF表达阳性者生存期较短。结论： 宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1表达降低,而COX-2及VEGF表达增加,三者表达的联合检测可能对判断宫颈鳞状细胞癌的预后具有重要价值。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭力的影响

目的 研究特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭能力的影响。方法 以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,分别为CaSKi-R和CaSKi-P。观察细胞的生长状态,测定CaSKi,CaSKi-R和CaSKi-P3种细胞的生长曲线、软琼脂克隆形成率、细胞侵袭力实验、裸鼠体内致瘤性,以及RT-PCR检测细胞中COX-2、血管内皮生长因子(VEGF)的表达,同时,免疫组化检测3种细胞COX-2、VEGF抗原表达,分析特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭力的影响。结果 CaSKi、CaSKi-P细胞生长速率、软琼脂克隆形成率、致瘤性和侵袭力相近,而CaSKi-R细胞的细胞生长速率、软琼脂克隆形成率、致瘤性和侵袭力与以上两种细胞相比却明显降低。RT-PCR检测CaSKi-R细胞的COX-2、VEGF表达水平也低于CaSKi、CaSKi-P细胞的表达。细胞免疫组化测定CaSKi、CaSKi-P和CaSKi-R细胞都有COX-2、VEGF抗原表达,而CaSKi-R细胞的抗原染色程度较弱。结论 特异性抗HPV16E6核酶的导入降低了宫颈癌CaSKi细胞的增殖和侵袭表型,可能与宫颈癌CaSKi细胞内COX-2、VEGF的表达水平降低有关。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭力的影响

目的研究特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭能力的影响。方法以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞，分别为CaSKi-R和CaSKi—P。观察细胞的生长状态，测定CaSKi．CaSKi—R和CaSKi—P3种细胞的生长曲线、软琼脂克隆形成率、细胞侵袭力实验、裸鼠体内致瘤性，以及RT—PCR检测细胞中COX-2、血管内皮生长因子(VEGF)的表达，同时，免疫组化检测3种细胞COX-2、VEGF抗原表达．分析特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭力的影响：结果CaSKi、CaSKi—P细胞生长速率、软琼脂克隆形成率、致瘤性和侵袭力相近，而CaSKi-R细胞的细胞生长速率、软琼脂克隆形成率、致瘤性和侵袭力与以上两种细胞相比却明显降低。RT—PCR检测CaSKi—R细胞的COX-2、VEGF表达水平也低于CaSKi、CaSKi—P细胞的表达。细胞免疫组化测定CaSKi、CaSKi—P和CaSKi—R细胞都有COX-2、VEGF抗原表达，而CaSKi—R细胞的抗原染色程度较弱。结论特异性抗HPV16E6核酶的导入降低了宫颈癌CaSKi细胞的增殖和侵袭表型，可能与宫颈癌CaSKi细胞内COX-2、VEGF的表达水平降低有关。     

人乳头瘤病毒16型E5对人宫颈癌SiHa细胞恶性潜能的影响及其机制探讨

目的 通过构建和筛选持续表达HPV16E5的细胞SiHa/16E5,探讨HPV16E5对宫颈癌SiHa细胞的作用及机理.方法 利用pEGFP-C1构建HPV16型E5的正义全长真核表达载体并稳定转染SiHa细胞;利用RT-PCR和Western印迹技术检测转染前后E5和P21基因的mRNA和GFP+E5和P21蛋白的变化;利用MTT法检测SiHa细胞稳定转染后的增殖活性;利用软琼脂克隆形成和裸鼠成瘤实验分别在体内外验证了SiHa/16E5细胞的致瘤情况.结果 稳定转染携带.HPV16全长E5基因的质粒后,SiHa细胞中E5基因的mRNA和相应蛋白表达明显升高,而P21的表达则明显下调;MTT结果 显示稳定转染后细胞的增殖活性与转染空载体细胞和未转染细胞比较明显增高(P<0.05);软琼脂克隆形成结果 示:SiHa/16ES细胞组的可隆形成数为33.4±1.6,与空质粒对照组细胞(15.1±3.1)及未转染组细胞(16.3±2.5)比较差异有统计学意义(P<0.05);裸鼠成瘤实验结果 显示,4个实验组在共20 d的观察中,SiHa/16E5组裸鼠成瘤明显快于其他3个对照组(P<0.05).结论 HPV16 E5可降低宫颈癌SiHa细胞中P21的表达,加强宫颈癌SiHa细胞增殖和成瘤效应.     

RNA干扰抑制环氧化酶-2表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的 建立以小分子干扰RNA(siRNA)抑制环氧化酶-2(COX-2)表达的宫颈癌HeLa细胞模型,探讨COX-2在肿瘤细胞增殖、凋亡方面的作用和可能机制.方法 构建靶向抑制COX-2的siRNA表达载体,转染HeLa细胞,Western blot法确定筛选的稳定表达siRNA的转化克隆COX-2表达受抑制;流式细胞仪检测RNA干扰(RNAi)抑制COX-2表达后细胞凋亡和细胞周期的变化;克隆形成试验检测细胞克隆形成率;RT-PCR及Western blot法检测ku70、ku80的表达变化.结果 获得稳定表达siRNA的转化细胞株(HeLa/COX-2i),其COX-2蛋白表达明显受抑制,而转入阴性对照质粒的细胞株(HeLa/Negi)COX-2蛋白表达不受影响;HeLa/COX-2i细胞的克隆形成率[(45±4)%]显著低于HeLa细胞[(85±7)%](P<0.01);HeLa,HeLa/Negi,HeLa/COX-2i 3株细胞的细胞周期分布以及细胞凋亡率差异无显著性意义;RT-PCR及Western blot显示RNAi抑制COX-2表达后ku70、ku80在转录和翻译水平均受抑制.结论 RNAi抑制COX-2表达后可抑制HeLa细胞增殖,其机制可能与ku70、ku80的表达下调有关.     

宫颈癌组织及细胞中环氧合酶-2的表达及其意义

目的: 研究宫颈癌组织及细胞株中环氧合酶-2(COX-2)蛋白及基因表达情况. 方法: 用免疫组化方法检测29例宫颈癌患者COX-2的表达水平,并以14例慢性宫颈炎症患者和18例正常宫颈上皮为对照组;用免疫细胞化学方法和原位分子杂交法检测宫颈癌细胞株SiHa和HeLa中COX-2蛋白及基因表达. 结果: ①宫颈癌患者COX-2表达阳性率为75.9%,高于慢性宫颈炎症患者和正常宫颈上皮组(P<0.01);②COX-2在不同宫颈癌FIGO(国际妇产科联盟)分期、病理分级中的表达水平不同,但这一差异无统计学意义(P>0.05);③COX-2在宫颈鳞癌及腺癌中均有表达,但两者相比无显著性差异(P>0.05),在腺鳞癌中未见COX-2表达;④COX-2在宫颈癌细胞株SiHa和HeLa中均有阳性表达,两者表达强度无明显差异;⑤在宫颈癌细胞株SiHa和HeLa中均可见到COX-2 mRNA呈阳性表达. 结论: 宫颈癌中COX-2的表达水平明显上调,其表达与宫颈癌的发生发展有关.     

NDRG2对乳腺癌细胞增殖的影响

目的：观察NDRG2（N—myc downstream regulated gene 2）对于乳腺癌细胞系增殖的影响．方法：采用脂质体转染法将NDRG2基因转入乳腺癌细胞系SK-BR-3,经G418筛选后获得稳定高表达NDRG2的亚克隆细胞系SK—BR-3／NDRG2-flag及仅转染载体的SK—BR-3／pcDNA3．1（＋）．应用Western Blot检测NDRG2在转染细胞中的表达;应用平板克隆形成试验、MTT、流式细胞仪检测转染前后细胞增殖能力的差异．结果：成功建立了稳定高表达NDRG2的亚克隆细胞系SK—BR-3／NDRG2-flag;NDRG2的高表达导致了乳腺癌细胞系增殖能力减弱（P〈0．01）：细朐周期阳滞存G0／G1期．结论：存乳腺痛细胞系SK—BR-3中,过表达NDRG2可有效抑制细胞增殖并导致细胞周期的阻滞．     

HIF-1对人宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响

目的观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在缺氧条件下对宫颈癌SiHa细胞的增殖、生长和凋亡的影响,探讨HIF-1α在宫颈癌的发展过程中所起的作用。方法将表达全长HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α和空质粒pcDNA3.1转染入SiHa细胞中,分别命名为fLHIF-1α组和pcDNA3.1组,未转染细胞组命名为未转染组。应用Western Blotting和免疫细胞化学法对细胞内的HIF-1α和VEGF表达量进行检测。应用MTT方法检测不同浓度的CoCl2处理后细胞的增殖情况;采用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞的凋亡情况。结果免疫细胞化学和Western Blotting结果显示重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α转染成功,转染细胞内HIF-1α及VEGF表达较未转染细胞和质粒pcDNA3.1转染细胞增高(P<0.05),显示在正常或缺氧条件下,fLHIF-1α组细胞的增殖能力均高于pcDNA3.1组和未转染组(P<0.05),凋亡率小于pcDNA3.1组和未转染组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论HIF-1α在CoCl2诱导的缺氧条件下可以抑制SiHa细胞的凋亡,减少缺氧对细胞的损伤以及促进细胞的增殖,提示HIF-1α在宫颈癌的发生发展中可能起着重要作用。     

DOC2抑制对宫颈癌SiHa细胞系的生长

目的:探讨卵巢癌缺失2(DOC2)基因对宫颈癌SiHa细胞系生长的抑制作用. 方法: 采用基因转染技术,将含有全长DOC2cDNA的真核重组表达质粒和空载体质粒(pcDNA3.1)转染到人宫颈癌SiHa细胞系(无DOC2基因的表达)中,了解其对细胞增殖能力及细胞周期的影响. 结果: 转染DOC2基因的宫颈癌细胞生长受到抑制(P《0.05),其在软琼脂克隆形成能力明显降低(P《0.05). DOC2有使G1期细胞比例增高、S期细胞比例下降的趋势,但SiHa细胞和SiHa-pcDNA3.1细胞之间无显著差异. 结论: DOC2基因能抑制宫颈癌细胞系的增殖.     

Expression and biological function of N-myc down-regulated gene 1 in human cervical cancer

The expression of N-myc down-regulated gene 1 (NDRG1) has previously been reported to be involved in the proliferation,differentiation,invasion and metastasis of cancer cells,but its role in cervical cancer is still unclear.This study aimed to investigate the expression of NDRG1gene in human cervical cancer and its effect on aggressive tumor behaviors.The NDRG1 expression in cervical tissues and cells was detected by RT-PCR.Specific expression plasmid pEGFP-N1-NDRG1-GFP was used to enhance the expression of NDRG1 in human cervical cancer cell lines.The mRNA and protein level of NDRG1 was assessed by RT-PCR and Western blotting,respectively.Its effects on cell proliferation,migration,invasion,cell cycle and apoptosis were detected by MTT,transwell migration assay and flow cytometry (FCM),respectively.The results showed that the expression of NDRG1 in cervical cancer tissues and cells was significantly lower than in normal cervical tissues (P<0.001).After transfection with pEGFP-N1-NDRG1-GFP,the mRNA and protein expression of NDRG1 was up-regulated in Siha cells,which suppressed cell proliferation (P<0.001),induced cell cycle arrest (P<0.05),reduced invasion and migration of Siha cells (P<0.05),but caused no cell apoptosis.Moreover,vascular endothelial growth factor (VEGF),a tumor-induced angiogenesis factor,was markedly reduced and E-cadherin,a cell adhesion molecule,was increased in the cells transfected with pEGFP-N1-NDRG1-GFP.It was concluded that up-regulated NDRG1 may play a role in the suppression of malignant cell growth,invasion and metastasis of human cervical cancer.     

Sox2对宫颈鳞癌细胞增殖能力影响的研究

目的 探讨干细胞转录因子Sox2对宫颈鳞癌细胞增殖能力的影响及其机制。方法 将质粒pIRES-EGFP-Sox2转染宫颈鳞癌SiHa细胞系,采用G418筛选构建稳定表达Sox2的SiHa细胞克隆(SiHa-Sox2),MTT法检测Sox2表达对宫颈鳞癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测细胞周期的变化;Western blot检测细胞周期相关蛋白CyclinD1表达变化。结果 pIRES-EGFP-Sox2转染SiHa细胞后（SiHa-Sox2组）,细胞Sox2基因和蛋白均高表达（P均Sox2组细胞增殖速度加快;细胞周期中S期细胞比例明显增加;Western blot检测CyclinD1表达上调（PSox2基因通过上调CyclinD1蛋白的表达加速细胞周期进程,促进宫颈鳞癌细胞的增殖,从而促进宫颈鳞癌的发生发展。     

双向调控FAT10表达对人宫颈癌SiHa细胞裸鼠移植瘤放射敏感度的影响

目的 经过临床病理学标本检测人宫颈癌组织FAT10蛋白异常高表达后,探讨上调和下调FAT10基因表达对宫颈癌细胞株SiHa细胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影响。方法 采用RT-PCR法检测30例宫颈癌及癌旁组织中FAT10 mRNA的表达水平,FAT10蛋白在人宫颈癌组织中的相对表达水平明显高于癌旁组织,且差异有统计学意义（P<0.05）。通过电穿孔法分别将FAT10 siRNA和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10转染宫颈癌SiHa细胞后,G418筛选得到稳定转染细胞系。转染48h后,荧光定量RT-PCR和Western blot法分别检测细胞中FAT10 mRNA和FAT10蛋白表达水平;CCK-8 检测细胞增殖,克隆形成实验观察上调和下调FAT10表达对宫颈癌细胞株SiHa的放射敏感度的影响;TUNEL法检测细胞凋亡影响;裸鼠移植瘤实验检测上调和下调FAT10表达联合X线照射对宫颈癌细胞的生长抑制作用。结果 FAT10蛋白在人宫颈癌组织中的相对表达水平明显高于癌旁组织,且差异有统计学意义（P<0.05）,FAT10下调组宫颈癌SiHa细胞内FAT10基因表达明显降低,FAT10上调组明显升高。FAT10下调组宫颈癌SiHa细胞放射敏感度升高,FAT10上调组宫颈癌SiHa细胞放射敏感度降低（P<0.05）。FAT10下调组宫颈癌SiHa细胞增殖被抑制,细胞凋亡率增加（P<0.05）;FAT10上调组SiHa细胞增殖能力明显增强,细胞凋亡率降低（P<0.05）,FAT10下调组裸鼠移植瘤平均体积明显小于对照组（P<0.05）;FAT10上调组的瘤体平均体积大于对照组（P<0.05）。20Gy γ射线照射后FAT10下调组瘤体平均体积较照射前明显减小（P<0.05）;而上调组裸鼠皮下种植瘤平均体积较照射前无明显变化（P>0.05）。结论 下调FAT10表达能抑制人宫颈癌SiHa细胞裸鼠移植瘤的生长,增强瘤体的放射敏感度,上调FAT10表达则使肿瘤辐射抗拒。     

dn HIF-1对宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的研究抑制性缺氧诱导因子-1α(dn HIF-1α)对人宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响,探讨HIF-1α在SiHa细胞的血管生成、缺氧保护、凋亡、增殖过程中的作用。方法将表达dn HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染入SiHa细胞,采用免疫细胞化学法和Western Blotting检测dn HIF-1α转染SiHa细胞后其HIF-1α与血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的变化;CoCl2化学缺氧法处理细胞,MTT法测定细胞增殖情况,原位缺口末端标记法检测细胞凋亡情况,同时与pcDNA3.1组和未转染组进行比较。结果重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染SiHa细胞后,其HIF-1α蛋白表达水平与其它两组相比差异无统计学意义,而VEGF蛋白表达水平有较明显的降低(P<0.05)。转染dn HIF-1α的细胞,常氧培养和CoCl2诱导的化学缺氧条件下其增殖能力均低于其他两组(P<0.05),CoCl2处理后细胞凋亡增加,与其他两组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论dn HIF-1α抑制SiHa细胞的增殖并促进CoCl2化学缺氧引起的细胞凋亡,同时能降低VEGF蛋白的表达。提示dn HIF-1α可望在宫颈癌治疗中发挥作用。