小鼠体外受精及其胚胎体外培养的比较研究

目的 通过比较不同品系小鼠体外受精情况以及不同培养液对C57BL/6J小鼠胚胎体外培养效果的实验,进一步完善小鼠体外受精和早期胚胎体外培养体系.方法 对C57BL/6J、DBA/2、FVB/NJ、BALB/c、KM、ICR及BARR Ⅱ小鼠进行超排和体外受精,并对C57BL/6J小鼠体外受精后的2-细胞胚胎用HTF、CZB、KSOM、M16、HECM五种培养液在相同条件下进行体外培养到囊胚,计算4-细胞～囊胚的发育率.结果 各品系小鼠平均排卵数为13.0～38.7个(P＜0.01),体外受精率为70.2%～92.8%(P＜0.05).不同培养液至4-细胞的发育率为60.3%～95.8%,其中KSOM的4-细胞发育率为95.8%,最适合2-细胞向4-细胞的发育.8-细胞发育率为52.8%～91.1%,桑椹胚发育率为40.6%～87.5%,囊胚发育率为5.1%～75.4%,各阶段胚胎发育率均差异显著.其中适合于金黄仓鼠桑椹胚、囊胚发育的HECM-2并不支持C57BL/6J囊胚的发育,其囊胚发育率只有5.1%,CZB最适合其囊胚的发育.结论 遗传背景是影响小鼠超排及体外受精效果的主要因素之一.葡萄糖的存在不利于克服2-细胞发育阻断,胚胎在8-细胞期以前,主要能源物质不是葡萄糖,直到桑椹胚后期,葡萄糖才是主要的能量物质.磷酸盐可引起胚胎发育阻断.氨基酸和EDTA有利于克服胚胎发育阻滞.     

胰岛素对ICR小鼠胚胎体外发育的影响

目的研究ICR小鼠胚胎体外培养时,添加胰岛素的作用、浓度及所需阶段．方法用添加不同浓度胰岛素的mKSOM培养基对小鼠胚胎进行体外培养及选择最适浓度对不同阶段鼠胚进行体外培养,观察囊胚发育率和囊胚细胞数的变化．结果所有添加胰岛素的浓度组,囊胚发育率均高于对照组,其中0．005μg／mL和0．05μg／mL浓度组囊胚细胞数显著高于对照组和其他各浓度组．2-细胞至4-细胞、4-细胞至桑椹胚前添加胰岛素囊胚率显著高于对照组和其他实验组．结论在ICR小鼠胚胎体外培养时添加胰岛素能够促进胚胎发育;胰岛素浓度增至μg／mL对在ICR小鼠胚胎无毒性作用;在ICR小鼠胚胎体外培养的适宜胰岛素浓度为0．005μG／mL和0．05μG／mL;2-细胞至4-细胞、4-细胞至桑椹胚前添加胰岛素更加重要．     

不同取卵时间对兔ICSI胚胎体外发育的影响

目的探讨不同取卵时间对兔ICSI胚胎体外发育的影响。方法采用Piezo操作系统对实验兔进行辅助体外受精。结果hCG注射后14、16、18h取卵，ICSI后的受精率分别为82.2％、75.9％和0.0％，对受精卵进行体外发育培养，桑椹胚的发育率分别为72.9％、70.0％、0.0％，囊胚的发育率分别为62.2％、53.3％、0.0％。14h和16h之间受精率、桑椹胚率、囊胚率差异不显著（P〉0.05），但是14h采卵比16h要好；18h和14h、16h之间差异显著（P〈0.05）。结论不同取卵时间影响实验兔的ICSI体外受精率及胚胎的体外发育率，hCG注射后14h取卵最有利于兔ICSI胚胎的发育。     

胰岛素对不同时期ICR小鼠胚胎体外发育的影响

目的研究胰岛素对不同时期小鼠胚胎体外发育的影响.方法收集1-细胞、2-细胞、4-细胞及桑椹胚期鼠胚,分别在含0（对照组）、0.005、0.05、0.5、5、10μg/mL胰岛素的KSOM中培养.结果在1-细胞及2-细胞阶段添加系列浓度时,0.005μg/mL及0.05μg/mL胰岛素组不仅提高囊胚率、孵化率,而且提高囊胚细胞数.4-细胞阶段添加系列浓度时0.05μg/ml胰岛素组能够提高囊胚率、孵化率以及囊胚细胞数;而至桑椹胚阶段再添加系列浓度胰岛素时,囊胚率、孵化率以及囊胚细胞数均无统计学意义（P〉0.05）.结论在ICR小鼠胚胎体外培养时适宜的胰岛素浓度为0.05μg/mL;桑椹胚之前添加胰岛素对小鼠胚胎发育是必要的.在一定发育阶段内,随着胚胎的生长对胰岛素的需求也相应增加.     

小鼠胚胎切割技术在人类辅助生殖中的应用研究

目的:探讨将胚胎切割方法尽早应用于临床。方法:应用显微切割刀和酶消化透明带显微玻璃针分割两种方法:对2、4、8细胞期和桑椹期的胚胎分割为二分胚;将2、4、8细胞期的胚胎切割成卵裂球;同时将2细胞期的胚胎连续2次分割培养;切割的二分胚和卵裂球在M16溶液中行胚胎体外培养,观察其发育情况,达囊胚期植入子宫。结果:小鼠2、4、8细胞期的切割成功率分别为98.0%、86.6%、77.2%、66.1%,发育率为61.5%、80%、84.8%、89.3%;小鼠2、4、8细胞期切成的卵裂球发育至桑椹胚的成功率随着细胞数的增多而减少。小鼠2细胞期卵裂球的全能性优于4、8细胞期卵裂球。各细胞期半胚的发育率明显好于卵裂球的发育率。连续有两次切割2细胞期的胚胎发育到桑椹胚为15%。发育到囊胚的8细胞期和桑椹胚期的半胚移入假孕母鼠体内妊娠率分别为33.3%和60%。结论:显微玻璃针在切割成功率及后期的细胞成活率上优于纤维切割刀的切割方法。     

乙醇对小鼠胚胎体外发育影响的研究

用含不同浓度乙醇的 Whitten氏培养液对小鼠 2细胞、4细胞、8细胞和桑椹期胚胎分别进行体外培养 ,研究乙醇对小鼠不同发育时期胚胎体外发育的影响。首先利用含 0 .0 1%、0 .5 %、1.0 %、1.5 %、2 .0 %、3.0 %、5 .0 %、10 .0 %乙醇的 Whitten氏培养液对 2细胞胚胎进行培养 ,观察研究小鼠 2细胞胚胎对培养液中乙醇浓度的耐受极限。然后再用含 1%和 3%乙醇的 Whit-ten氏培养液分别对小鼠 2细胞、4细胞、8细胞和桑椹期胚胎进行培养。结果 :含低浓度乙醇 (1%以下 )的培养液对外细胞胚胎和桑椹胚的囊胚形成有促进作用 ,而在 2细胞和 4细胞胚胎…     

表皮生长因子对小鼠早期胚胎体外发育影响的研究

目的：探讨表皮生长因子对小鼠植入前胚胎体外发育的影响。方法：用添加不同浓度EGF(epidermal growth factor)的CZB培养液对小鼠早胚进行体外培养，观察囊胚发育率和胚胎细胞数的变化。结果：HCG(human chorionic gonadotropin)注射后138h，0．1ng／ml EGF添加组扩张囊胚率、孵化囊胚率显著高于其他各组。100．0ng／ml EGF添加组扩张囊胚率和孵化囊胚率显著低于其余各组，且囊胚细胞死亡较多。结论：EGF通过刺激囊胚期细胞分化而促进胚胎体外发育。但高浓度EGF抑制胚胎体外发育并使早期胚胎受损。     

不同时期和不同来源鼠胚玻璃化冷冻效果的比较

目的：比较不同时期、不同来源的鼠胚玻璃化冷冻的存活率以及发育为囊胚的成功率。方法：采用体外受精和体内受精的方式得到小鼠的2、4、8细胞期胚胎,对其进行玻璃化冷冻、解冻,观察胚胎的存活与囊胚形成,以未冷冻的胚胎作为对照组。结果：由体外受精和体内受精获得的2细胞期胚胎在冷冻复苏后的存活率分别为70.67%、72.06%,囊胚形成率分别为65.33%、67.62%;4细胞期胚胎冷冻复苏后的存活率分别为88%、89.71%,囊胚形成率分别为81.33%、83.82%;8细胞期胚胎冷冻复苏后的存活率分别为93.33%、94.12%,囊胚形成率分别为92%、94.12%。和对照组相比,2细胞和4细胞期胚胎冷冻复苏后囊胚形成率差异有统计学意义（P＜0.05）,而8细胞期的胚胎差异无统计学意义（P>0.05）。不同时期胚胎冷冻复苏后囊胚形成率间差异有统计学意义（P＜0.05）,受精方式对处于同一时期的胚胎在冷冻复苏后存活率和囊胚形成率均无明显影响。 结论：玻璃化冷冻可以作为小鼠胚胎保存的有效方法,相对2、4细胞期胚胎,冷冻效果最好的是8细胞期胚胎。     

氨基酸浓度对昆明小鼠胚胎体外发育的影响

目的探讨培养液中氨基酸成分对植入前昆明小白鼠胚胎发育的影响,摸索植入前胚胎体外培养氨基酸的最佳浓度。方法从超排昆明小鼠输卵管中取出的630枚受精卵均分为7组,分别在经添加不同浓度Eagle's氨基酸的去牛血清白蛋白KSOM培养液(mKSOM、mKSOM 1/16AA、mKSOM 1/8AA、mKSOM 1/4AA、mKSOM 1/2AA、mKSOM AA、mKSOM 2AA)中培养,对比观察各组胚胎体外发育的过程。用卡方检验分析添加各浓度氨基酸的培养液培养效率的差别,并将8细胞发育率和囊胚发育率分别与相应的氨基酸浓度进行曲线拟合分析。结果与未添加氨基酸组对比,添加氨基酸组胚胎发育率高,8细胞胚和囊胚的形成率与培养液中氨基酸的浓度关系均符合三次模型,在氨基酸为1/2浓度时8细胞胚和囊胚的形成率均达到最高。结论氨基酸对胚胎的体外发育有促进作用,但含有高浓度氨基酸的培养液培养效果反而有所下降,可能是由于高浓度的氨基酸影响胚胎的代谢和渗透压的改变,且氨基酸分解及胚胎代谢所产生的铵对胚胎有毒性作用。     

氨基酸浓度对昆明小鼠胚胎体外发育的影响

目的探讨培养液中氨基酸成分对植入前昆明小白鼠胚胎发育的影响,摸索植入前胚胎体外培养氨基酸的最佳浓度.方法从超排昆明小鼠输卵管中取出的630枚受精卵均分为7组,分别在经添加不同浓度Eagle‘s氨基酸的去牛血清白蛋白KSOM培养液(mKSOM、mKSOM 1/16AA、mKSOM 1/8AA、mKSOM 1/4AA、mKSOM 1/2AA、mKSOM AA、mKSOM 2AA)中培养,对比观察各组胚胎体外发育的过程.用卡方检验分析添加各浓度氨基酸的培养液培养效率的差别,并将8细胞发育率和囊胚发育率分别与相应的氨基酸浓度进行曲线拟合分析.结果与未添加氨基酸组对比,添加氨基酸组胚胎发育率高,8细胞胚和囊胚的形成率与培养液中氨基酸的浓度关系均符合三次模型,在氨基酸为 1/2浓度时8细胞胚和囊胚的形成率均达到最高.结论氨基酸对胚胎的体外发育有促进作用,但含有高浓度氨基酸的培养液培养效果反而有所下降,可能是由于高浓度的氨基酸影响胚胎的代谢和渗透压的改变,且氨基酸分解及胚胎代谢所产生的铵对胚胎有毒性作用.     

猕猴胚胎干细胞的分离培养和鉴定

目的从体外培养成熟囊胚中分离并鉴定猕猴胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES cell).方法猕猴卵母细胞经体外成熟培养、体外受精和早期胚胎体外成熟培养后,获得猕猴囊胚.当囊胚由透明带自然孵出后,用细玻璃针剥离囊胚中的内细胞团(inner cell mass,ICM)并与饲养细胞进行共培养.由ICM分离,培养并鉴定胚胎干细胞集落.结果由4只FSH超排猕猴中共取得92个处于GV期的猕猴卵母细胞,选取其中的22个用HECM-10培养基培养后,获得6个高质量的囊胚,由此6个囊胚中分离得到3个内细胞团,并由此最终获得1株猕猴ES细胞,即RS5细胞.RS5细胞具高比例核/质比,核仁多,其细胞集落边缘平整,其内各单个细胞清晰.经约5个月的连续传代后,仍保持了正常二倍体的核型,其染色体数目为42条.碱性磷酸酶细胞组织化学染色为阳性,说明RS5细胞为未分化态的胚胎干细胞.经高密度和长时间培养后,RS5细胞可进一步分化为多种类型细胞.结论 RS5细胞株具有自我更新能力和多分化潜能,属于胚胎干细胞.     

KSOM培养基营养成分调整对小鼠植入前期胚体外发育的影响

目的囊胚发育率低和发育迟缓是继““2-细胞阻滞““解决后小鼠胚胎体外培养中面临的两大问题.本实验通过对 KSOM培养基营养成分的调整,观察对胚胎发育的影响,优化培养基的构成.方法采用微滴培养法培养昆明小鼠单细胞胚胎,以胚胎发育到囊胚的比例、孵出比例以及注射hCG后120 h囊胚全细胞数作为判断培养效果的标准,比较 KSOM在葡萄糖、牛血清白蛋白、氨基酸3种营养物质不同浓度下对小鼠植入前胚体外培养的效果.结果在未加氨基酸时葡萄糖、牛血清白蛋白的变化对注射hCG后120 h囊胚形成率、囊胚全细胞数影响不大,添加氨基酸后,囊胚发育速度提高,部分孵出和全部孵出比例提高,囊胚全细胞数增大明显,且葡萄糖、牛血清白蛋白与氨基酸对囊胚的发育有共同促进的作用.结论通过添加适量的氨基酸、葡萄糖、BSA改良KSOM培养基能很好的促进小鼠植入前胚体外发育.     

KSOM培养基营养成分调整对小鼠植入前期胚体外发育的影响

目的 囊胚发育率低和发育迟缓是继“2-细胞阻滞”解决后小鼠胚胎体外培养中面临的两大问题。本实验通过对KSOM培养基营养成分的调整,观察对胚胎发育的影响,优化培养基的构成。方法 采用微滴培养法培养昆明小鼠单细胞胚胎,以胚胎发育到囊胚的比例、孵出比例以及注射hCG后120h囊胚全细胞数作为判断培养效果的标准,比较KSOM在葡萄糖、牛血清白蛋白、氨基酸3种营养物质不同浓度下对小鼠植入前胚体外培养的效果。结果 在未加氨基酸时葡萄糖、牛血清白蛋白的变化对注射hCG后120h囊胚形成率、囊胚全细胞数影响不大,添加氨基酸后,囊胚发育速度提高,部分孵出和全部孵出比例提高,囊胚全细胞数增大明显,且葡萄糖、牛血清白蛋白与氨基酸对囊胚的发育有共同促进的作用。结论 通过添加适量的氨基酸、葡萄糖、BSA改良KSOM培养基能很好的促进小鼠植入前胚体外发育。     

非休眠期成年兔骨髓基质干细胞和脂肪基质干细胞用于核移植构建重组胚

目的研究非休眠期成年兔骨髓基质干细胞和脂肪基质干细胞作为供体,以体外成熟去核兔卵母细胞作为受体进行核移植构建重组胚胎的可行性及囊胚形成率. 方法首先利用新西兰兔骨髓和脂肪为来源分别培养骨髓基质干细胞和脂肪基质干细胞,然后用他们作为核供体,采用卵细胞胞质内直接注射法构建重组胚胎,7 d后比较囊胚形成率. 结果核移植操作后卵细胞存活率达80.0%,骨髓基质干细胞和脂肪基质干细胞作为供体重组胚胎囊胚形成率分别为88/522 (16.9%)和73/464 (15.7%), (P>0.05, Yates corrected). 结论处于非休眠期的成年兔骨髓基质干细胞和脂肪基质干细胞移植到去核卵母细胞后能够进行早期胚胎发育,两者囊胚形成率无明显差别.     

应用人黄素化颗粒细胞条件培养液行人类胚胎体外培养

目的 研究卵泡壁颗粒细胞条件培养液在人类胚胎体外发育中的作用。方法 将卵泡液中回收的卵泡壁颗粒细胞，分别置于添加0．1％聚乙烯醇(PVA)和添加10％胎牛血清(FCS)的TCM-199培养系统中进行体外培养。结果 在无蛋白培养系统中，颗粒细胞能够缓慢生长，第三～五天达到生长高峰，群体倍增时间发生在培养的第二～三天，培养第一～五天可分泌雌二醇到培养液中(3．22～4．65pmol／ml)。在有蛋白培养系统中，颗粒细胞生长速度明显高于无蛋白的培养系统。使用颗粒细胞条件培养液，获得的囊胚在囊胚腔的大小和细胞数量上，均优于商品化囊胚培养液。结论颗粒细胞条件培养液有利于人类4-细胞以后胚胎的发育。     

碳水化合物对牛体外受精胚胎体外发育的影响

目的　在SOF +PVA(合成输卵管液 +聚乙烯醇 )这一化学成分明确培养系统条件下 ,观察了葡萄糖、丙酮酸和乳酸三种碳水化合物对牛体外受精胚胎体外发育的影响 ,以便为今后进一步探讨影响牛早期胚胎体外发育的因素提供实验依据。方法　牛卵母细胞体外成熟和体外受精后 ,在化学成分明确培养系统内进行体外发育培养。结果　实验 1将牛体外受精卵培养于不含有葡萄糖的SOF +PVA培养系统中 ,培养 12 0h后分别移入含有 0、1 5 0、3 30、5 0 0mmol L的SOF +PVA培养系统中 ,对照组胚胎一直在含有 1 5 0mmol L葡萄糖的SOF +PVA中培养 ,结果囊胚的发育率分别为 9 2 % a、12 1%、19 2 % b、18 9%和 11 7% (a 相似文献   

小鼠类胚胎干细胞分离培养及用于制作嵌合体小鼠的实验研究

目的探讨分离小鼠囊胚内细胞群类胚胎干细胞及用于制作嵌合体小鼠的方法及应用价值。方法分离3.5d小鼠囊胚内细胞群的类胚胎干细胞作为供体细胞,通过显微注射方法将分离的类胚胎干细胞注射到供体小鼠的囊胚腔中,再将注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫中制作嵌合体小鼠。结果分离36枚囊胚的内细胞群类胚胎干细胞,注射256只昆明小鼠囊胚中,移植32只假孕雌鼠子宫中,获产崽2窝,共12只,其中2只获毛色嵌合体小鼠。结论采用该技术分离所获得的类胚胎干细胞作为供体细胞制作嵌合体小鼠获得成功,该方法为ES细胞介导的转基因动物制作增添了一条新的途径,在同种不同品系的动物改良及遗传病基因治疗中有一定的应用价值,尤其是对未能建立ES细胞系的大动物的遗传工程操作具有一定意义。     

山羊体外受精的研究

通过在山羊卵母细胞体外成熟培养液中添加不同的血清和不同浓度的卵泡液 ,在体外成熟培养液中培养不同的时间 ,以及采用不同的精子获能方法来摸索效率较高的体外受精方法体系。在山羊卵母细胞体外成熟培养液中添加FCS、EGS及不同浓度的卵泡液 ,成熟培养时间分别为 16、2 0、2 4和 2 7h ,山羊新鲜精液用钙离子载体法和肝素法进行获能处理后用于体外受精 ,比较其体外成熟率和体外受精率。添加FCS、EGS和 2 0 %卵泡液组的成熟率无显著差异 ,显著高于添加 10 %和 3 0 %卵泡液组的成熟率 ;但添加FCS和EGS组的受精率显著高于添加10 %、2 0 %、3 0 %卵泡液组的受精率。培养 2 4h组和 2 7h组的成熟率显著高于另外两组 ,而培养 2 7h组的受精率显著高于其余各组。用钙离子载体法处理的山羊精子的顶体反应率和体外受精率显著高于肝素法。EGS可以代替FCS添加于成熟培养液中 ,对COCs的成熟率和受精率没有明显的影响 ,但卵泡液不能完全代替FCS的作用。培养时间为 2 7h ,精子用钙离子载体法处理获能后能得到较高的体外受精率     

人外周血树突细胞的分离与提纯

目的 从人外周血中分离、培养及鉴定树突细胞（ＤＣ）。方法 从正常人外周血分离获得单个核细胞,培养２小时后,取会细胞,在无血清培养基中加入不同的细胞在子,于２的第１,６,８天对形态,表型和功能分擀行测定,并在光镜、电镜下观察ＤＣ的纯度与得率。结果 体外培养６～８天可获得高纯度大量的ＤＣ,较高表达ＨＬＡ ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８３和ＣＤ８６,能强烈激发同种慢体Ｔ淋巴细胞增殖。结论 上述方法可以从人外周血     

In vitro maturation of immature oocytes and IVF/ICSI in PCOS patients

In vitro maturation (IVM) programme has developed a culture technique for supporting the growth and maturation of immature oocytes since late of 1980s and has become important in ART methods. The establishment of an IVM programme can yield many advantages. Patients suffering from congenital or postnatal reproductive disorders, such as premature ovarian failure (POF) or polycystic ovarian syndrome (PCOS), can achieve pregnancies by transfer of viable embryos derived from IVM and in vitro fertilisation (IVF) systems. However, the pregnancy rate of IVM-IVF programme for PCO patients was still low. This disadvantage was caused by poor maturation of human immature oocytes and no synchronisation with implantation windows. Recently, application of FSH/hCG priming or optimal maturation medium for proper cytoplasmic maturation improves the success rate of IVM procedures. Indeed, increasing oocyte viability by employing optimised IVM system would also reduce ethical concerns about the disposal of retrieved oocytes with low developmental competence, and concerns about the abuse of the manipulation of human embryos.