肝脏持续过表达IL-15对NK/NKT细胞和T细胞数目和活化状态的影响

目的研究靶向肝脏过表达细胞因子IL-15对机体免疫系统的影响。方法构建IL-15重组表达质粒pLIVE-IL-15,采用高压注射的方式尾静脉注射C57BL/6小鼠,ELISA检测小鼠血清中IL-15的表达水平,流式检测小鼠脾脏和肝脏淋巴细胞亚群变化。结果成功构建pLIVE-IL-15质粒,pLIVE-IL-15质粒高压注射小鼠后血清中能检测到IL-15持续表达。与pLIVE-EGFP对照组相比,pLIVE-IL-15质粒注射鼠天然免疫系统NK细胞和NKT细胞以及获得性免疫系统的CD4+T细胞和CD8+T细胞数目均显著增加(P<0.05)。体内过表达IL-15促进NK细胞高表达CD69和IFN-γ,而NKT细胞活化状态改变不明显,IL-15能显著诱导CD8+T细胞高分泌IFN-γ(P<0.05),而对CD4+T细胞IFN-γ分泌影响较小。结论 pLIVE-IL-15靶向肝脏后能在体内持续表达,并且能调节天然免疫系统和获得性免疫系统反应。     

急性肝衰竭时外周血和肝组织中调节性T细胞表达变化的初探

目的 探讨调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）在急性肝衰竭外周血及肝脏中表达频数的变化。方法 选取10名急性肝衰竭患者及5名健康对照者,应用流式细胞术检测各组患者外周血中调节性T细胞表达频数的变化。将Balb/C小鼠采用数字表法随机分成急性肝衰竭1d、3d、7d组和正常对照组。模型组小鼠腹腔注射四氯化碳（carbon tetrachloride,CCL₄）矿物油1次,建立急性肝衰竭模型,对照组注射等量0.9%氯化钠注射液。生化法测定血清ALT、AST浓度,HE染色观察肝组织病理形态变化;流式细胞术分析外周血和肝组织中浸润的Tregs变化。结果 流式分析结果显示,与正常对照组相比,急性肝衰竭患者外周血Tregs表达下降（3.23±1.87 vs 6.08±1.45,P<0.05）。与对照组相比,急性肝衰竭1 d、3 d和7 d组小鼠外周血中Tregs 比例CD25⁺Foxp3⁺/CD4⁺与对照组相比呈下降趋势,而肝组织中Tregs 比例CD25⁺Foxp3⁺/CD4⁺呈升高趋势。结论 急性肝衰竭时患者和小鼠外周血中调节性T细胞呈下降趋势,而小鼠肝中浸润的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞呈升高趋势,Tregs可能与急性肝衰竭的发生有一定相关性。     

哮喘小鼠调节性T细胞与Th1/Th2因子失衡关系的实验研究

目的 研究哮喘小鼠外周血CD4+CD25+Treg细胞数量改变与血清Th1/Th2相关细胞因子IFN-γ和IL-4水平的关系,探讨其在支气管哮喘发病中的作用.方法 健康雌性BALB/c小鼠20只,随机分为2组(每组10只):①模型组于第0、7、14天予OVA/Al(OH)3腹腔注射,第21～26天每天以OVA雾化吸入激发.②对照组则以生理盐水(NS)在致敏阶段替代OVA 腹腔注射、激发阶段替代OVA雾化.第27天处死动物.观察小鼠肺组织病理改变,流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg细胞的变化,ELISA方法检测血清中IL-4、IFN-γ的含量变化.结果 模型组外周血CD4+CD25+Treg细胞的数值、占CD4+T细胞比例和血清IFN-γ水平较对照组降低(P<0.01);血清IL-4水平较对照组明显升高(P<0.01).结论 哮喘小鼠表现明显的Th1/Th2平衡失调、Th2细胞功能亢进,其机制与CD4+CD25+Treg细胞的抑制作用降低有关.     

Foxp3基因及调节性T细胞在重症肌无力被动转移幼鼠发病中的作用机制

目的探讨Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞、Foxp3mRNA在重症肌无力被动转移模型(passive transferred myasthenia gravis,PTMG)发病中的作用机制。方法将16只幼年雌性C57BL/6小鼠随机分为2组:模型组和对照组,模型组经腹腔注射含1.0mg/kgmAb35的Ringer's液0.2ml建立PTMG模型,正常对照组注射不含mAb35的Ringer's液0.2ml。采用流式细胞技术检测小鼠脾细胞中CD4+CD25+T细胞及Foxp3+CD4+CD25+Tregs含量,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-FQ-PCR)分析2组小鼠脾细胞中Foxp3mRNA的表达,ELISA法检测2组小鼠血清白介素-2和干扰素-γ的水平。结果①模型组小鼠脾细胞中CD4+CD25+T细胞与CD4+T细胞含量的比例与对照组比较有统计学差异[(8.82±0.74)%vs(9.89±0.88)%,P<0.05];模型组Foxp3+CD4+CD25+Tregs与CD4+CD25+T细胞含量的比例与对照组比较显著降低[(6.83±1.18)%vs(8.38±0.76)%,P<0.01];脾细胞...     

抑制CD96可促进NK细胞分泌IFN-γ并减轻小鼠肺部的衣原体感染

目的 通过调控CD96在C. muridarum肺炎小鼠体内的水平，探讨CD96调控NK细胞功能在衣原体肺部感染中的作用及可能机制。方法 选取雄性BALB/c小鼠45只，采用随机数字表法将小鼠分为Cm组、anti-CD96组及sham组，5只/组，进行3次独立重复实验。采用滴鼻吸入C. muridarum建立肺部感染模型，anti-CD96组：小鼠在感染基础上给予腹腔注射anti-CD96抗体（250 μg/只，每3 d给药1次）；Cm组：腹腔注射生理盐水；sham组：小鼠鼻吸入缓冲液。小鼠每日称重并绘制体质量曲线，造模5 d后，经颈椎脱臼法处死小鼠。采用荧光定量PCR与Western blot法检测CD96的表达；通过HE染色及病理评分评估小鼠肺炎症状；肺组织匀浆检测包涵体形成单位，评估肺部衣原体负荷；采用流式细胞术及ELISA等方法检测肺NK细胞产生IFN-γ的能力，以及NK细胞对巨噬细胞和Th1型细胞的免疫调节能力。结果 C. muridarum感染后第1、3、5天，采用磁珠分离各时间点以及Sham组小鼠肺NK细胞，结果显示NK细胞中CD96 mRNA表达显著降低（P<0.05），NK92细胞系经C. muridarum感染后6、12、24 h，CD96表达均明显下降（P<0.05）；Western blot验证anti-CD96抗体可有效中和小鼠肺组织中CD96表达（P<0.05），自感染后第3天开始anti-CD96组小鼠体质量下降程度较Cm组减轻（P<0.05），肺组织病理切片结果证实，anti-CD96组小鼠肺炎减轻。与Cm组相比，anti-CD96组小鼠肺部衣原体负荷降低（P<0.05）；Anti-CD96组小鼠肺组织中分泌IFN-γ的NK细胞（DX5+IFN-γ+）比例高于Cm组（P<0.05），与Cm组相比，anti-CD96组小鼠肺单个核细胞中IFN-γ的蛋白表达水平也显著升高（P< 0.05）。anti-CD96组与Cm组相比，NK细胞免疫调节作用也显著增强，小鼠肺脏中巨噬细胞比例增加（F4/80+，P<0.05），Th1应答增强（CD3+CD4+IFN-γ+，P<0.05）。结论 抑制CD96可减轻C. muridarum感染小鼠肺炎，可能与其增强NK细胞分泌IFN-γ能力及对固有和适应性免疫的调节作用有关。     

肝脏CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞在小鼠急、慢性肝损伤中的表达差异及意义

目的探究肝内CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞（regulatory T cell,Tregs）在急、慢性肝损伤中的表达差异及意义。方法使用四氯化碳（carbon tetrachloride,CCL4）一次或多次给予C57BL/6J小鼠腹腔注射,分别制备急性（24 h）和慢性肝损伤（6周）模型,对照组小鼠腹腔注射等体积0.9%氯化钠注射液。病理切片Masson染色观察不同模型小鼠肝内病理变化情况,运用流式细胞分析法和免疫荧光检测小鼠肝内Tregs的表达。Real-time PCR检测小鼠肝内Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、白细胞介素-1β（interloukin-1β,IL-1β）、IL-6、IL-10、转化生长因子-β（transforming growth factor,TGF-β）的表达。结果 Masson染色显示急性肝损伤小鼠的肝细胞大片坏死伴出血,慢性肝损伤小鼠肝脏假小叶形成,同时Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达增加。流式细胞分析显示Tregs在急性和慢性组小鼠肝脏表达都有升高,但在慢性组升高的幅度比急性组大（P〈0.01）,与免疫荧光结果一致。肝内抑制性细胞因子IL-10、TGF-β在慢性肝损伤组升高显著（P〈0.05）,而促炎因子IL-1β、IL-6在急性肝损伤组升高显著（P〈0.01）。结论肝内Tregs在急、慢性肝损伤中表达不同。在急性肝损伤中,尤其是急性肝损伤恢复期,Tregs部分增加,抑制炎性反应扩散,促进机体恢复;在慢性肝损伤中,Tregs表达显著增加,形成免疫耐受,抑制免疫清除,肝纤维化形成。     

γ干扰素联合白消安诱导建立小鼠重型再生障碍性贫血模型中调节性T细胞的变化

目的探讨γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)联合白消安诱导小鼠重型再生障碍性贫血(以下简称再障)模型中调节性T细胞的变化与人类再障是否相同。方法采用腹腔注射IFN-γ联合胃饲白消安的方法制作小鼠重型再障模型(n=10),选取正常小鼠为对照(n=10),比较两组小鼠外周血中调节性T细胞占CD4+细胞的比例的不同,比较两组小鼠外周血单个核细胞Foxp3、TNF-α基因mRNA的表达。结果 (1)IFN-γ与白消安的联合方案诱发小鼠再障模型,至给药结束后第10天,成功率高达100%,均为典型的重型再障模型。(2)模型组外周血中CD4+细胞比例(16.09±3.66)%、CD4+CD25+Foxp3+/CD4+细胞比例(3.36±0.90)%,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。(3)模型组小鼠外周血单个核细胞Foxp3 mRNA的表达较正常对照组低(0.66±0.03 vs 0.82±0.04,P<0.05),TNF-αmRNA的表达较正常对照组高(0.57±0.04 vs 0.38±0.03,P<0.05)。结论 IFN-γ联合白消安诱导的小鼠重型再障动物模型中调节性T细胞的变化与人类再障相同。     

复方保肝宁减轻小鼠肝纤维化的机制:抑制肝脏组织中的IDO1进而促进树突状细胞表型成熟

目的 观察中药复方保肝宁对肝纤维化模型小鼠的保护作用并探讨其作用机制。方法 本研究分为两部分,第1部分：按 0.6 mL/（kg·d）予以腹腔注射25% CCl4（CCl4∶橄榄油=1∶3）的方式诱导野生型小鼠建立肝纤维化病理模型,随机分为对照组、模型组、阳性对照组及保肝宁低、中、高浓度组,10只/组。造模给药8周后处死小鼠,取小鼠血清检测AST、ALT水平。另取肝组织做HE、天狼星红染色及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫组化染色并检测吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）的表达水平。流式细胞仪检测小鼠肝脏树突状细胞（DCs）及T细胞的数量和表型变化。第2部分：按3×1011 v.g/只尾静脉注射IDO1过表达腺相关病毒,取正常野生型小鼠随机分为腺相关病毒阴性对照（AAV9-NC）干预组、IDO1过表达腺相关病毒（AAV9-IDO1）干预组及高浓度保肝宁+IDO1过表达腺相关病毒联合干预组,6只/组。干预4周后,取肝组织做IDO1免疫组化染色并检测小鼠肝脏树突状细胞（DCs）及T细胞的表型变化。结果 与模型组比较,保肝宁高浓度组能有效降低肝纤维化小鼠血清中AST、ALT水平（P< 0.01）;改善肝组织病理损伤,减少肝纤维组织的形成及α-SMA和IDO1的沉淀（P<0.05）。保肝宁高浓度治疗组肝纤维化小鼠肝脏中CD11C+DCs、CD11C+CD80+DCs、CD11C+CD86+DCs、CD11C+CD40+ DCs、CD11C+MHCII+ DCs细胞和CD3+T、CD3+CD4+T细胞比例与模型组相比均呈不同程度的升高（P<0.05）。高浓度保肝宁干预后可显著降低IDO1过表达腺相关病毒干预小鼠肝脏中IDO1的表达水平及上调CD11C+CD40+ DCs、CD11C+MHCII+ DCs和CD3+CD4+T细胞比例（P<0.05）。结论 保肝宁对CCl4所致小鼠肝纤维化具有一定的治疗作用,其机制可能与降低肝组织中IDO1的表达水平继而促进肝脏中DCs表型成熟使DCs刺激T细胞增殖能力增强有关。     

益气养精小复方对Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能的影响

目的:探讨益气养精小复方对Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能的影响及其作用机制。方法:建立Lewis肺癌细胞C57小鼠皮下移植瘤模型,将造模后的荷瘤小鼠随机分为模型组、中药组、顺铂组和中药+顺铂组。模型组不予药物干预,中药组予益气养精小复方中药灌胃,顺铂组予顺铂腹腔注射,中药+顺铂组予顺铂腹腔注射配合益气养精小复方中药灌胃,连续灌胃给药14 d。比较各组荷瘤小鼠体内抑瘤作用;采用流式细胞术检测荷瘤小鼠外周血T细胞亚群和NK细胞水平;双抗体夹心ELISA法检测荷瘤小鼠血清IFN-γ及IL-10浓度。结果:中药组、顺铂组、中药+顺铂组平均瘤重均显著低于模型组(P0.05),而该3组之间差异无统计学意义(P0.05),该3组抑瘤率依次为37.75%、44.59%和45.47%。药物干预后,顺铂组的CD4+T细胞百分比、CD4+/CD8+比值及NK细胞水平均显著低于模型组(P0.05),其CD8+T细胞百分比显著高于模型组(P0.05);中药组的CD4+T细胞百分比、CD4+/CD8+比值及NK细胞水平均显著高于顺铂组(P0.05),而其CD8+T细胞百分比显著低于顺铂组(P0.05);中药+顺铂组的CD4+T细胞百分比、CD4+/CD8+比值及NK细胞水平均显著高于顺铂组(P0.05)且低于中药组(P0.05),其CD8+T细胞百分比显著高于中药组(P0.05)。中药组与中药+顺铂组血清IFN-γ浓度均显著高于模型组和顺铂组(P0.05),而IL-10浓度则显著低于模型组与顺铂组(P0.05)。结论:由生黄芪、黄精、灵芝组成的益气养精小复方能够有效升高小鼠CD4+T细胞百分比、CD4+/CD8+比值与NK细胞水平,正向调节IFN-γ浓度,降低CD8+T细胞百分比与IL-10浓度,进而协同发挥抑制肿瘤生长的作用。     

培养人肝细胞用于生物人工肝的初步研究

探讨培养人肝细胞与肝非实质细胞用于体外生物人工肝支持系统及其对暴发性肝衰竭进行支持治疗的可能性。方法：首先将由简易体外两步灌流法分离获取的肝细胞，肝非实质细胞进行限制贴壁条件下的混合培养。然后置空心纤维型生物反应器和辅助循环系统组成的ＥＢＬＳＳ，对无肝模型犬进行人工肝支持结果：分离所得成活率高达９４％以上的肝细胞，肝非实质细胞经定时反复旋转振荡后形成多细胞球形聚集体，浮航天工业部工保持良好的形态特     

肝脏NK/NKT细胞及其生物学意义

对天然杀伤细胞（NK cell）的研究近年受到高度关注。研究发现，肝脏NK/NKT细胞含量在机体天然免疫反应时可增加10倍，可能是机体最大的专职天然免疫的器官，对抵御病理、寄生菌、恶性转化细胞等的侵害具有十分重要的意义。本文就肝脏NK/NKT细胞的功能特点和生物学特性、当前的研究进展及热点问题以及进一步研究的思路和切入点作一述评。     

肝窦内皮细胞参与肝纤维化的机制

肝窦内皮细胞在肝纤维发生发展过程中具有重要作用.它主要通过表达相关细胞因子、介导肝脏炎症反应、活化星状细胞、参与细胞外基质的生成与降解、参与肝窦毛细血管化、调节肝脏血管等参与肝纤维化.本文就肝窦内皮细胞与肝纤维化的机制进行综述.     

肝干细胞研究进展

肝干细胞是具有自我更新能力和分化为成熟肝细胞与胆管上皮细胞的双向分化潜能的原始细胞.肝干细胞不仅参与了肝脏的稳态维持、损伤修复和肝再生,而且在肝脏疾病的细胞治疗、人工生物肝及肝导向基因治疗中有着巨大的应用潜能.本文对几种主要类型的肝干细胞及它们的来源、分子标志物等进行了综述.     

法尼酯X受体可下调肝细胞中肝型脂肪酸结合蛋白的表达

目的研究法尼酯X受体(farnesoid X receptor,FXR)对肝型脂肪酸结合蛋白(liver fatty acid-binding pro-tein,L-FABP)表达的影响。方法用终浓度为50、100μmol/L的鹅脱氧胆酸(chenodesoxycholic acid,CDCA)以及1、5μmol/L的GW4064分别处理人胚胎肝细胞LO2和人肝癌细胞株HepG2后,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测FXR特异靶基因小异二聚体配体(small heterodimer partner,SHP)和L-FABP mRNA表达,再用Western blot法检测L-FABP蛋白水平的变化。结果LO2和HepG2细胞经FXR特异性激动剂CDCA以及GW4064刺激后,细胞内的SHP mRNA水平均明显升高,表明FXR在这两种细胞中是有功能活性的;而L-FABP mRNA和蛋白水平显著下降(P<0.05)。结论激活后的FXR可抑制L-FABP的表达活性。     

内皮祖细胞与肝脏损伤修复

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）是一种能分化为成熟血管内皮细胞的祖细胞,参与出生后血管的再生以及受损内皮的修复过程。近年来,围绕以内皮祖细胞为种子细胞用于促进血管新生、维持内皮功能完整、参与心血管疾病与肿瘤治疗以及组织工程及基因治疗等展开了大量的研究。本文就内皮祖细胞参与肝脏的损伤修复研究进展作一综述。     

青蒿琥酯对大鼠肝Kupffer细胞分泌肝纤维化相关细胞因子的影响

目的探讨青蒿琥酯对大鼠肝巨噬(Kupffer)细胞分泌致炎细胞因子的影响。方法 CCl4皮下注射SD大鼠进行肝纤维化造模,Percoll密度梯度离心法分离纯化大鼠肝Kupffer细胞,ELISA检测不同浓度青蒿琥酯处理LPS刺激的大鼠肝Kupffer细胞分泌致炎细胞因子TNF-α、TGF-β1和IL-6的变化。结果造模12周后,模型组大鼠出现明显的肝纤维化,Percoll密度梯度离心纯化后的大鼠肝Kupffer细胞在LPS刺激后TNF-α、TGF-β1和IL-6的表达量在模型组较对照组显著增加(P<0.05)。0μmol/L、125μmol/L、175μmol/L、225μmol/L 4个浓度的青蒿琥酯处理后,模型组较对照组致炎细胞因子TNF-α、TGF-β1和IL-6的表达量显著下调,并且175μmol/L为最佳抑制浓度(P<0.05)。结论青蒿琥酯可以抑制大鼠肝Kupffer细胞分泌致炎细胞因子     

转基因骨髓源性肝干细胞移植对大鼠肝纤维化的影响

目的 探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSC)移植对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化的影响.方法 采用淤胆型肝损伤大鼠模型和含5%淤胆血清的培养液筛选和扩增BDLSC,使用RT-PCR方法检测培养2周时肝干细胞标志表达.体外将携带人uPA基因的腺病毒(AduPA)转染BDLSC并移植入CCl4诱导的肝纤维化大鼠体内,观察大鼠肝功能、胶原面积及病理组织学的变化.结果 病理条件培养液培养2周的骨髓细胞形成肝细胞样集落,并表达胚胎期肝干细胞特征性蛋白.体内研究显示,与模型组和BDLSC组相比,BDLSC-uPA组大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)及总胆红素(TBIL)水平均有不同程度的降低,凝血酶原时间(PT)时间缩短,白蛋白(ALB)水平升高,肝组织细胞外基质(ECM)水平及羟脯氨酸(Hyp)含量明显降低;肝组织结缔组织增生程度减轻,假小叶形成不明显,胶原面积明显减少.结论 uPA基因修饰BDLSC移植能有效抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维化,改善纤维化大鼠的肝功能,从而为转基因BDLSC移植治疗肝纤维化的临床应用提供理论依据和实践基础.