基于转录组测序揭示光质对刺五加实生苗基因表达的调控作用

目的 对刺五加Acanthopanax senticosus实生苗进行转录组测序,分析其响应不同光质调控的分子机制。方法 以生长60 d的刺五加实生苗为材料,设置不同光质处理组（LED-1、LED-2）和对照组[高压钠灯（high pressure sodium,HPS）],应用Illumina HiSeq^TM对其叶片进行转录组测序,对测序后的结果进行基因功能注释、差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）筛选和共表达网络分析。结果 转录组测序共获得126 252条Unigene。其中92 681条被注释,3个处理组中筛选出DEGs 7664个。基因本体（gene ontology,GO）富集结果表明,DEGs在代谢过程、刺激响应、细胞结构、催化活性等功能中得到显著富集。京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）途径富集分析表明,DEGs显著富集在植物激素传导、糖代谢、苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成。适度光质胁迫可以促进刺五加实生苗中苯丙素类化合物生物合成途径关键酶基因的表达,是促进刺五加有效成分累积的基础。结论 通过高通量转录组测序,揭示了不同光质对刺五加实生苗基因表达的调控特征,可为深入研究刺五加药效成分的生物合成机制及栽培中的光环境设置提供科学依据。     

金荞麦黄酮生物合成途径分析及关键酶基因鉴定

为了丰富金荞麦Fagopyrum dibotrys属植物的转录组数据,解析参与黄酮生物合成途径的关键酶基因,挖掘其功能基因,该研究利用BGISEQ-500测序平台对金荞麦的根状茎、根、花、叶和茎进行转录组测序,经过de novo从头组装转录本,共产生了205 619条unigenes, 132 372条获得7个公共数据库功能注释。其中81 327条unigenes比对注释到GO数据库,大部分unigenes注释在细胞过程、生物调控、结合和催化活性,86 922条unigenes富集在136个KEGG代谢途径,鉴定了82条unigenes参与编码黄酮类生物合成10个关键代谢酶。对金荞麦根状茎与根、花、叶和茎的差异表达基因(DEGs)进行分析,获得了27 962条共表达DEGs,有23 515条根状茎组织特异性表达DEGs富集132条KEGG代谢途径,而13条unigenes显著富集在黄酮和黄酮醇生物合成。此外,分析鉴定了3 427条unigenes参与编码60个转录因子(TFs)家族,有4条bHLH TFs富集在黄酮生物合成。该研究丰富了金荞麦属植物的转录组数据库,为植物黄酮生物合成关键酶的解析提供了参考,有助于从基因水平上进一步研究金荞麦黄酮生物合成关键酶的功能和调控机制。     

基于混合测序策略的两品种当归中类黄酮调控基因差异分析

目的 比较2个不同茎叶色当归品种岷归1号与岷归2号转录水平差异。方法 以2种颜色当归的新鲜叶片（带叶柄）和上端茎为材料,采用混合测序策略,应用全长转录组技术构建当归无参全长转录本文库,利用RNA-seq技术对两品种进行差异基因表达分析,再利用公共数据库对差异基因的生物学功能进行注释和精细分类,筛选调控当归茎叶色差异的主要候选基因。结果 当归转录本的测序结果良好,测序数据质量较高,当归全长转录本的34 528条序列在非冗余蛋白（NR）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、SwissProt及KOG数据库中分别注释到33 947、33 241、29 150和22 601条。对两品种当归差异表达基因（DEGs）进行精细分类,具有生物学功能和分子功能的705个DGEs可分为11类,主要富集在初级代谢（17.87%）、逆境响应（14.47%）、次级代谢（11.49%）等功能上,与颜色有关的差异表达基因主要集中在类黄酮生物合成途径上。结论 两品种当归茎叶颜色差异的主要原因可能与调控类黄酮的生物合成基因的表达差异有关,可为后续进行功能验证,进一步明确与当归主要药效成分之间的联系奠定基础。     

干旱胁迫下忍冬全基因组DNA甲基化和转录组分析

目的 分析干旱胁迫下忍冬Lonicera japonica全基因组DNA甲基化水平变化、模式以及与基因表达的关系,为进一步探究忍冬响应干旱胁迫的分子机制奠定基础。方法 采用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序法（whole-genome bisulfite sequencing,WGBS）,测定干旱胁迫下忍冬全基因组DNA甲基化水平,并联合转录组测序结果对差异甲基化基因相关的差异表达基因进行分析。结果 干旱胁迫下忍冬整体甲基化水平普遍上升;其中CG类型甲基化水平明显高于CHG或CHH甲基化类型;对不同干旱胁迫处理下的忍冬进行差异甲基化区域（differentially methylated regions,DMR）分析,发现1935、2158和1750个差异甲基化相关基因,基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析表明,显著富集的通路主要包括亚油酸代谢,氮代谢通路和次生代谢物的生物合成通路等。通过转录组测序技术,发现差异甲基化基因相关的差异表达基因主要富集于次生代谢产物合成相关通路,同时筛选出4个在干旱胁迫下基因表达量上升显著的忍冬MYB（Lonicera japonica MYB,LjMYB）LjMYB转录因子。结论 干旱胁迫下忍冬甲基化水平上升,推测DNA甲基化调控基因表达是干旱影响金银花有效成分生物合成的作用机制之一。     

岗梅转录组及其乌索烷型三萜皂苷生物合成相关酶基因的发掘

目的：发掘与岗梅乌索烷型三萜皂苷生物合成相关的酶基因。方法：利用Illumina 测序平台对岗梅根进行转录组测序,通过基因注释、同源分析、系统发生分析等生物信息学手段,发掘可能参与合成的单基因簇（Unigenes）。结果：在岗梅根转录组中发现了272 条与萜类生物合成相关的Unigenes。这其中包括72 条可能参与萜类生物合成上游途径的Unigenes,以及26 条可能与三萜合成途径下游母核合成、氧化和糖基化相关的Unigenes。对其中部分Unigenes 进行系统发生分析,进一步揭示了这些Unigenes 与同源基因间的进化关系。利用酵母表达系统,鉴定了两个香树酯醇合酶IaAS1 和IaAS2,其中IaAS1 为少数以α-香树脂醇为主要产物的香树酯醇合酶之一。结论：本文从岗梅根转录组数据库中发掘到一系列可能与岗 梅乌索烷型三萜皂苷生物合成相关的酶基因。对这些基因的进一步研究,有助于从分子水平揭示岗梅中乌索烷型三萜皂苷的生物合成途径。     

基于转录组数据对七叶树中三萜皂苷合成途径的研究

七叶树是七叶树科七叶树属高大乔木,集药用与观赏于一身。七叶树种子是其主要的药用部位,主要有效成分为齐墩果烷型三萜皂苷类化合物七叶皂苷。为了解七叶树三萜化合物生物合成的分子基础,该研究采用Illumina Hi Seq 2000高通量测序获得七叶树种子与花的转录组数据,并对其代谢途径相关基因进行挖掘;使用Trinity软件实现unigene的de novo拼接;并将转录组的测序结果运用KEGG数据库进行注释,从而预测七叶树三萜代谢的具体途径。结果显示七叶树转录组共有2个三萜代谢途径相关数据集,分别为萜类物质前体代谢途径(途径编号为ko00900)和倍半萜与三萜代谢途径(途径编号为ko00909),对应的基因分别有47,27条。进一步根据催化酶与活性产物的总结比较分析发现萜类物质前体代谢途径相关酶共有8种,三萜代谢途径相关酶有3种。该研究首次在七叶树中解析出5条与三萜环化酶对应的基因,它们可能参与β-香树精合成进而形成七叶皂苷。通过种子与花的转录组表达差异分析显示,ko00900和ko00909途径相关的差异基因有33个;相对于花器官,种子中有17个unigenes表达量上调,16个unigenes表达量下调。该研究运用qRT-PCR实验对SQE(Unigene25806),HMGS(Unigene36710),β-AS(Unigene33291) 3个差异显著的关键酶基因的表达进行了试验验证,实验结果qRT-PCR结果与转录组数据一致。该研究所发现的七叶树的三萜皂苷合成相关候选基因能对七叶树三萜代谢合成与调控方面提供理论依据。     

宁夏枸杞花药转录组分析及花药发育相关基因的筛选

目的 为了探知宁夏枸杞Lycium barbarum花药发育过程及挖掘花药发育相关基因。方法 以单双核花粉时期和成熟花粉时期的花药为研究材料,通过高通量Illumina HiSeq2500测序平台进行转录组分析。结果 组装共获得128 151条Unigene,将Unigene与NCBI的非冗余蛋白质数据库（non-redundant protein databasse,NR）、去冗余的蛋白序列数据库（Swiss prot protein database,Swiss-Prot）、基因本体数据库（gene ontology,GO）、直源同源群集数据库（clusters of orthologous groups,COG）、真核同源群数据库（euKaryotic orthologous groups,KOG）、基因功能和代谢途径数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）数据库比对,共有40 140条得到注释。在错误发现率（false discovery rate,FDR）＜0.05且差异倍数（fold change,FC）≥2的条件下,单双核花粉时期与成熟花粉时期的差异表达基因共有46个。KEGG注释发现有4个差异表达基因参与甘油酯代谢、亚油酸代谢、苯丙氨酸代谢和苯丙烷类生物合成4个途径中。富含亮氨酸重复蛋白、细胞周期蛋白、类受体蛋白激酶、E3泛素蛋白连接酶等11个差异表达基因参与了花药发育过程。随机选取其中5个差异表达基因进行qRT-PCR验证,表达结果与转录组数据基本一致,表明其数据真实可靠。结论 为进一步解释宁夏枸杞花药发育的相关分子机制奠定了基础,也为后续研究宁夏枸杞花药发育的生物学特征提供了有益的基因资源。     

鸢尾糖基转移酶ItUGT797基因的克隆与表达分析＊

目的 对川射干（Iris tectorum Maxim.）中可能参与黄酮类化合物生物合成的糖基转移酶基因ItUGT797展开初步研究，解析ItUGT797编码蛋白的各项生物信息指标并优化其原核表达体系。方法 提取鸢尾各组织部位的RNA并进行反转录获得cDNA文库，根据鸢尾转录组中ItUGT797基因序列设计基因特异性引物，通过同源克隆的方法构建pET-32a （+）-ItUGT797原核表达重组载体。使用各类生物信息学网站对测序后的ItUGT797序列进行理化性质、蛋白结构和进化关系等分析；实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）验证基因在各部位的表达情况；蛋白体外表达情况则使用大肠杆菌体系检测。结果 ItUGT797开放阅读框长度为1455 bp，编码蛋白分子量大小分别为53.80 kDa。ItUGT797在各组织中表达情况为花>叶>根茎。系统发育进化树表明，ItUGT797可能是具有7-O-糖基化活性的糖基转移酶。原核表达结果显示在诱导剂IPTG为0.1mM时，ItUGT797能够表达出较多的可溶性蛋白。结论 本研究成功从鸢尾中克隆了ItUGT797基因，并分析了其编码蛋白的特征，检测了基因在根茎、叶和花中的表达量，同时通过原核表达体系筛选出最适合该基因可溶性蛋白表达的诱导剂浓度，为后续探索其参与鸢尾中黄酮类成分生物合成的功能奠定理论基础。     

聚乙二醇模拟干旱胁迫下半夏茎段转录组分析

目的 通过分析30%聚乙二醇（PEG）模拟的干旱胁迫处理下半夏茎段转录组数据，挖掘响应干旱胁迫的相关基因，探索干旱胁迫下半夏发生"倒苗"的分子机制。方法 以干旱胁迫下半夏发生"倒苗"时的茎段作为研究材料，采用Illumina Hiseq 2500平台进行转录组双向测序，并对数据进行生物信息学相关分析。结果 共获得23.00 Gb clean data，对照组与干旱胁迫处理组分别获得37 467 952和39 903 362个clean reads，经Trinity软件组装获得100 274个uingenes。通过将组装所得unigenes分别与Nr、eggNOG、Pfam、Swiss-Prot、KOG、GO、KEGG、COG等数据库进行比对分析，41 132个unigenes获得功能注释。最终筛选得到差异表达基因4 052个，其中2 080个DEGs表达上调，1 972个DEGs表达下调。KEGG通路富集分析显示，差异表达基因主要集中在核糖体、碳代谢、淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号转导和氨基酸生物合成等过程；基因表达水平分析显示，半夏中编码植物激素代谢与信号转导、氧化还原相关酶、热激蛋白和液泡加工酶等基因在干旱胁迫处理后表达水平显著上升，多数编码水通道蛋白的DEGs表达水平下降。结论 通过对PEG模拟的干旱胁迫处理下半夏转录组测序结果进行分析，获得半夏水分代谢、激素代谢与信号转导、相关响应蛋白等候选基因，可为揭示干旱胁迫导致半夏"倒苗"的发生机制提供基因资源和理论依据。     

根皮苷对食管癌细胞系表达谱的影响

目的 研究根皮苷对食管癌细胞系表达谱的影响,探索根皮苷作用于食管癌细胞系的信号通路及其潜在功能。方法 使用根皮苷处理人食管癌KYSE450细胞,提取总RNA并建立测序文库,进行转录组测序;使用DESeq2程序鉴定差异表达基因,对差异表达基因进行基因本体（gene ontology,GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析;使用MCODE进行差异基因核心模块筛选,使用GEPIA数据库分析核心模块中的基因对食管癌生存的影响;使用TIMER在线分析根皮苷对食管癌组织免疫细胞浸润的影响。结果 转录组测序结果显示,根皮苷处理后的食管癌细胞具有4602个差异表达基因,其中2407个为上调基因,2195个为下调基因。通路富集分析显示,根皮苷对蛋白质加工、胰岛素抵抗、基因复制和细胞周期等信号通路产生影响。在差异表达基因核心模块中,E3泛素蛋白连接酶2（E3 ubiquitin ligase mind bomb 2,MIB2）高表达可降低食管癌患者的总体生存率;环指蛋白19B（ring finger protein 19B,RNF19B）、三重基序蛋白69（tripartite motif-containing protein 69,TRIM69）、泛素连接酶（ubiquitin conjugating enzyme,UBC）和克隆E3泛素连接酶（homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 2,HECTD2）的表达水平可影响食管癌癌组织的纯度以及免疫细胞浸润的类型。结论 根皮苷可影响食管癌细胞的转录谱,其差异表达基因主要集中在细胞生长相关的信号通路。     

款冬叶不同发育阶段的转录组学分析

目的比较不同生长时期款冬叶中苯丙素类成分生物合成相关基因的表达,推测苯丙素类成分的最佳合成积累时期,为款冬叶资源的合理利用提供科学依据。方法利用Illumina Hi Seq2500测序技术对不同时期的款冬叶进行转录组测序,获得转录组数据后进行基因功能注释等生物信息学分析,对苯丙素类生物合成相关基因在不同时期的表达进行比较。结果通过转录组测序技术获得46 793个Unigenes,平均长度为952.144 8 bp,其中有4 774个可以被NR、Swiss-Prot、eggNOG、GO、KEGG等公共数据库共同注释。对注释得到的Unigenes进行KEGG代谢通路分析,结果显示款冬叶转录组中有144条Unigenes参与萜类、黄酮类和苯丙素类生物合成,其中萜类65条,苯丙素类64条,黄酮类15条。进一步对参与苯丙素类生物合成相关基因进行动态比较,发现其关键酶PAL、4CL、HCT、CCoAOMT等在9月的表达量最高,即苯丙素类成分在9月的生物合成量可能最高。结论为苯丙素类成分的生物合成途径及调控分析奠定了基础,也为款冬叶资源的开发利用奠定了科学依据。     

基于高通量测序的人工培殖冬虫夏草僵虫颜色变化转录组分析

目的:探索人工培殖冬虫夏草Cordyceps sinensis(BerK.)Sacc.外观品质形成的分子基础。方法:以重庆和康定人工培殖冬虫夏草僵虫为材料,利用Illumina Hiseq 2500高通量测序技术进行转录组测序分析,基于差异倍数(FC)和错误发现率(FDR)筛选差异表达基因,具体筛选条件为|log2FC|>1、FDR<0.05。结果:共获得21942个转录本,利用DEGSeq筛选获得1575个差异表达基因,其中上调表达基因626个、下调表达基因949个;基因本体(GO)数据库和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析结果显示,这些差异表达基因主要集中于氨基酸代谢、折叠-分选-降解、糖代谢、转运和分解代谢、辅酶因子和微生物代谢等途径;筛选到66个颜色变化差异表达基因,包含46个氧化还原酶活性相关基因、12个过氧化物酶体相关基因、3个单加氧酶活性调节相关基因、3个黑化反应相关基因、2个活性氧代谢相关基因,其中tyr1、TYR基因可能是冬虫夏草僵虫颜色变化的关键功能基因。结论:利用高通量测序技术和生物信息分析获得了人工培殖冬虫夏草僵虫转录组信息特征,为阐明人工培殖冬虫夏草僵虫颜色变化的调控机制研究提供参考。     

基于转录组分析华细辛甲基丁香酚生物合成途径的相关基因

目的获得华细辛Asarum sieboldii转录组数据库和差异表达基因,识别华细辛甲基丁香酚生物合成相关基因。方法以华细辛地下部分(根)和地上部分(叶片)2个样本作为供试材料,采用Illumina Hiseq 4000进行转录组测序,并从头拼接,对Unigene进行功能注释和差异性分析。结果共获得12.25 Gb数据,拼接得到129 003个Unigene,可归类于52个GO分类,涉及363条KEGG代谢通路。分析发现,共有439个差异表达基因,其中上调基因占38.3%,下调基因占61.7%,差异较大;136个Unigene与苯丙素类次生代谢途径相关,其中44个Unigene参与甲基丁香酚的生物合成过程。结论本研究得到大量华细辛转录本信息,所发掘的与甲基丁香酚生物合成相关的Unigene为相关基因的分离、功能验证及其表达调控机制的阐明提供了重要依据。     

建泽泻鲨烯合酶原核表达、功能验证及其免疫检测研究

泽泻鲨烯合酶(Ao SS)催化法呢基焦磷酸[(farnesyl diphosphate,FPP)]合成鲨烯,是碳源流向原萜烷型三萜生物合成的关键调节酶。为深入研究Ao SS基因的功能及表达,课题组将前期克隆获得的建泽泻鲨烯合酶基因(accession No.JX866770)的开放阅读框(ORF)构建到原核表达载体p Czn1上,并在大肠杆菌BL21(Roseta)中进行诱导表达,诱导表达出的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经纯化获得高纯度的目的蛋白;以此目的蛋白进行体外酶促反应验证其功能,其结果显示该目的蛋白具有催化法呢基焦磷酸生成鲨烯的活性;为进一步研究其表达规律,在此基础上,利用该蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体并纯化,ELISA检测抗体效价大于1∶51 200,Western blotting检测表明其具有较好的特异性;用制备得到的抗体免疫检测建泽泻Ao SS在不同组织中的表达情况,结果显示建泽泻块茎中Ao SS表达最高,其次为叶,根中表达甚微。原核表达载体的成功构建、基因功能的进一步验证及快速免疫检测方法的建立,为进一步开展Ao SS基因功能及其调控的研究奠定基础,为泽泻资源性成分原萜烷型三萜的合成生物学应用提供科学依据。     

基于转录组测序揭示适度干旱胁迫对丹参基因表达的调控

目的对丹参进行转录组测序,分析丹参不同组织响应适度干旱胁迫的分子机制。方法以栽培4个月的丹参为材料,设置适度干旱胁迫组(土壤相对含水量55%～60%)和对照组(土壤相对含水量75%～80%),应用IlluminaHi Seq2000分别对根和叶进行转录组测序,对测序后的结果进行基因功能注释、差异表达基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)筛选和共表达网络分析等。结果转录组测序共获得58085条Unigene。其中28846条被注释,根和叶中的DEGs分别有1853、1457个。GO富集结果表明,丹参根和叶中的DEGs在GO功能部位中的分布基本一致,均在代谢过程、刺激响应、细胞结构、催化活性等功能中得到显著富集。KEGG途径富集分析表明,根中DEGs显著富集在DNA复制、植物激素信号转导、植物-病原菌相互作用、胡萝卜素合成等途径,叶中DEGs则主要富集在氨基酸、生物碱、苯丙烷类生物合成等途径。适度干旱胁迫能促进丹参叶中苯丙烷类、根中萜类化合物生物合成途径关键酶基因的表达,是促进丹参有效成分累积的基础。AP2/ERF、b HLH、b ZIP、WRKY、MYB类转录因子在根和叶中差异表达均较显著,基因共表达网络分析预测了在适度干旱胁迫下可能参与调控萜类基因表达的转录因子。结论通过高通量转录组测序,揭示了适度干旱胁迫对丹参不同组织基因表达的调控特征,可为深入研究丹参药效成分的生物合成机制和在栽培中的合理灌溉提供科学依据。     

夏枯草的转录组测序与次生代谢产物生物合成相关基因的挖掘

目的获得夏枯草转录组信息,探索夏枯草次生代谢产物生物合成的分子基础。方法利用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术对夏枯草果穗、茎和叶等部位进行转录组测序,经Trinity软件组装后获得Unigene,并进行系统的生物信息学分析。结果共获得77 863条Unigene,平均长度为716.72 nt。通过与NR、Swiss-Prot、COG等7个公共数据库进行BLAST比对,共有41 367个Unigene获得注释,注释率为53.13%。在KEGG数据库中,有1 406条Unigene被注释到次生代谢产物合成。通过对转录组数据深入挖掘发现,参与夏枯草三萜类骨架合成的Unigene共有60个,参与酚酸类合成的Unigene共有24个,参与次生代谢后修饰的Unigene共有259个,参与其他次生代谢合成的Unigene共有118个。结论夏枯草转录组数据为探索夏枯草次生代谢产物的生物合成机制提供了重要的资源,也为利用代谢工程增加夏枯草中重要次生代谢产物含量提供了基础信息。     

基于转录组测序的山茱萸次生代谢生物合成相关基因的挖掘

为探讨山茱萸中环烯醚萜等次生代谢产物合成的遗传基础,采用新一代高通量测序技术对其果实进行转录组测序,共获得得96 032条unigenes,平均长度590.53 bp;其中共有35 478条unigene能被NR,Swissprot,COG,GO,KOG,Pfam和KEGG等7个公共数据库注释。通过对注释所得的unigene进行KEGG代谢通路的分析发现,共有84个unigene与环烯醚萜类成分的生物合成有关;487条unigene参与山茱萸其他次生代谢相关物质代谢调控。研究发现,共有153条unigene参与山茱萸次生代谢产物的氧化/羟基化;72条unigene参与次生代谢产物的糖基化。该研究首次对山茱萸转录组进行了分析,并获得了山茱萸环烯醚萜类等次生代谢生物合成相关的候选基因,为山茱萸的分子生物学研究提供了丰富的数据资源,也为后续探讨候选基因的功能奠定了基础。