三叶青根与茎叶转录组和差异性表达分析

目的采用Illumina Hi Seq 4000测序技术获得三叶青转录组数据,为三叶青分子生物学研究提供重要分子信息。方法以三叶青根和茎叶为材料,进行转录组测序,对测试数据进行基因功能注释、代谢途径及微卫星等的生物信息学分析。结果共获得24.13 Gb Clean Data,拼接组装得到84 433条Unigene,与7个基因数据库进行比对,最终获得47 766个有注释信息的Unigene。在GO数据库中注释27 790条,其根和茎叶的差异表达基因数目为4989个,其中上调为3511个,下调为1478个;COG数据库得到16 152条三叶青Unigene的同源序列,共分为25个类别;在KEGG数据库有14 511条Unigene获得对应的Ko编号,可分为130个信号代谢分支,其中核糖体合成途径的Unigene数量最多,有1042条,而异黄酮的生物合成途径只有1条Unigene。结论对三叶青转录组进行拼接、组装和功能注释得到大量转录本信息,为三叶青分子生物学研究提供基因组数据库资源。     

茉莉酸甲酯诱导下远志幼苗转录组分析及三萜类生物合成途径关键酶基因挖掘

目的获得远志Polygala tenuifolia响应茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)处理的转录组学信息,挖掘远志三萜类化合物骨架生物合成的关键酶基因。方法以生长30 d的远志组培苗为材料,分别用无菌水(CK)、50μmol/L MeJA、100μmol/LMeJA处理24h,采用Illunima Hiseq~(TM)2000 150PE进行转录组测序,使用Trinity软件完成Unigene的denovo拼接,基于BLAST实现Unigene的分类、功能注释、代谢通路分析、蛋白功能注释、差异基因分析和筛选等。结果最终获得52.19 Gb数据,通过de novo拼接注释得到Unigene 54 426条,平均长度为1 604 bp,注释成功率100%。通过对MeJA处理前后基因进行差异分析,共筛选出差异基因3 390个,其中有1 287个上调,2 103个下调,且以100μmol/L MeJA处理的差异基因总数及上调数最高。KEGG富集分析表明,差异基因主要富集于苯丙烷类生物合成、半胱氨酸与蛋氨酸代谢、淀粉蔗糖代谢、光合生物的固碳作用、萜类骨架生物合成等KEGG通路中。找到与远志三萜类骨架生物合成相关的基因59条,其中AACT、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、DXS、IDI、FPPS、SQS、SE和β-AS受MeJA诱导后表达量上调。结论对MeJA处理后的远志幼苗转录组进行分析,获得远志三萜类骨架生物合成相关的候选基因,MeJA可以诱导其三萜类骨架合成相关基因的表达,为远志的分子生物学研究提供了丰富的数据资源,也为后期开展远志三萜皂苷类化合物次生代谢途径解析奠定了基础。     

药用植物冬凌草高通量转录组测序与分析

目的:得到冬凌草高通量转录组数据,为挖掘冬凌草二萜类生物合成途径关键基因,研究冬凌草ESTSSR分子标记提供数据来源。方法:利用Illumina Hi Seq 4000高通量测序技术,采用Trinity的方法从头组装、序列拼接和去冗余处理;基于BLAST完成Unigene编码蛋白NR功能注释、GO分类、KEGG代谢通路注释和分类、功能基因挖掘,SSR分子标记挖掘。结果:获得冬凌草叶与茎两种不同组织共12 GB转录组数据,得到3 7961个Unigene基因,平均长度1063 bp;得到冬凌草叶和茎转录组有60条unigenes参与萜类化合物骨架合成、6条unigene参与各种萜类化合物合成,有26条unigene参与二萜化合物合成途径,叶与茎两种组织中有差异表达的基因4565个,其中在茎中表达较高的为1668个,在叶中表达较高的有2697个,与二萜类化合物合成相关的差异表达基因有15个。结论:本研究为冬凌草二萜化合物生物合成途径中关键基因的挖掘和分子育种提供了数据信息,为深入研究冬凌草中冬凌草甲素等有效成分的生物合成途径及其调控机制提供基础。     

大青转录组测序及生物信息学分析

【目的】 利用高通量测序技术获得大青的转录组信息特征。【方法】 通过高通量测序平台Illumina HiSeqTM 2500 对大青进行转录组测序,采用Trinity软件de novo组装获得Unigene,并基于序列同源性对Unigene 进行功能注释,得到大青转录组的遗传信息。【结果】 测序数据经过质控后共获得26 394 223个高质量的Reads,通过de novo组装获得100 191个Unigene,N50长度为1 055 bp,平均长度724.4 bp。其中59 690个（59.58%）Unigene 在NR、SwissProt、KOG、GO、KEGG数据库中均得到注释。其中KEGG数据库注释到38 260个Unigene,涉及136条代谢通路。在大青转录组中共鉴定到407个Unigene参与萜类化合物的生物合成,165个Unigene 涉及类黄酮生物合成,29个Unigene参与黄酮和黄酮醇生物合成,37个Unigene参与异黄酮生物合成,同时,还鉴定到210类转录因子。MISA分析发现6 680个Unigene 包含8 640个简单重复序列。【结论】 利用高通量测序技术和生物信息分析获得了大青的转录组信息特征,这些数据可为后期开展功能基因鉴定、解析黄酮类化合物次生代谢途径及其调控机制奠定研究基础。     

基于比较转录组的夏枯草组织差异表达分析

目的分析夏枯草Prunella vulgaris果穗、茎、叶片转录组,挖掘夏枯草次生代谢产物生物合成的功能及调节基因。方法利用Illumina高通量测序技术对夏枯草不同组织进行转录组测序,并从差异表达的基因中鉴定次生代谢物生物合成的相关酶基因。结果在夏枯草的3个不同组织的转录本中,共有8 270个Unigenes在至少2个样品间差异显著。对不同组织差异表达的基因进行KEGG富集分析,结果表明,不同组织中苯丙素类生物合成的基因表达均有较大的变化。在夏枯草差异基因中分别搜索三萜类和酚酸类生物合成途径的关键酶,共鉴定到31个三萜类生物合成相关的Unigene,16个酚酸类生物合成相关的Unigenes,113个P450相关的Unigenes。结论本研究为后续发掘夏枯草次生物质代谢合成途径相关功能基因提供依据,也为夏枯草次生代谢物的生物合成调控研究奠定基础。     

茜草转录组分析及其蒽醌类化合物合成相关基因的挖掘

目的获得茜草Rubia cordifolia转录组学信息及挖掘其蒽醌类化合物生物合成的关键酶基因,为茜草的功能基因克隆与分析提供参考。方法采用Illunima Hiseq TM 2000 150PE高通量测序技术对茜草进行转录组测序,使用Trinity软件完成Unigene的de novo拼接,基于BLAST实现Unigene的分类、功能注释、代谢通路分析和蛋白功能注释等。结果最终获得7.3 Gb数据,通过de novo拼接注释得到Unigene 66 646条,平均长度为1 424 bp,所有Unigene能被NCBI nonredundant protein sequences(NR)、NCBI nucleotide sequences(NT)、kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)、A manually annotated and reviewed protein sequence database(Swissprot)、gene ontology(GO)、eu Karyotic ortholog groups(KOG)和protein family(Pfam)数据库所注释,注释成功率100%,找到与茜草蒽醌类化合物生物合成相关的基因64条。结论首次对茜草转录组进行了分析,并获得了茜草蒽醌类化合物生物合成相关的候选基因,为茜草的分子生物学研究提供了丰富的数据资源,也为后期开展茜草蒽醌类化合物次生代谢途径解析奠定了基础。     

刺五加转录组和差异性表达分析

目的获得刺五加Eleutherococcus senticosus转录组数据库和差异表达基因。方法采用皂苷高含量组和低含量组2个样本作为受试材料,采用二代测序方法中的Illumina Hi Seq 4000进行转录组测序,并进行系统的生物信息学分析。结果共获得8.34 Gb数据,拼接得到77 087条Unigenes,与5个基因数据库进行比对,可归类于55个Geneontology(GO)分类中,涉及到116个KEGG标准代谢通路。通过差异性分析发现,差异性表达基因共530条,其中上调基因占42.08%,下调基因占57.92%,相差较大。进行GO和Pathway富集,得到408个GO注释和40个代谢通路。结论对刺五加转录组进行拼接、组装和功能注释,得到大量转录本信息,为刺五加分子生物学研究提供了宝贵的基因组数据库资源。     

基于转录组测序的牛蒡木质素类物质生物合成途径及关键酶基因分析

目的获得牛蒡Arctiumlappa根功能基因数据库,分析其木质素类化合物生物合成途径及关键酶基因。方法以牛蒡根为研究对象,利用华大基因BGISEQ-500测序平台进行转录组测序,通过从头组装获得Unigene,利用各种已有的核酸和蛋白质数据库对Unigene进行注释和分类,利用KEGG代谢途径分析木质素生物合成途径及其关键酶基因,利用三维同源建模分析苯丙氨酸解氨酶(AlPAL)的结构特点。结果通过转录组测序共获得54 215个Unigene,其中42 003个Unigene被任一数据库注释,1 668个Unigene被注释到54个转录因子家族中;KEGG途径分析鉴定了423个Unigene参与了木质素的生物合成。AlPAL空间结构模型显示其为同型四聚体,每个单体由3个结构域组成,包括4-甲基-咪唑-5-酮(MIO)结构域、核心结构域和屏蔽结构域,其中MIO结构域包含保守的三肽ASG,构成AlPAL酶的催化活性中心。结论对牛蒡根转录组进行分析,为牛蒡功能基因鉴定、次生代谢途径解析及其调控机制研究奠定了实验基础。     

多穗柯转录组分析及黄酮类化合物合成相关基因的挖掘

多穗柯具有甜味和保健功效,其中黄酮类化物是主要活性物质。为获取多穗柯转录组数据库以及黄酮类化合物生物合成相关基因,该研究用RNA-Seq中的Illumina Hi Seq 4000对多穗柯嫩叶进行转录组测序,共获得6 Gb数据,拼接后得到41 043条Unigene,与7个基因数据库进行比对,可归类于51个GO分类中,涉及到237个KEGG标准代谢通路。找到黄酮合成相关基因28条。通过Micro Satallite(MISA)软件分析筛选到18 161个SSR,其中单碱基重复最丰富,有7 346个。此研究得到大量转录本信息,为多穗柯的分子生物学研究提供了宝贵的转录组数据库资源。     

赶黄草的转录组测序及分析

目的获得赶黄草Penthorum chinense转录基因参考序列和表达量信息,探索赶黄草药用活性成分生物合成的遗传基础,为赶黄草的重要功能基因研究提供参考。方法采用Illumina Hi Seq 2000高通量测序技术,对赶黄草进行转录组测序,对获得的数据进行过滤组装,对得到的unigene进行比对注释,同时对本研究获得赶黄草活性成分合成相关代谢通路基因进行分析。结果共获得了40 005 442条有效的短读序,通过de novo拼接得到42 306个unigene,开放阅读框(ORF)分析共计得到518个ORF,其中75个ORF具有转录因子结构域。通过KEGG分析,检测到33、32、59、68个unigene分别参与黄酮类生物合成、固醇类生物合成、萜类骨架生物合成和羧酸代谢。结论本研究发现的这些基因对赶黄草遗传改良和药用活性物质的生物合成路径相关基因研究有着重要意义。     

苗药八爪金龙转录组测序与次生代谢产物合成相关基因的挖掘

目的对八爪金龙根进行转录组测序,挖掘次生代谢合成相关基因,探索八爪金龙次生代谢产物生物合成的分子基础。方法采用IlluminaHi Seq4000高通量测序技术,对八爪金龙根进行转录组测序。使用Trinity软件对获得的Unigenes数据进行过滤组装,运用KEGG数据库对Unigenes进行注释。结果共获得52249条Unigenes,其中31391条被公共数据库成功注释,1507条Unigenes被注释到次生代谢产物合成。通过对转录组数据深入挖掘发现,参与八爪金龙苯丙素生物合成的Unigenes共有126条,参与萜类化合物骨架生物合成的Unigenes数量为73条,参与黄酮类化合物生物合成Unigenes有58条,参与次生代谢后修饰的Unigenes共有253条。筛选出9条Unigenes编码4个与八爪金龙香豆素生物合成的关键酶,23条Unigenes编码8个与黄酮生物合成的关键酶,39条Unigenes编码19个与萜类生物合成的关键酶,140条CYP450基因和113条UGT基因可能参与次生代谢物的修饰。微卫星识别软件(microsatellite identification tool,MISA)分析发现八爪金龙转录组包含17 400个简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)。结论通过高通量转录组测序,初步揭示了参与八爪金龙次生代谢产物合成相关的基因,为进一步研究八爪金龙次生代谢产物合成途径关键酶的功能及其调控机制奠定了基础。     

夏枯草的转录组测序与次生代谢产物生物合成相关基因的挖掘

目的获得夏枯草转录组信息,探索夏枯草次生代谢产物生物合成的分子基础。方法利用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术对夏枯草果穗、茎和叶等部位进行转录组测序,经Trinity软件组装后获得Unigene,并进行系统的生物信息学分析。结果共获得77 863条Unigene,平均长度为716.72 nt。通过与NR、Swiss-Prot、COG等7个公共数据库进行BLAST比对,共有41 367个Unigene获得注释,注释率为53.13%。在KEGG数据库中,有1 406条Unigene被注释到次生代谢产物合成。通过对转录组数据深入挖掘发现,参与夏枯草三萜类骨架合成的Unigene共有60个,参与酚酸类合成的Unigene共有24个,参与次生代谢后修饰的Unigene共有259个,参与其他次生代谢合成的Unigene共有118个。结论夏枯草转录组数据为探索夏枯草次生代谢产物的生物合成机制提供了重要的资源,也为利用代谢工程增加夏枯草中重要次生代谢产物含量提供了基础信息。     

利用转录组分析款冬萜类化合物生物合成关键酶基因及表达特征

目的挖掘与款冬萜类化合物生物合成途径相关的关键酶基因。方法利用Illumina HiSeq2500测序平台对野生款冬花蕾和叶进行转录组测序,使用Trinity软件de novo从头组装,并通过基因功能注释、差异表达基因分析等生物信息学方法进行分析,挖掘款冬中萜类化合物生物合成途径相关的酶基因。结果转录组测序获得39 912 371条高质量reads(SRA号:SRR9113366,SRR9113367),组装获得91 118条Unigene,55 830条Unigene在NR、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG等数据库得到注释。鉴定出参与款冬萜类化合物生物合成相关酶基因的129个Unigene,包括91个参与三萜骨架生物合成酶基因,32个萜类合成酶基因,6个细胞色素P450基因,其中差异表达基因25个,涉及上游MVA途径的4个差异基因在花蕾中表达量高于叶,MEP途径的5个差异基因在叶中表达高于花蕾,另外还有10个基因在叶中高表达,9个基因在花蕾中高表达。根据差异基因HMGR、TPS、AS、CYP450基因在花蕾中高表达,推测可能与花蕾中萜类物质含量高有关。结论从款冬转录组数据库中初步获得了可能参与萜类化合物生物合成途径的候选关键酶基因,为进一步阐明款冬萜类化合物生物合成的分子机制奠定基础。     

杜仲愈伤组织转录组分析及其类黄酮合成相关基因的qRT-PCR分析

目的分析光、暗培养的杜仲愈伤组织转录组测序结果,验证杜仲愈伤组织转录组测序结果中与类黄酮合成相关基因的表达水平。方法利用Illumina Hi SeqTM 2500测序平台对光暗培养的2种杜仲愈伤组织进行转录组高通量测序,利用Trinity软件对测序结果进行De novo组装,使用BLAST软件将Unigenes序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG、Pfam等数据库比对,利用FPKM值估算基因表达丰度,利用qRT-PCR验证与类黄酮合成相关基因的表达水平。结果杜仲愈伤组织转录组测序共获得13.00 Gbp的clean data。De novo组装后共获得62 030条Unigenes,平均长度为736.40 bp。使用BLAST软件将Unigenes序列与相关数据库比对,共获得25 417条Unigenes的注释结果。其中,25 167条Unigenes注释到Nr。4 794条Unigenes和它们相关的酶(enzyme commission numbers)注释到82条KEGG通路。共获得差异表达基因1 986条。在白光(光强为12 000 lx,16 h光照,8 h黑暗)培养的愈伤组织中,有1 139条基因表达上调,847条基因表达下调。在KEGG富集分析中发现,有7个Unigenes与类黄酮合成相关,其中有6个Unigenes在白光培养的杜仲愈伤组织中上调表达,它们编码的酶分别为查耳酮异构酶(EC 5.5.1.6,chalcone isomerase,CHI),查耳酮合成酶(EC 2.3.1.74,chalcome synthase,CHS),类黄酮3′-羟化酶(EC 1.14.13.21,flavonoid3′-monooxygenase,F3’H),反肉桂酸4-单加氧酶(EC 1.14.13.11,trans-cinnamate 4-monooxygenase,CYP),黄酮醇合成酶(EC 1.14.11.23,flavonol synthase,FLS),莽草酸邻羟基肉桂转移酶(EC 2.3.1.133,shikimate-O-hydroxycinnamoyl transferase,HQT)。1个Unigene下调表达,它编码的酶为无色花青素加氧酶(EC 1.14.11.19,leucocyanidin oxygenase,LDOX)。qRT-PCR分析表明,与类黄酮合成相关的7个Unigenes的表达情况与转录组测序分析结果是一致的。结论白光条件(光强为12 000 lx,16 h光照,8 h黑暗)可以促进类黄酮代谢途径中相关化合物的积累。     

基于高通量测序的不同生态环境东方泽泻块茎转录组分析

目的 探索不同生态环境对东方泽泻生理活动及其药效成分原萜烷型三萜生物合成调控的分子基础。方法 通过Illumina HiSeq测序平台获取种植于福建和四川的东方泽泻块茎转录组数据并进行功能注释,基于|log₂FC|>0.58（FC为差异倍数）、P<0.05的筛选条件获得差异表达基因。结果 转录组测序共获得50 652条unigenes,有22 689条unigenes注释到京都基因与基因组百科全书（KEGG）、NR、SwissProt、COG、基因本体（GO）和Pfam数据库。从福建和四川2种环境生长的东方泽泻之间筛选到3878条差异表达基因,其中2082条在福建东方泽泻中上调表达,1796条在四川东方泽泻中上调表达,差异基因主要参与植物防御反应、光合作用、淀粉和蔗糖代谢、萜类生物合成等生理活动,包括5个原萜烷型三萜生物合成通路上的关键酶基因。此外,东方泽泻移栽四川后,与三萜生物合成相关的转录因子和细胞色素P450（CYP450）基因表达也发生了显著变化。结论 利用高通量测序技术和生物信息分析获得了不同生态环境下东方泽泻转录组信息特征,为阐明生态环境对东方泽泻原萜烷型三萜生物合成的调控机制提供参考。     

乌头萜类生物合成代谢的转录组学分析

目的:对乌头的6个器官组织,主根、侧根、茎、叶、花、果实进行转录组测序分析,以研究参与其萜类次级代谢生物合成相关基因的表达谱,挖掘其功能基因。方法:采用Illumina Hi Seq 2500平台测序、组装得unigenes,与公共数据库NR,Swiss-Prot,GO,COG,KOG,KEGG比对、注释以获得差异基因,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)验证参与萜类次级代谢生物合成的关键基因。结果:本研究共获得156 967 635条Clean Reads(28 254 174 300 bp),经序列合并拼接后获得103 337个unigenes,通过核苷酸和蛋白序列等方面的同源性分析,表明其中37.31%(38 554个unigenes)与其他生物的已知基因具有不同程度的同源性,通过功能分类研究和代谢途径分析(KEGG)获得参与萜类合成158个unigenes(编码5个关键酶)。结论:这些发现的基因将为乌头萜类化合物的生物合成途径及分子机制提供基础数据。